李春野， 李 惠

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150000

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是在未過量飲酒和其他導致肝臟脂肪變性的情況下，以肝細胞脂質過度堆積為主要特征的臨床病理綜合征[1]。NAFLD包括非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，NAFL)也稱單純性脂肪性肝病，以及由其演變的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，后者可進展為病變程度更嚴重的脂肪性肝纖維化、肝硬化甚至肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[2]。越來越多的證據(jù)表明，表觀遺傳機制影響NAFLD的發(fā)生與發(fā)展。DNA甲基化是導致NAFLD基因表達異常的主要表觀遺傳學改變之一[3]，被認為是肝臟表型從正常肝組織學到單純性肝脂肪變性再到炎癥和纖維化過程中的一個“分子鐘”[4]。一些研究也建議將DNA甲基化狀態(tài)作為NAFLD進展的標志[5]。因此，本文對目前DNA甲基化在NAFLD中的研究進展、影響因素及潛在臨床意義進行分析，以期加深對DNA甲基化和NAFLD關系的認識，并對以之為潛在治療靶點的臨床意義進行進一步挖掘與探索，改善患者的生存及預后。

1 NAFLD的流行病學分析、危險因素及發(fā)病機制研究進展

NAFLD的患病率為15%～70%，因種族和診斷方法的不同而不同。全球NAFLD患病人數(shù)高達10億[6]，已成為目前公認的全球最常見的慢性肝病[7]。據(jù)估計，NASH影響了全球3%～5%的人口[8]，NAFLD是美國慢性肝病最普遍的原因，影響8 000萬至1億人，其中NASH幾乎占25%[6]。我國NAFLD患病率為29.2%，中年、男性、西北地區(qū)和臺灣地區(qū)、人均國內(nèi)生產(chǎn)總值(GDP)>10萬元的地區(qū)、維吾爾族和回族人群的疾病負擔較重。我國受NAFLD影響的人口在10年內(nèi)從18%急劇增加到29%，患病率以西方國家的兩倍多的速度增長。據(jù)預測，到2030年，我國將成為全球NAFLD患病率增長最快的國家，將有3.1458億例。此外，我國NAFLD的中位年齡是世界上最年輕的，這意味著其晚期并發(fā)癥的最大影響將發(fā)生在以后的幾十年[9]。

NAFLD的發(fā)病及進展是一個復雜的過程，其機制尚不清楚[10]。環(huán)境因素(飲食、生活方式、腸道微生物區(qū)系等)與遺傳和表觀遺傳背景協(xié)同作用，促進肝臟胰島素抵抗、慢性肝炎和壞死性炎癥。代謝失衡、內(nèi)質網(wǎng)(ER)和氧化應激、脂毒性(由非酯化膽固醇、神經(jīng)酰胺或二酰甘油引起)和病原體相關分子模式(PAMPs)的存在(由增加的腸道生物失調(diào)和腸道通透性促進)導致肝細胞損傷和死亡、免疫細胞浸潤、纖維化和疾病進展[10]。

NAFLD與肥胖、胰島素抵抗、高血壓、血脂異常、2型糖尿病(T2DM)、代謝綜合征及心血管疾病密切相關[11-13]。包括澳大利亞、美國、新西蘭、英國等范圍內(nèi)NAFLD發(fā)病率的上升在一定程度上是由肥胖率和T2DM的激增推動的[14]。Meta回歸模型顯示，地理區(qū)域和平均年齡與NAFLD的患病率有關(P<0.05)[7]。Ekstedt等[15]進行長達33年的隨訪研究表明，NAFLD患者的死亡風險增加，且NAFLD患者的纖維化階段可以預測總體死亡率和疾病特異性死亡率。

2 DNA甲基化與NAFLD

2.1 DNA甲基化越來越多的證據(jù)表明，表觀遺傳機制影響NAFLD的發(fā)生與發(fā)展。DNA甲基化是一種基本的表觀遺傳修飾，也是研究最廣泛和表征最好的表觀遺傳標記[16]，在基因組印跡、細胞分化、胚胎發(fā)育、X染色體失活和染色體穩(wěn)定等諸多過程中發(fā)揮著重要作用[17]。

DNA甲基化是指胞嘧啶的第5位碳原子在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下被甲基化修飾為5-甲基胞嘧啶(5mC)[18-19]。在人類和其他哺乳動物中，這種修飾只強加于DNA序列中鳥苷之前的胞嘧啶(CpG二核苷酸)。發(fā)生DNA甲基化的CpG二核苷酸在基因組中的分布不均，這些二核苷酸可以聚集在稱為“CpG島”的DNA的小片段(0.5～4.0 kb)中，這些區(qū)域通常與DNA轉錄成RNA的開始部位-啟動子區(qū)域[包括轉錄起始位點(TSS)1500、TSS200、5′非翻譯區(qū)(UTR)和第一外顯子]有關。在基因組的大部分中，約80%與CpG島無關的CpG二核苷酸是高度甲基化的。相反，CpG島上的二核苷酸，特別是那些與基因啟動子相關的二核苷酸，無論基因是否正在轉錄，通常是未甲基化的[20]。約60%的人類基因在其啟動子上有CpG島[21]，基因啟動子區(qū)域的甲基化通常與基因沉默相關[20]。

2.2 NAFLD患者基因多位點發(fā)生DNA甲基化改變

NAFLD患者中，DNA發(fā)生甲基化并引起沉默效應相對比較普遍。很多研究均證明，NAFLD患者DNA多位點發(fā)生甲基化改變，與疾病的發(fā)生及進展密切相關，也有許多基因是組織特異性甲基化，因此在疾病過程中不發(fā)生變化。NAFLD患者的肝細胞和白細胞具有相同的DNA甲基化模式，即全局低甲基化模式[22]。Murphy等[23]在NAFLD組織中觀察到TSS和大多數(shù)CGI的整體低甲基化。常染色體和性染色體的甲基化也不同，X染色體上CGI的相對高甲基化，這可能是由于女性的X染色體失活導致。在比較輕度和晚期NAFLD的甲基化情況時，在CGI海岸(距CGI 0～2 kb)觀察到輕度和重度NAFLD之間的差異甲基化顯著增加。許多組織修復基因在晚期NAFLD中低甲基化和高表達(如COL1A1、LAMA4、CCR7等)，而某些代謝基因高甲基化和表達下調(diào)(如APOC4、CYP2C19、SLCO1B3等)。Zhang等[22]在外周血細胞中發(fā)現(xiàn)863個差異甲基化(DM)CpG位點，詳細地說，編碼區(qū)的高甲基化和低甲基化位點的比例遠遠高于基因組的其他區(qū)域。在基因組的非編碼區(qū)，啟動子和基因間隔區(qū)的CGI分別含有豐富的低甲基化和高甲基化位點。這些發(fā)現(xiàn)表明，DM基因座雖然數(shù)量有限，但在基因組的生物區(qū)高度富集。且研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控糖脂代謝、脂肪性肝炎、纖維化和癌變基因的CpG位點甲基化改變與NAFLD密切相關；Wu等[4]研究分析NAFLD患者的循環(huán)血白細胞含有65個CpG位點，與健康對照組相比，這與60個差異甲基化的基因密切相關，在NAFLD患者和正常對照組中被發(fā)現(xiàn)顯著甲基化，且半數(shù)以上與NAFLD相關的CpG位點主要表現(xiàn)為低甲基化。

2.3 DNA甲基化參與NAFLD的發(fā)病過程在NAFLD的發(fā)病中，DNA甲基化也起到不可或缺的作用。Walle等[24]研究表明，肝臟脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase，F(xiàn)ADS)2基因變異可能通過改變DNA甲基化，參與NAFLD的發(fā)病。酰輔酶A合成酶長鏈家族成員4(long chain acyl-CoA synthetase 4，ACSL4)(Cg15536552)和肉堿棕櫚酰轉移酶1C(carnitine palmitoyltransferase 1C，CPT1C)(Cg21604803)低甲基化位點與NAFLD發(fā)病風險相關。ACSL4(Cg15536552)甲基化水平降低增加了NASH的易感性[22]。

2.4 DNA甲基化在NAFLD疾病進展中的作用多種基因參與脂質代謝過程，而部分基因發(fā)生甲基化即可導致肝臟脂質代謝異常。Borowa-Mazgaj等[25]研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD的發(fā)生和發(fā)展與由甘氨酸N-甲基轉移酶(glycine N-methyltransferase，GNMT)啟動子胞嘧啶DNA高甲基化介導的GNMT下調(diào)密切相關。干擾素調(diào)節(jié)因子6(interferon regulatory factor 6，IRF6)基因啟動子高甲基化下調(diào)，不能抑制過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)γ及其靶點，從而導致脂質代謝異常[26]。ACSL4在高脂血癥小鼠血漿甘油三酯和葡萄糖代謝及肝臟磷脂合成中起關鍵作用[27]。鋅指蛋白300(ZNF300)通過PPARα促進脂肪酸氧化而在肝臟脂質代謝中發(fā)揮重要作用，這種作用可能被DNMT3a介導的ZNF300甲基化所阻斷[28]。

2.5 DNA甲基化與NAFLD嚴重程度相關越來越多的研究表明，NAFLD的嚴重程度與DNA甲基化水平有關(見表1)，且不同位點的甲基化程度可能與NAFLD嚴重程度呈正或負相關。位于PARVB變異體1調(diào)節(jié)區(qū)的CpG26在晚期NAFLD患者的肝臟中顯著低甲基化。相反，在這些患者中，PNPLA3調(diào)節(jié)區(qū)的CpG99高度甲基化[29]，而與輕度NAFLD患者相比，晚期NAFLD患者PPARα啟動子目標區(qū)的CpG3具有顯著更高的DNA甲基化。類似地，PPARδ啟動子靶區(qū)內(nèi)的CpG2的DNA甲基化程度在重度組顯著增加[17]。Hardy等[30]發(fā)現(xiàn)，與輕度NAFLD患者相比，重度NAFLD患者PPARγ基因啟動子上CpG1和CpG2的甲基化程度更高，PPARγ基因啟動子上CpG1甲基化閾值81%是區(qū)分輕度和晚期纖維化的最佳分界值。Wu等[4]研究證明，與正常肝臟和單純性肝臟脂肪變性相比，NASH與不同的DNA甲基化有關，其中SSBP1和SIGIRR對NASH和單純性肝脂肪變性有較好的鑒別作用。

表1 預測NAFLD嚴重程度的DNA甲基化相關的基因列表

另一方面，也有研究表明，隨著肝臟炎癥程度的加重和疾病的進展，NAFLD患者整體DNA甲基化水平呈下降趨勢[31]。晚期NAFLD患者的肝臟PNPLA3 mRNA水平低于輕度NAFLD患者，且與肝DNA中CpG99甲基化水平呈負相關[29]。重度NAFLD組血小板衍生生長因子α(platelet-derived growth factor alpha，PDGFα)啟動子CpG3甲基化程度僅為輕度肝病組的一半[17]。Tu等[32]研究表明，脂肪心磷脂合酶1(adipose cardiolipin synthase 1，CRLS1)通過抑制激活轉錄因子3(activating transcription factor 3，ATF3)的表達和活性，減輕NASH病理過程中的胰島素抵抗、肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化。

2.6 DNA甲基化與NAFLD癌變除了參與NAFLD發(fā)生、發(fā)展及在決定疾病嚴重程度過程中起到一定作用之外，一些研究表明DNA甲基化也參與NAFLD惡變。Hotta等[33]利用共甲基化和差異甲基化區(qū)域(DMR)分析證明，晚期NAFLD患者肝臟線粒體功能、氧化還原酶活性和代謝的降低發(fā)生在DNA甲基化水平，并在DNA甲基化水平獲得致瘤潛能。Kuramoto等[34]在腫瘤相關基因中發(fā)現(xiàn)了NASH和NASH相關的HCC特異性DNA甲基化改變，這種改變與mRNA表達異常相關，可能參與NASH相關的多階段肝癌的發(fā)生。Sung等[35]報道，ACSL4的高表達與HCC的分級和分期密切相關，是HCC中總生存期(OS)獨立的預后危險因素，與索拉非尼治療晚期HCC患者的良好預后相關，可用于預測索拉非尼在HCC中的敏感性[36]。

Wu等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在與NAFLD相關的CpG位點，包括鉀電壓門控通道亞家族Q成員3(potassium voltage-gated channel subfamily Q member 3，KCNQ3)、巖藻糖基轉移酶(fucosyltransferases，F(xiàn)UT)11、雙特異性磷酸酶16(dual-specificity phosphatase 16，DUSP16)、鈣調(diào)蛋白結合轉錄激活因子1(calmodulin binding transcription activator 1，CAMTA1)、G2和S期表達1(G2and S-phase expressed 1，GTSE1)，似乎與NAFLD有密切的聯(lián)系，并且發(fā)生HCC的風險更高，其中GTSE1的高表達與HCC患者的病理分期和預后不良有關[37]，可能是預測肝癌預后的分子標志物[38]。

3 NAFLD患者發(fā)生DNA甲基化的影響因素

對DNA甲基化研究的發(fā)展揭示了DNA甲基化不是固定的，而是高度動態(tài)的，并且對細胞和組織微環(huán)境作出反應[17]。環(huán)境因素會影響DNA甲基化，下面列舉出一些對DNA甲基化的主要影響因素。

飲食是影響DNA甲基化的主要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，高脂飼料和高脂飼料加果糖喂養(yǎng)的小鼠降低了脂肪酸氧化的限速酶CTP1A的活性[39-40]，可能通過DNA CpG甲基化從而特異性激活DNMT1，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)脂質代謝相關基因的表達[41]。研究發(fā)現(xiàn)一碳供體(包括甜菜堿、膽堿、葉酸)均有劑量依賴性的改善NAFLD的效果，它們還能改善血清和肝臟氧化還原系統(tǒng)、肝臟S-腺苷蛋氨酸/S-腺苷同型半胱氨酸(SAM/SAH)比值，并增加肝臟整體DNA甲基化[42]。

子宮內(nèi)代謝環(huán)境對DNA甲基化的影響是其增加NAFLD易感性的機制之一。動物模型研究表明，子宮內(nèi)過多的膽固醇暴露可以使子代易患上NAFLD，這種早期發(fā)育可以持續(xù)整個生命周期[43]。

中醫(yī)藥對DNA甲基化的影響是其發(fā)揮作用的機制之一。含砷中草藥方劑(CHF)青黃可引起全基因組顯著去甲基化，并影響染色體核型狀態(tài)和基因組甲基化水平[44]。白藜蘆醇可降低NAFLD條件下DNA甲基轉移酶的表達和活性，減輕氧化應激和脂質堆積[45]，而且適當攝取白藜蘆醇可能是預防NASH發(fā)生發(fā)展的潛在途徑[46]。

減肥手術是影響DNA甲基化的因素之一。在減肥手術前后編碼蛋白酪氨酸磷酸酶ε(PTPRE)的基因表現(xiàn)出差異表達和差異甲基化，失去甲基化的CpG位點通常在從正常肝臟向NASH進展的過程中獲得甲基化[47]。Benton等[48]分析了肥胖女性在胃旁路手術和顯著減肥前后脂肪組織中的DNA甲基化，共分析了485 577個CpG位點。配對分析顯示大網(wǎng)膜和皮下脂肪組織的甲基化顯著不同。在體質量下降之前，CpGs有較大比例的高甲基化，并且在3’UTR和基因體中觀察到相對于啟動子區(qū)域的甲基化增加[48]。

體育鍛煉也是影響DNA甲基化的因素之一，同時也是一種有益的非藥物預防和治療策略。研究發(fā)現(xiàn)，運動訓練能夠改變小鼠肌肉生長和分化相關基因的DNA甲基化模式[49]，而且運動能夠誘導PGC-1α、PDK4和PPAR-δ的表達呈劑量依賴性，啟動子的甲基化水平顯著降低[50]。體育鍛煉已被證明對代謝性肝功能障礙的某些病理特征有益處，尤其是線粒體功能障礙[5]。

4 DNA甲基化對于NAFLD治療的潛在臨床意義

NAFLD的最佳非侵入性檢測方法仍在開發(fā)中，我們期待未來可以開發(fā)出一種檢查方法可以接近甚至超過肝活檢的臨床價值。Wu等[4]結果表明，DNA甲基化的表觀遺傳學變化可能與臨床參數(shù)相關，包括血清肝酶、血脂譜及NAFLD的組織學特征。且研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者外周血白細胞中存在甲基化CpG位點的改變，這些血源性生物標志物可能對NASH的臨床研究和診斷有潛在價值。5hmC譜是NAFLD中基因轉錄的有用標志和細胞狀態(tài)的標志，并提示5hmC譜有可能作為與肥胖相關的異常肝生理的生物標志物[51]。

Zeybel等[17]研究發(fā)現(xiàn)，肝臟中每個CpG位點的甲基化在個體內(nèi)的變異相當?shù)停谆剿坪醪皇苣挲g或性別的影響，這表明單個位點肝活檢可能足以提供代表整個器官的DNA甲基化的定量估計。Murphy等[52]對特征良好的輕度或晚期NAFLD患者肝臟進行全基因組甲基化和肝臟基因表達(GEX)數(shù)據(jù)綜合分析，結果表明在晚期NAFLD中發(fā)生的甲基組-轉錄組相互作用可以調(diào)節(jié)NAFLD的結果，包括癌癥和/或肝硬化的發(fā)展。

NASH是HCC發(fā)生的獨立危險因素[53]。DNA甲基化模式的改變可能是與腫瘤發(fā)生相關的最早可檢測到的腫瘤變化之一。攜帶循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)的癌癥特異性甲基化模式已被研究成為癌癥中可行的生物標志物。最近的研究表明，ctDNA有可能通過非侵入性的“液體活檢”來徹底改變癌癥的篩查、診斷和治療，而且部分研究也表明，ctDNA甲基化標志物具有高度的敏感性和特異性，與肝癌患者的腫瘤負擔、分期、治療反應和預后相關，證明了無細胞DNA甲基化分析在HCC的診斷、治療評估和預后中的作用，并為其在HCC以外的腫瘤中的廣泛應用提供了概念上的證據(jù)[54]。

5 總結與展望

NAFLD疾病的嚴重性日益顯現(xiàn)，DNA甲基化是NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中的重要決定因素，與NAFLD的進展和纖維化的發(fā)展密切相關。上述研究表明，通過改變生活方式來調(diào)節(jié)表觀基因組似乎能夠逆轉因飲食不當而造成的NAFLD，并有望通過發(fā)展一些無創(chuàng)操作檢查技術如血源性生物標志物、液體活檢等來鑒別早期及進展期NAFLD患者，改變NASH相關HCC的患者的篩查、診斷和治療，在一定程度上減少NAFLD患者的痛苦，延緩疾病的發(fā)展，為NAFLD患者帶去福音。