張志興 ，敏秀梅 ，宋果 ，陳花 ，許海龍 ，林文雄 ?

1福建農林大學生命科學學院，福州 350002；2福建農林大學/福建省農業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點實驗室，福州 350002

0 引言

【研究意義】14-3-3蛋白是植物中普遍存在的一類對生長發(fā)育及環(huán)境響應起重要作用的調節(jié)蛋白[1]，探明14-3-3蛋白在水稻籽粒灌漿過程中的時空表達模式及功能，對揭示14-3-3蛋白調控水稻產量與品質的形成具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】14-3-3蛋白主要以同源或異源二聚體形式存在，可以同時與2個靶蛋白或者與1個靶蛋白的2個結構域相互作用，通過與靶蛋白上一小段共有序列的磷酸化絲氨/蘇氨酸殘基結合來發(fā)揮其調控功能，其主要結合模式有RSXpSXP（I型），RXXXpSXP（II型）和 pS/TX-COOH（III型），其中pS和pT分別代表Ser和Thr[2]。14-3-3蛋白通過上述3種磷酸化結合模式與其靶蛋白互作，保證了14-3-3蛋白在生物體中的重要調節(jié)功能。在植物中，借助親和層析和酵母雙雜交等方法，已鑒定到300多種與14-3-3蛋白互作的靶蛋白，涉及植物體內多種激素信號轉導途徑和代謝過程[3-4]。例如，14-3-3蛋白作為一個接頭因子能夠將 ABA效應因子 VP1（viviparous 1）與受ABA誘導的順式作用元件ABRE（ABA-responsive element）聯系起來，共同調控下游ABA應答基因的表達[5]。14-3-3蛋白通過與轉錄因子BZR（BRASSINAZOLE-RESISTANT）的相互作用，在植物體內 BR信號通路中起到負調控作用[6]。酵母雙雜交系統證實水稻14-3-3蛋白能夠和參與乙烯合成的 ACC合成酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase）互作[7]。在模式植物擬南芥中的研究表明，超表達14-3-3蛋白，會顯著抑制TCA循環(huán)及糖酵解途徑中關鍵酶的活性，從而導致植株糖及含氮化合物含量下降[8]。在鑒定到的 14-3-3靶蛋白中，有很大一部分是與植物淀粉合成代謝相關的，例如蔗糖合成酶（SuS），淀粉合成酶I（SSI）、淀粉合成酶II （SSII），淀粉分支酶同工酶（SBEIIa、SBEIIb）及 ADP焦磷酸化酶大亞基（AGPL）等[9-11]。由此可見，14-3-3蛋白在植物激素信號轉導及碳代謝中發(fā)揮著重要的作用。眾所周知，淀粉合成是籽粒灌漿過程中最重要的代謝途徑之一，在這過程中腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉合成酶（StS），SuS和淀粉分支酶（SBE）及淀粉去分支酶（DBE）等基因的表達變化及酶活性的高低對淀粉合成具有重要的影響[12-13]。此外，植物內源激素在籽粒的庫容及千粒重的形成過程中起到了重要的調節(jié)作用。已有研究表明，籽粒中ABA/IAA、ABA/GA1+3和ABA/（IAA+GA1+3+ ZRS+ABA）的比值與籽粒的灌漿充實密切相關[14]。ZHANG[15]及YANG等[16]研究表明灌漿期適度干旱脅迫能改變籽粒中 ABA的含量，進而提高SuS、AGPase、StS及SBE的活性。一些學者認為籽粒中較高濃度的 GA會降低 StS和SuS的活性，進而導致結實率和產量顯著下降[17]。已如上述，植物14-3-3蛋白會通過與其互作靶蛋白結合，進而參與多種激素信號轉導及淀粉合成過程。例如，水稻籽粒14-3-3蛋白會響應外源ABA處理而出現顯著的蛋白表達及磷酸化修飾的變化，暗示著14-3-3蛋白參與了 ABA調控籽粒灌漿的過程[18]。此外，筆者還發(fā)現14-3-3蛋白成員GF14f在弱勢籽粒灌漿過程中蛋白表達量相對強勢籽粒較大，是導致弱勢籽粒灌漿結實差的一個重要的原因[19]。YOU等[20]發(fā)現移除穗頂端的強勢籽粒后，底端的弱勢籽粒中淀粉合成關鍵酶活性、千粒重及結實率顯著得到提高，并進一步通過差異蛋白組學分析，發(fā)現弱勢籽粒中 14-3-3蛋白的表達量顯著下降?？梢?，水稻 14-3-3蛋白家族在籽粒灌漿過程中發(fā)揮著重要的作用?！颈狙芯壳腥朦c】水稻籽粒灌漿完成情況對產量及品質的形成至關重要。目前為止，在水稻中共鑒定到8個14-3-3蛋白家族成員（命名為 GF14a-h）[21-23]，但對其在籽粒灌漿過程中的表達變化模式及其調控機制仍缺乏系統的分析?！緮M解決的關鍵問題】本研究擬運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析14-3-3基因家族在水稻籽粒灌漿不同時期的表達變化模式，并采用親和層析技術鑒定籽粒中與 14-3-3蛋白互作的靶蛋白，在此基礎上，通過籽粒灌漿期外源激素的處理，探明14-3-3及其互作靶基因在籽粒灌漿過程中對激素調控的響應，以期揭示14-3-3蛋白在水稻籽粒灌漿過程中的調控機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用大穗型常規(guī)水稻“金恢 809”為試驗材料，于2014年在福建農林大學（福建省福州市）的校內農場進行，采用桶栽土培的方法進行水稻的種植。水稻種子通過多菌靈滅菌清洗后，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱，保持其濕潤狀態(tài)。3月20日播種，采用旱育方式育秧，4月20日移栽至塑料桶（40 cm×40 cm）中，每桶移栽3株，單本插。桶栽所用的土壤取自大田水稻土，移栽水稻后的塑料桶放置于頂部覆蓋有塑料薄膜的網室內。在水稻全生育期每桶施尿素3.9 g，磷酸鈣6.56 g，氯化鉀2.1 g，其中60%尿素，50%氯化鉀和100%磷酸鈣作為基肥，40%尿素和50%氯化鉀作為穗肥施用，其他栽培措施與常規(guī)的水稻栽培一致。在水稻抽穗開花期，選取長勢一致、同一天開花抽穗的主穗進行掛牌標記，在花后5—30 d，每隔5 d收集籽粒樣品，液氮速凍后保存于-80℃冰箱中。在水稻花后15 d，分別對籽粒進行外源激素噴施處理，激素濃度的設置參照 YAO[22]，YANG[24]，ZHANG[25]及李贊堂[26]等的研究報道，分別為 25×10-6mol·L-1ABA，10×10-6mol·L-1IAA，100×10-6mol·L-1GA，50×10-6mol·L-1ZR 和 2×10-4mol·L-1BR，在噴施激素3 h后，收集籽粒樣品用于qRT-PCR分析。

1.2 主要試劑

大腸桿菌BL21和原核表達載體PGEX-6P-1，由筆者實驗室保存提供。Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司，基因克隆載體pMD18-T Vector購自TaKaRa公司。植物激素脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）、油菜素內酯（BR）和吲哚乙酸（IAA）購自Sigma公司；玉米素（ZT）購自Aladdin公司?？俁NA提取試劑Trizol購自TaKaRa公司；cDNA合成試劑盒TIANscript RT Kit、qRT-PCR試劑SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）和質粒提取試劑盒購自TIANGEN公司；蛋白親和吸附基質 Glutathione SepharoseTM 4B及 Ni-Sepharose 6 Fast flow購自GE公司。

1.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

選取灌漿不同時期的水稻籽粒，去殼后，采用Trizol法提取總 RNA，cDNA第一條鏈合成按照TIANGEN公司TIANscript RT Kit試劑盒提供的操作步驟進行。依據 NCBI數據庫檢索得到的 8個水稻14-3-3基因的編碼序列，利用Primer Premier 5.0設計相應的qRT-PCR引物，如表1所示。qRT-PCR采用TIANGEN公司SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒進行。β-actin作為內參，基因的相對表達量采用 2-ΔΔCt的方法進行計算。

表1 試驗中用到的qRT-PCR和PCR的引物Table 1 qRT-PCR and PCR primers used in this study

1.4 親和層析分析

以水稻籽粒cDNA為模板，按表1中的引物序列，擴增GF14b、GF14e的開放閱讀框（ORF），并克隆到表達載體 PGEX-6P-1中，構建 GST-GF14b及GST-GF14e融合蛋白表達載體。之后，將重組質粒轉化大腸桿菌BL21，IPTG誘導蛋白表達，菌體超聲破碎后，離心，將上清液轉入Glutathione SepharoseTM 4B吸附柱中，加入15倍柱床體積的PBS緩沖液洗滌柱子，還原型谷胱甘肽洗脫液洗脫后，采用SDS-PAGE檢測融合蛋白純化結果。將灌漿不同時期的水稻籽粒樣品去殼混合，液氮研磨，每1 g籽粒加入1 mL含有 50 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.5）、150 mmol·L-1NaCl、4 mmol·L-1MgCl2、0.5 mmol·L-1EDTA、0.5%NP-40、2 mmol·L-1DTT、1 mmol·L-1PMSF 提取緩沖液中，充分混勻，冰上30 min后，4°C 11 000 r/min離心20 min，取上清液，0.22 μm濾膜過濾除雜，獲得籽粒非變性全蛋白粗提液。之后，將提取液分別加入GST-GF14b及GST-GF14e融合蛋白的親和吸附柱中，4℃孵育過夜，加入15倍柱床體積的PBS洗滌5次，還原型谷胱甘肽洗脫后，進行冷凍濃縮處理，再采用SDS-PAGE檢測結果。

1.5 靶蛋白質譜鑒定

切取 SDS-PAGE膠上蛋白條帶，裝于 1.5 mL離心管中，胰蛋白酶酶解后，用于LC-MS/MS質譜鑒定。液相采用高速液相色譜系統 Ultimate 3000（ThermoFisher Scientific），利用色譜柱BioBasic C18 Column（100×0.18 mm，particle size：5 um）對肽段進行分離。LTQ-XL（Thermo Scientific）質譜的具體參數為：噴霧電壓條件設為3.5 kV；母離子掃描的范圍為400—2 000 m/z；Isolation width為2 Da。二級質譜條件：AGC Target 1e4，1 microscans；碰撞能量：35% CID，CID掃描后選擇前10個最高豐度的離子進行PQD掃描。質譜分析所獲得的原始數據用Proteome Discoverer1.2軟件進行相對定量分析，并利用RGAP7.0蛋白數據庫（http://rice.plantbiology.msu.edu）進行蛋白檢索，選擇至少有2個獨立肽段匹配的蛋白作為可信蛋白，FDR閾值設為＜5%。

1.6 體外GST-pull down驗證

依據質譜鑒定結果，隨機選擇2個靶蛋白Sucrose synthase 3（SUS3）和Puromycin-sensitive aminopeptidase（PSA），以籽粒的cDNA為模板，按照表1中的引物序列，將擴增的SUS3和PSA的序列克隆到表達載體pet32a中，構建His-SUS3及His-PSA融合表達載體。采用Ni-Sepharose 6 Fast flow對融合蛋白進行純化，咪唑洗脫液洗脫，進行SDS-PAGE檢測。將純化好的His-SUS3及His-PSA融合表達蛋白，分別加入吸附有GST-GF14b及GST-GF14e融合蛋白的親和吸附柱中，4℃孵育過夜，還原型谷胱甘肽洗脫后，采用商業(yè)化的His抗體（Abmart，中國上海），進行Western blot分析。

1.7 生物信息學及數據分析

蛋白功能 motif位點借助 KEGG（http://www.genome.jp/kegg/kegg2.html）數據庫分析。利用檢索得到的所有互作蛋白的氨基酸序列，以 Fasta的形式通過Kinasephos（http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/index.php）在線程序對靶蛋白的Ser和Thr磷酸化位點進行預測分析。采用MapMan 3.6.0軟件對互作蛋白的功能及參與的代謝途徑進行分析。通過 Gene Ontology（http://geneontology.org/）數據庫對互作蛋白的細胞組分進行分析。

采用Microsoft Excel 2007 整理數據和制作圖表，DPS V7.05 軟件統計分析，以 LSD（P＜0.05）檢驗平均數間的差異顯著性。

2 結果

2.1 14-3-3基因在水稻籽粒灌漿過程中的表達變化分析

采用qRT-PCR動態(tài)分析了水稻14-3-3基因家族在花后5—30 d的基因表達變化情況。如圖1所示，除了GF14h外，其余的7個14-3-3基因家族成員在籽粒灌漿的不同時期均有表達。在整個籽粒灌漿期，GF14a的表達變化不大，GF14d的表達水平隨著灌漿的進行逐漸下降，GF14f在花后20 d和25 d的表達水平較高，其余時期的表達水平較低。GF14c和GF14e的表達變化趨勢一致，均是在灌漿前期表達變化不大，而在花后25 d和30 d表達水平迅速上升。GF14b基因表達水平從花后10 d就開始迅速上升。本研究進一步選取GF14b及GF14e作為后續(xù)的研究對象。

2.2 GF14b和GF14e蛋白功能motif分析

通過 KEGG數據庫對 GF14b和 GF14e的蛋白motif進行比對分析（表2），發(fā)現GF14b和 GF14e具有 3個相同的 motif類型，分別為 pf:DUF885、pf:14-3-3和 pf:TPR_12。pf:14-3-3和 pf:TPR_12在GF14b和GF14e的氨基酸序列中所處的位置相同，而pf:DUF885所處的位置不同。此外，GF14b和GF14e也具有不同的motif類型，pf:IFT20為GF14b特有的功能motif，pf:FlaF則為GF14e特有的功能motif。

表2 GF14b 和GF14e蛋白功能motif對比Table 2 The functional motif analysis of GF14b and GF14e protein

2.3 GF14b和GF14e互作靶蛋白鑒定

本研究采用親和層析技術，篩選籽粒中與 G14b及GF14e互作的靶蛋白，并利用SDS-PAGE對親和層析獲得的蛋白樣品進行檢測（圖2），共進行了12次獨立的生物學重復。之后，采用 LC-MS/MS對SDS-PAGE膠上的蛋白條帶進行鑒定。去除陰性及空白對照，選擇至少在3次生物學重復試驗中鑒定到的蛋白作為最終結果。依據此標準，本研究共鑒定到59個與GF14b結合的靶蛋白和72個與GF14e結合的靶蛋白，扣除2個家族成員間重復的結果，累計在籽粒中鑒定到88個與14-3-3蛋白結合的靶蛋白（表3）。

為了驗證親和層析的結果，隨機選取2個靶蛋白（SUS3和PS）采用體外GST pull-down的方法，分別驗證上述2個靶蛋白與GF14b及GF14e間的蛋白互作關系。構建His-SUS3及His-PSA融合表達蛋白，誘導表達純化后，分別與純化后的 GST-GF14b及GST-GF14e融合表達蛋白孵育，洗脫后，采用His抗體檢測。結果表明，SUS3與GF14b和GF14e有很高的親和力，PSA僅與GF14e有相互作用條帶，證實了親和層析結果鑒定的準確性（圖3）。

細胞定位分析表明，鑒定到的88個靶蛋白主要定位于細胞核（5.7%）、細胞質（50%）、葉綠體（29.5%）、線粒體（13.6%）和內質網（1.1%）（表3）。此外，通過磷酸化位點預測，發(fā)現在GF14b的59個互作靶蛋白中，96.7%具有Ser或Thr磷酸化位點；GF14e的72個互作靶蛋白中，97.2%具有Ser或Thr磷酸化位點（表3）。

表3 水稻籽粒中與14-3-3家族成員GF14b和GF14e互作的靶蛋白Table 3 14-3-3 species GF14b and GF14e client proteins in developing rice grains

續(xù)表3 Continued table 3

續(xù)表3 Continued table 3

2.4 GF14b和GF14e互作靶蛋白功能分析

通過對鑒定到的88個靶蛋白的功能分析，發(fā)現有11.36%參與糖轉化和淀粉合成，6.82%參與光合作用，14.77%參與糖酵解，6.82%參與氨基酸代謝，18.18%參與蛋白質合成，6.82%參與疾病和防御，6.82%參與信號轉導，15.91%參與細胞生長和分裂。少部分靶蛋白與核苷酸代謝（1.14%）、TCA（2.27%）、發(fā)酵（1.14%）、轉運蛋白（3.41%）和C1代謝（2.27%）有關，2.27%功能未知（圖4）。此外，本研究還發(fā)現14-3-3蛋白不同家族成員間也存在著互作關系，例如GF14b 與 GF14a，GF14c，GF14d，GF14e，GF14f互作，而GF14e與GF14b，GF14c和GF14d存在互作。

2.5 GF14b與GF14e互作靶蛋白差異分析

本研究發(fā)現GF14b及GF14e共同互作的靶蛋白有43個，而與 GF14b特異結合的靶蛋白有 16個，與GF14e特異結合的有29個（圖5）。GF14b特異性互作蛋白主要分布于 7個功能類別，包括光合作用（2個）、核苷酸代謝（1個）、蛋白質合成（2個）、轉運蛋白（3個）、疾病與防御（2個）、細胞生長與分裂（4個）和未知分類（2個），而GF14e特異性互作蛋白涉及9個功能類別，包括光合作用（2個）、糖酵解（2個）、氨基酸代謝（3個）、TCA（1個）、蛋白質合成（8個）、疾病與防御（1個）、信號轉導（1個）、細胞生長與分裂（9個）和C1代謝（2個）。

2.6 GF14b和GF14e及其互作靶基因對外源激素的響應

為了明確14-3-3蛋白在籽粒發(fā)育過程中對激素的響應機制，運用qRT-PCR，在轉錄水平分析了GF14b、GF14e及其互作的靶基因對外源激素ABA、IAA、GA、ZT和BR的響應。結果表明，不同外源激素處理下GF14b和GF14e基因均呈上調表達的變化趨勢，而蔗糖合成酶基因（SUS2），ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因（AGPS、AGPL），丙酮酸磷酸二激酶基因（PPDK2），淀粉分支酶基因（SBE）這 5個與淀粉合成密切相關的靶基因大部分呈現下調表達的趨勢，僅AGPL在外源IAA的處理下呈上調表達趨勢（圖6）。

3 討論

14-3-3蛋白是作物籽粒發(fā)育過程中的一個重要的信號調節(jié)因子，例如在玉米籽粒中鑒定到的zmgf14-4和zmgf14-6[9]，在擬南芥種子中鑒定到的14-3-3χ和14-3-3ε[8]，在大麥籽粒中鑒定到的14-3-3a[27]，均在籽粒發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究發(fā)現水稻14-3-3基因的8個家族成員中GF14b、GF14c、GF14e、GF14f和GF14g隨著籽粒灌漿的進行均有著不同程度的上調表達趨勢，暗示著上述5個14-3-3基因家族成員參與到水稻籽粒灌漿充實的生理過程中。進一步選取在籽粒灌漿期表達變化幅度較大的GF14b和GF14e，通過互作靶蛋白的鑒定，解析14-3-3蛋白在籽粒灌漿過程中的蛋白調控網絡。蛋白功能 motif分析表明，GF14b和GF14e具有3個相同類型功能motif，暗示著2個不同成員間具有相同的蛋白功能，親和層析的結果證實GF14b及GF14e間共有43個相同的互作靶蛋白。蛋白功能分析發(fā)現，在蔗糖轉化、淀粉合成、糖酵解代謝及TCA循環(huán)途徑中，GF14b及GF14e互作的靶蛋白大多數是一致的，例如蔗糖轉化及淀粉合成的限速酶AGPase和SuS，糖酵解過程的關鍵酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、果糖激酶（FRK）、磷酸甘油酸激酶（PGK）和 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）以及TCA循環(huán)的蘋果酸脫氫酶（MDH）。在擬南芥[8]、大麥[27]、小麥[10]及玉米[9]籽粒（種子）中也鑒定到大量與14-3-3蛋白互作的碳代謝相關靶蛋白。據此，筆者認為水稻籽粒灌漿過程中，14-3-3蛋白家族通過與碳代謝相關靶蛋白互作，進而參與了水稻籽粒灌漿過程中碳代謝的調控。

水稻14-3-3蛋白不同家族成員具有各自特異的調控功能，例如，GF14b與抗旱性相關[28]，GF14c被認為是開花的負調控因子[29]，GF14e負調控細胞死亡及抗病響應[30]。本研究在籽粒中分別鑒定到 16個與GF14b及29個與GF14e特異結合的靶蛋白，這或許是由于2個成員間所具備的不同功能motif所導致的。例如，GF14b蛋白能夠特異與核酸代謝相關的Nucleoside diphosphate kinase以及轉運相關的mitochondrial carrier protein結合，而GF14e能夠與C1代謝中的 Formate dehydrogenase 1和 Formate--tetrahydrofolate ligase相互作用。此外，GF14b和GF14e在籽粒灌漿過程中的同一生理代謝過程也具有特異的調控機制，例如，在蛋白合成中，GF14e特異與40S ribosomal protein S6及Importin-alpha re-exporter結合，而 GF14b特異與 DEAD-box ATP-dependent RNA helicase結合；在細胞生長分裂中，GF14b特異與ADP-ribosylation factor1結合，而 GF14e特異與Puromycin-sensitive aminopeptidase 結合。14-3-3蛋白在玉米的籽粒發(fā)育過程中也有類似的結果，玉米14-3-3蛋白ZmGF14-4在胚乳發(fā)育過程中能特異地與抗病及抗逆相關蛋白結合，而ZmGF14-6主要與代謝及細胞結構相關蛋白互作[9]。上述結果表明GF14b和GF14e通過調節(jié)各自獨有的互作靶蛋白，進而在水稻籽粒灌漿過程中發(fā)揮著特異的調控功能。此外，本研究還發(fā)現GF14b及GF14e不僅能夠與對方相互作用，其自身也會自我結合，說明14-3-3蛋白家族的這2個成員間存在著蛋白二聚化（dimerization）。已有的研究也發(fā)現14-3-3蛋白能通過形成同質或異質二聚體[31]，從而使其能夠同時與2個靶蛋白或者1個靶蛋白的2個不同的結構域結合[32]。雖然，14-3-3蛋白主要是通過與靶蛋白互作進而發(fā)揮其調控作用的，但GF14b及GF14e的這種自我結合及不同成員間相互結合的方式（inter- and/or intra-species bindings），或許會增強其在水稻籽粒灌漿過程中的調控效果。

已有研究表明，14-3-3蛋白通過參與激素的信號轉導，從而在植物發(fā)育及逆境脅迫響應的過程中起到了重要的作用[3,33]。本研究發(fā)現，籽粒14-3-3基因家族的2個成員GF14b及GF14e均會響應激素ABA、IAA、GA、ZT、BR的處理而出現不同程度的上調表達趨勢，說明在籽粒灌漿過程中，14-3-3家族基因在激素信號調控網絡中也發(fā)揮著重要的作用。ZHU等[34]研究發(fā)現在籽粒灌漿期外源噴施 ABA及乙烯能夠降低SUS、AGPase和StS基因的表達及相應的酶活性?？梢姡参锛に貢ㄟ^調控籽粒灌漿過程中淀粉合成相關酶的基因表達及活性，從而調控籽粒的灌漿充實。本研究從GF14b及GF14e共同互作靶基因中，選取了SUS2,AGPS,AGPL，PPDK2，SBE這5個與淀粉合成密切相關的基因，發(fā)現上述5個靶基因在激素的處理下大部分呈下調表達的趨勢，這與GF14b及GF14e的表達變化趨勢相反，暗示著14-3-3基因與淀粉合成相關基因的表達呈負相關的調控關系。在大麥籽粒中的研究發(fā)現，SuS酶的活性受外源14-3-3蛋白的抑制[27]。在擬南芥中的研究也表明，抑制14-3-3蛋白的表達會導致淀粉的積累增加[35]。筆者前期通過RNAi干擾技術也發(fā)現特異減少 14-3-3家族成員的GF14f在籽粒中的表達，有利于提高籽粒灌漿過程中淀粉合成相關酶的活性[19]。據此，筆者認為14-3-3蛋白家族在籽粒灌漿過程中會響應激素濃度的改變，進而對淀粉的合成起到負調控作用。

14-3-3蛋白主要是通過磷酸化作用與其互作靶蛋白結合，進而調控靶蛋白的功能，其對互作靶蛋白的結構要求是含有磷酸化的Ser或Thr序列[2]，而本研究所鑒定到籽粒靶蛋白，大部分也是具有潛在的Ser或Thr磷酸化結合位點。蛋白的磷酸化修飾是調節(jié)植物碳代謝中的許多關鍵酶活性的一個重要的機制，其具體的調控過程是酶自身發(fā)生蛋白磷酸化修飾，之后與14-3-3蛋白結合形成復合體，從而改變其自身的酶活性[35-36]。例如，擬南芥葉片中的StSase III家族具有保守的磷酸化位點（RYGSIP），使其能夠與 14-3-3蛋白結合[37]。擬南芥GAPDH磷酸化后與14-3-3蛋白結合后，其酶活性受到抑制[38]。14-3-3蛋白也主要通過磷酸化作用參與激素的信號轉導。例如，14-3-3蛋白能夠與Ca2+-依賴的CDPK激酶磷酸化轉錄因子RSG（repression of shoot growth）的Ser114磷酸化位點結合，使得RSG滯留在細胞質中而不能進入細胞核調控編碼GA生物合成相關蛋白的基因，從而控制植株體內GA含量[39-40]。此外，本研究也發(fā)現水稻14-3-3蛋白自身也具有潛在的Ser或Thr磷酸化結合位點。前人的研究也證實14-3-3蛋白除了會與磷酸化靶蛋白結合進而調控其活性外，其自身磷酸化作用在信號調節(jié)的過程中也起到了極為重要的作用，且不同的家族成員間的磷酸化位點具有特異性[41-42]。由此可見，14-3-3蛋白或許會通過自身磷酸化及與磷酸化后的靶蛋白結合，進而在籽粒的碳代謝及激素信號轉導的過程中發(fā)揮著重要的作用，但其具體的調控機制及磷酸化位點還需進一步研究。

4 結論

14-3-3家族成員中的GF14b和GF14e基因在水稻籽粒灌漿過程中表達變化幅度較大，且會響應外源激素處理而出現表達變化。GF14b蛋白和GF14e蛋白具有相同及各自特異的互作靶蛋白，通過磷酸化的作用方式與其靶蛋白結合，參與籽粒灌漿過程中的碳代謝及激素的信號轉導，并作為負調控因子參與淀粉的合成過程。