陳永祥，王明娟，周舟

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450001

胃潰瘍（gastric ulcer，GU）屬于常見(jiàn)的消化性潰瘍疾病，是發(fā)生在胃竇、胃角、賁門(mén)、裂孔疝等部位的炎性壞死性疾?。?］。物理及化學(xué)因素引起的胃黏膜氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)均為GU發(fā)病的主要原因［2］。GU病程較長(zhǎng)且病情易反復(fù)，若不及時(shí)治療可能演變?yōu)槲复┛?，危及患者的生命安全?］。中醫(yī)學(xué)歸結(jié)“寒、熱、虛、實(shí)”等因素實(shí)施辨證論治，在GU的臨床治療中取得了一定的成效［4］。理中湯是《傷寒論》中的溫中名方，有溫中祛寒、補(bǔ)虛回陽(yáng)之效。本研究旨在探討理中湯對(duì)大鼠醋酸性GU的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物50只3月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK2006009。飼養(yǎng)在22～25℃室溫，相對(duì)濕度45%～55%環(huán)境，自由進(jìn)食飲水，自然光照，處理方法遵守動(dòng)物倫理原則。

1.2 藥物與試劑理中湯（由附子、人參、干姜、白術(shù)、炙甘草組成，購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院）；雷尼替?。ū贝筢t(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：200506）；PI3K、Akt、GAPDH抗體（美國(guó)CST公司，貨號(hào)分別為：6342S、4968S、3263S）；水合氯醛（上海澤葉生物科技有限公司，貨號(hào)：ZY-6604）；冰醋酸（上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司，貨號(hào)：0714-2.5L）；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司，貨號(hào)分別為：DS-535、DS-309、DS-320）；BCA定量檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物發(fā)展有限公司，批號(hào)：KGP856）；DMSO（美國(guó)Sigma公司，D5879）；Marker（Fermentas公司，貨號(hào)：26384）；ECL熒光底物（北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：DW102-04）；Trizol試劑（Takara公司，批號(hào)：A4537）；RNA提取試劑盒（德國(guó)QIAGEN，貨號(hào)：）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司，貨號(hào)R6943）；RIPA裂解液（日本TaKaRa，貨號(hào)：RR3792）；引物合成（上海生工生物工程有限公司）。

1.3 儀器DMLS2型顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；TP1020型生物組織脫水機(jī)（德國(guó)Leica公司）；NP-B型生物組織包埋機(jī)（德國(guó)Leica公司）；RM2235型切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與建模大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用雙盲法對(duì)大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，即正常對(duì)照組、模型組、理中湯低劑量組、理中湯高劑量組與雷尼替丁組，每組10只。采用乙酸注射法制備GU大鼠模型，具體方法［5-6］：術(shù)前大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛（20 mg·kg-1）進(jìn)行麻醉，然后將大鼠固定在動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，剃除腹壁毛后進(jìn)行常規(guī)消毒。沿劍突向下切開(kāi)腹壁（約2 cm）將胃剝離，采用微量注射器于胃壁肌層處注入20μL乙酸，出現(xiàn)半透明白斑后將胃送回腹腔，切口用生理鹽水清洗，之后覆蓋網(wǎng)膜并將腹壁縫合，正常對(duì)照組注射同體積的生理鹽水。

2.2 給藥方法術(shù)后1 d給予各組大鼠藥物灌胃治療，成人理中湯臨床劑量約為1 g·kg-1，根據(jù)動(dòng)物體表面積換算法大鼠的給藥劑量約6 g·kg-1，故本研究設(shè)置理中湯低劑量為6 g·kg-1，理中湯高劑量為12 g·kg-1，雷尼替丁劑量為0.3 g·kg-1，正常對(duì)照組與模型組給予同體積的生理鹽水灌胃，均連續(xù)給藥2周。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 大鼠血清炎性因子的檢測(cè) 末次給藥1 h后采用水合氯醛麻醉大鼠，取大鼠血清，ELISA法檢測(cè)大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2.3.2 HE染色觀察大鼠胃組織病理變化情況 每組隨機(jī)3只大鼠，取其胃組織于固定液（Bouin＋福爾馬林）中，待蛋白質(zhì)變性后將固定液沖洗干凈；石蠟包埋切片，烘干切片后脫蠟經(jīng)梯度乙醇脫水；蘇木素染色10 min，沖洗后鹽酸乙醇分化，沖洗干凈后伊紅染色30 s，脫水透明封片后鏡檢，觀察大鼠胃組織病理變化。

2.3.3 RT-PCR法檢測(cè)大鼠胃組織PI3KmRNA、AktmRNA水平 每組隨機(jī)選擇3只大鼠，取胃組織樣本，通過(guò)Trizol法提取總RNA，采用核酸定量分析儀檢測(cè)RNA濃度，檢測(cè)吸光度，（260 nm處）/（280 nm處）均在1.8～2.0，反轉(zhuǎn)為cDNA擴(kuò)增。內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，參考試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置各項(xiàng)參數(shù)，95℃預(yù)變性2 min→95℃變性15 s→60℃退火60 s，循環(huán)40次，65℃終末延伸5 s。記錄擴(kuò)增曲線(xiàn)，通過(guò)比較2-ΔΔCt值法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。具體的引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.3.4 Western Blot檢測(cè)大鼠胃組織PI3K、Akt蛋白表達(dá) 每組隨機(jī)選擇3只大鼠，取胃組織，充分剪碎后加入裂解液（PMSF＋RIPA）制備成勻漿，冰浴后離心。取上清液通過(guò)BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE凝膠電泳，按1∶1 000比例加入一抗兔抗多克隆PI3K、Akt抗體與二抗山羊抗兔IgG，轉(zhuǎn)膜、顯色、成像，采用Quantityone軟件掃描各條帶灰度，對(duì)蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠血清炎性因子的檢測(cè)與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯升高（P＜0.05），與模型組比較，理中湯低、高劑量組與雷尼替丁組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯下降（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 對(duì)大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響 （±s，ng·L-1）

表2 對(duì)大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響 （±s，ng·L-1）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n 劑量/g·kg-1 TNF-α IL-1βIL-6正常對(duì)照組10 - 2.58±0.11 3.45±0.16 2.70±0.13模型組 10 - 4.27±0.23* 4.78±0.20* 3.55±0.26*理中湯低劑量組 10 6 3.91±0.25 4.58±0.26 3.41±0.09理中湯高劑量組 10 12 3.16±0.18＃ 4.10±0.28＃ 3.10±0.27＃雷尼替丁組 10 0.3 3.48±0.10＃ 4.25±0.34＃ 3.22±0.28＃

3.2 大鼠胃組織病理變化正常對(duì)照組大鼠胃黏膜組織結(jié)構(gòu)排列整齊，未出現(xiàn)充血、水腫等癥狀；模型組大鼠胃黏膜腺體消失，出現(xiàn)明顯的瘢痕組織與壞死層，充血、水腫癥狀較為嚴(yán)重；理中湯低、高劑量組與雷尼替丁組可見(jiàn)壞死層減少，胃黏膜腺體水增加，充血、水腫癥狀明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠胃組織病理變化（HE，×100）

3.3 RT-PCR法檢測(cè)大鼠胃組織PI3K mRNA、Akt mRNA水平與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠胃組織PI3KmRNA、AktmRNA水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，理中湯低、高劑量組與雷尼替丁組均可降低大鼠胃組織PI3KmRNA、AktmRNA水平（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 對(duì)大鼠胃組織PI3K mRNA、Akt mRNA水平的影響 （±s）

表3 對(duì)大鼠胃組織PI3K mRNA、Akt mRNA水平的影響 （±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n 劑量/g·kg-1 PI3K mRNA AktmRNA正常對(duì)照組3- 1.00±0.00 1.00±0.00模型組 3 - 1.38±0.04*1.35±0.04*理中湯低劑量組 3 6 1.28±0.02 1.26±0.03理中湯高劑量組 3 12 1.21±0.03＃1.12±0.01＃雷尼替丁組 3 0.3 1.25±0.05＃1.21±0.02＃

3.4 Western Blot檢測(cè)大鼠胃組織PI3K、Akt蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠胃組織PI3K、Akt蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，理中湯低、高劑量組與雷尼替丁組均可明顯下調(diào)大鼠胃組織PI3K、Akt蛋白表達(dá)（P＜0.05）。見(jiàn)表4、圖2。

表4 對(duì)大鼠胃組織PI3K、Akt蛋白表達(dá)的影響

圖2 大鼠胃組織PI3K、Akt蛋白表達(dá)

4 討論

GU是一種常見(jiàn)多發(fā)病，幽門(mén)螺桿菌感染、藥物及飲食因素、應(yīng)激精神因素、遺傳因素等均可誘發(fā)GU［7］。具有易感傾向人群受到不良因素刺激時(shí)，巨噬細(xì)胞與淋巴細(xì)胞被激活并釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細(xì)胞因子［8-9］。TNF-α參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活化炎癥反應(yīng)，其水平異常上調(diào)可改變血管通透性并誘導(dǎo)產(chǎn)生凝血酶，促使胃黏膜微血管在炎癥發(fā)生時(shí)形成微血栓引起黏膜微循環(huán)障礙，同時(shí)還會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)IL-6等炎性細(xì)胞因子的釋放，加重胃損傷［10-11］。IL-6可調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化［12］，大量炎癥細(xì)胞聚集可導(dǎo)致粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)并產(chǎn)生大量活性氧加重炎癥反應(yīng)［13］，活化的中性粒細(xì)胞又可分泌TNF-α等炎性細(xì)胞因子，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)［14］。GU病理過(guò)程中，IL-1β可以趨化炎性細(xì)胞在病灶部位聚集并促使白細(xì)胞黏附分子表達(dá)，其自身水平也會(huì)明顯上調(diào)，可作為判斷GU嚴(yán)重程度的指標(biāo)［15］。研究發(fā)現(xiàn)，理中湯可下調(diào)大鼠胃組織PI3K、Akt蛋白表達(dá)，降低胃組織PI3KmRNA、AktmRNA水平說(shuō)明PI3K/Akt信號(hào)通路參與了大鼠GU病理變化過(guò)程［16］。PI3K/Akt信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、分化、增殖、凋亡的重要通路［17］，其中PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，與v.sre和v.ras等癌基因產(chǎn)物相關(guān)，本身具有磷脂酰肌醇激酶與絲氨酸/蘇氨酸激酶活性［18］。Akt是絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡等過(guò)程［19］。PI3K由催化亞基p110與調(diào)節(jié)亞基p85構(gòu)成，其被激活時(shí)，p110可誘導(dǎo)PIP2轉(zhuǎn)變?yōu)镻IP3與Akt結(jié)合促使其活化［20］。PI3K、Akt基因及蛋白異常表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡并推動(dòng)GU疾病進(jìn)展。

中醫(yī)學(xué)并無(wú)GU的病名記載，但根據(jù)其節(jié)律性、周期性上腹疼痛的特點(diǎn)，可將其歸于“胃脘痛”“胃痛”等范疇［21］。胃脘痛的病機(jī)在于脾胃虛弱、肝胃失和、外邪犯胃，脾胃虛寒是GU的常見(jiàn)類(lèi)型［22］。隨著人們生活品質(zhì)的提高與飲食結(jié)構(gòu)的變化，長(zhǎng)期的飲食不節(jié)與身心壓力均會(huì)引起脾胃虛寒，久而成疾［23］?！秱摗分杏涊d理中湯具有補(bǔ)氣健脾、補(bǔ)虛回陽(yáng)的功效，方中人參補(bǔ)脾益肺、大補(bǔ)元?dú)猓糜谥委熎⑻撌成?、體虛欲脫之癥；干姜回陽(yáng)通脈、溫中逐寒，可發(fā)諸經(jīng)之寒氣，治感寒腹痛［24］。藥理學(xué)研究，白術(shù)、甘草具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗消化道潰瘍的作用［25-26］。諸藥配伍可補(bǔ)益脾腎、中陽(yáng)建運(yùn)，下降濁陰、上升清陽(yáng)，標(biāo)本兼治，療效顯著。

研究發(fā)現(xiàn)，附子理中湯可以有效改善GU模型大鼠消瘦、飲食下降等癥狀，并保護(hù)胃黏膜細(xì)胞，減輕其水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等，對(duì)胃組織起到保護(hù)作用［27］。有研究認(rèn)為，PI3K、Akt基因及蛋白表達(dá)水平異常會(huì)促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放并誘導(dǎo)胃黏膜細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而加重GU病情［28］。陳小娟等［29］指出，加速胃黏膜潰瘍修復(fù)需要下調(diào)炎性因子表達(dá)水平，調(diào)節(jié)TLR-2/MyD88信號(hào)通路。夏菁等［30］指出，吳茱萸堿可以通過(guò)調(diào)節(jié)Hedgehog信號(hào)通路，減輕炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激損傷從而起到保護(hù)胃黏膜的作用。

GU的發(fā)生與炎癥反應(yīng)相關(guān)，且通過(guò)干預(yù)某些信號(hào)通路能夠降低炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平，從而起到改善GU的效果。治療GU的關(guān)鍵在于通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)等對(duì)胃組織的不良刺激，從而改善GU病情。

綜上所述，理中湯可明顯降低胃潰瘍大鼠血清炎癥水平，下調(diào)大鼠胃組織PI3K、Akt蛋白表達(dá)，可能與調(diào)控PI3k/Akt通路有關(guān)。但誘發(fā)GU的機(jī)制多樣，涉及的信號(hào)通路也較為復(fù)雜，理中湯抗乙酸所致GU的具體作用過(guò)程還需進(jìn)一步進(jìn)行研究。