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        堿提甘蔗皮多糖提取工藝、初步結(jié)構(gòu)及其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

        2021-08-12 06:17:22王萱萱劉春宇謝貝昱張淑淑王丹陽(yáng)朱振元
        關(guān)鍵詞:木糖糖苷酶甘蔗

        王萱萱,劉春宇,謝貝昱,張淑淑,王丹陽(yáng),朱振元

        天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,天津 300457

        0 引言

        【研究意義】甘蔗(Saccharumofficinarum)為禾本科(Poaceae)甘蔗屬(Sacchrum)的一種多年生高大實(shí)心草本高光效C4植物,是重要的糖料與生物能源作物,主要生產(chǎn)國(guó)是巴西、印度和中國(guó)等國(guó)家[1]。甘蔗皮作為一種廢棄物,約占甘蔗本身重量的20%,富含纖維、蛋白質(zhì)、木質(zhì)素、蔗糖、天然色素等物質(zhì)[2]。然而,大多數(shù)甘蔗皮被當(dāng)作加工副產(chǎn)物丟棄,造成一定的資源浪費(fèi),開(kāi)展甘蔗皮堿提多糖結(jié)構(gòu)和活性研究,旨在為甘蔗皮多糖的綜合開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐,對(duì)廢棄資源的再利用有著重要意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前,以甘蔗皮為原料的研究主要集中在甘蔗皮黃酮、多酚及花色苷的提取分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及抗氧化活性等方面。周慧芳[3]采用超聲輔助法提取甘蔗皮黃酮,通過(guò)有機(jī)溶劑萃取、聚酰胺層析、葡聚糖凝膠色譜和制備液相色譜分離得到黃酮單體,通過(guò)質(zhì)譜、核磁、紅外光譜分析了黃酮單體的結(jié)構(gòu),此外,甘蔗皮黃酮表現(xiàn)出良好的抑菌活性、抗氧化活性和降血糖活性;陳純[4]采用超聲波法提取甘蔗皮多酚,利用X-5樹(shù)脂對(duì)甘蔗皮多酚進(jìn)行純化,通過(guò)DPPH·自由基清除法和FRAP法兩種體系表明甘蔗皮多酚具有一定的抗氧化活性,隨著多酚濃度的升高,抗氧化能力越強(qiáng);閆懷峰等[5]采用溶劑法提取甘蔗皮中的花色苷,并用輔色劑對(duì)花色苷的輔色作用進(jìn)行了研究。植物多糖含有大量的細(xì)胞壁多糖,采用適當(dāng)濃度的堿溶液可從熱水浸提的殘?jiān)欣^續(xù)提取出細(xì)胞壁結(jié)合多糖,使不溶性多糖轉(zhuǎn)化為可溶性多糖,從而提高多糖得率。田洛等[6]采用堿提取法提取黃芪多糖,黃芪多糖的提取率達(dá)到水提取法的3.25倍。此外,研究表明堿性溶液提取的多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒和抗衰老等多種生物活性。焦中高等[7]研究表明,堿提紅棗多糖是一種優(yōu)良的自由基清除劑和α-葡萄糖苷酶及透明質(zhì)酸酶抑制劑,利用堿提工藝可提高紅棗資源的利用率,并獲得高活性的紅棗多糖?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前,甘蔗皮水溶性多糖、黃酮、多酚和花色苷有一些研究,但堿溶液提取甘蔗皮多糖的提取工藝條件、結(jié)構(gòu)表征及其生物活性尚鮮有報(bào)道,堿提甘蔗皮多糖的得率、構(gòu)效關(guān)系有待研究?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以甘蔗皮為原料,利用單因素、響應(yīng)面試驗(yàn)確定堿提甘蔗皮多糖的最佳提取工藝;綜合運(yùn)用GC-MS、FT-IR等現(xiàn)代儀器分析技術(shù)對(duì)堿提甘蔗皮多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征;并以體外α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo),評(píng)價(jià)堿提甘蔗皮多糖降血糖效果,旨在為甘蔗皮多糖在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)加工等領(lǐng)域的綜合利用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        試驗(yàn)于 2019—2020年在天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院進(jìn)行。

        1.1 材料與試劑

        黑皮甘蔗,購(gòu)自海南省三亞市,保存于實(shí)驗(yàn)室。單糖標(biāo)準(zhǔn)品(L-鼠李糖,D-阿拉伯糖,D-木糖,D-甘露糖,D-葡萄糖,D-半乳糖)、α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖水合物、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖糖苷(4-Nitrophenylβ-D-glucopyranoside)購(gòu)自美國(guó) Sigma公司;葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(T-10、T-40、T-70、T-110、T-500、T-2000)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;試驗(yàn)用其他有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Agilent-1260 infinity Ⅱ高效液相色譜系統(tǒng),美國(guó)安捷倫公司;Scion TQ氣相色譜-質(zhì)譜儀,美國(guó)布魯克公司;IS 50傅里葉紅外光譜儀,美國(guó)尼高力儀器公司;SP-2102UV紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司;RE-52AA真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;TGL-16B臺(tái)式離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠。

        1.3 方法

        1.3.1 堿提甘蔗皮多糖的提取工藝 甘蔗→清洗后去皮→烘干→粉碎→過(guò)篩→稱取粉末→氫氧化鈉堿溶液提取→多糖浸提液→濃縮→乙醇沉淀→離心→甘蔗皮粗多糖→除蛋白→除色素→堿提甘蔗皮多糖。

        1.3.2 操作要點(diǎn) 將新鮮的甘蔗清洗干凈后去皮,置于60℃烘箱內(nèi)烘干。使用粉碎機(jī)將甘蔗皮粉碎,過(guò)60目篩,備用。精確稱取甘蔗皮粉末1.00 g,按照料液比1﹕50(g·mL-1)加入6%氫氧化鈉溶液,于35℃恒溫水浴提取1 h,沉淀物重復(fù)以上操作2次,于4 000 r/min離心15 min后,加入HCl溶液調(diào)節(jié)至pH 7.0,收集上清液,即多糖浸提液。將上清液在60℃條件下濃縮至一定體積后,按照1﹕4(v﹕v)的比例加入無(wú)水乙醇,4℃醇沉靜置過(guò)夜。4 000 r/min離心15 min后收集沉淀,得到堿提甘蔗皮粗多糖[8]。粗多糖采用Sevge法除蛋白、AB-8樹(shù)脂除色素進(jìn)行純化[9],冷凍干燥后,得到精制的堿提甘蔗皮多糖,命名為SPAP。

        1.3.3 堿提甘蔗皮多糖提取單因素試驗(yàn)

        (1)提取溫度對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響

        稱取甘蔗皮粉末1.00 g,按照氫氧化鈉濃度2%,料液比1﹕30(g·mL-1),提取時(shí)間1 h,提取次數(shù)1次,考察不同提取溫度(15、25、35、45和55℃)對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響。

        (2)NaOH溶液濃度對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響

        稱取甘蔗皮粉末1.00 g,按照提取溫度35℃,料液比1﹕30(g·mL-1),提取時(shí)間1 h,提取次數(shù)1次,考察不同NaOH濃度(2%、4%、6%、8%和10%)對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響。

        (3)料液比對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響

        稱取甘蔗皮粉末1.00 g,按照提取溫度35℃,氫氧化鈉濃度6%,提取時(shí)間1 h,提取次數(shù)1次,考察不同料液比(1﹕20、1﹕30、1﹕40、1﹕50和1﹕60 g·mL-1)對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響。

        (4)提取時(shí)間對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響

        稱取甘蔗皮粉末1.00 g,按照提取溫度35℃,氫氧化鈉濃度6%,料液比1﹕50(g·mL-1),提取次數(shù)1次,考察不同提取時(shí)間(1、1.5、2、2.5和3 h)對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響。

        (5)提取次數(shù)對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響

        稱取甘蔗皮粉末1.00 g,按照提取溫度35℃,氫氧化鈉濃度6%,料液比1﹕50(g·mL-1),提取時(shí)間1 h,考察不同提取次數(shù)(1、2、3、4和5 次)對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響。

        1.3.4 堿提甘蔗皮多糖Box-Behnken中心組合試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)原理,選取提取溫度、NaOH濃度、料液比、提取次數(shù)4個(gè)因素為自變量,以堿提甘蔗皮多糖得率為響應(yīng)值,運(yùn)用Design Expert 8.0.7軟件對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì),對(duì)堿提甘蔗皮多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。Box-Behnken中心組合試驗(yàn)各因素及水平見(jiàn)表1。

        表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

        1.3.5 堿提甘蔗皮多糖基本成分的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[10]測(cè)定堿提甘蔗皮多糖中性糖的含量,分別精確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(0.1 mg·mL-1)0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL置于具塞試管中,加入蒸餾水補(bǔ)足至1 mL;然后加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的苯酚溶液,再依次垂直滴加5 mL濃硫酸,用渦旋混合儀充分振蕩混合,常溫靜置15 min至冷卻,在λ=490 nm處測(cè)定其吸光度值。經(jīng)回歸分析得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.0411x+0.0064,R2=0.9992(其中,y代表吸光度,x代表葡萄糖濃度)。采用硫酸-咔唑法[11]測(cè)定堿提甘蔗皮多糖糖醛酸的含量,分別精確吸取半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液(0.1 mg·mL-1)0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL置于10 mL具塞試管中,加入蒸餾水補(bǔ)足至1 mL;在冰水浴中向各管加入5 mL硼砂-硫酸溶液,混勻后沸水浴中加熱5 min,取出后冷卻至室溫;再加入 0.1%咔唑溶液 0.2 mL,渦旋30 s,沸水浴5 min,冷卻后測(cè)定各管在523 nm處的吸光度。經(jīng)回歸分析得到半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=8.5169x-0.0097,R2=0.9990(其中,y代表吸光度,x代表半乳糖醛酸濃度)。分別根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算中性糖及糖醛酸含量,多糖提取得率按照公式計(jì)算:

        式中:m為堿提甘蔗皮粗多糖質(zhì)量(g),M為甘蔗皮粉末質(zhì)量(g)。

        1.3.6 堿提甘蔗皮多糖結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分析

        1.3.6.1 堿提甘蔗皮多糖的含量測(cè)定 精確稱取精制后的堿提甘蔗皮多糖,將其配成濃度為 1 mg·mL-1的溶液,按照1.3.5中所述方法測(cè)定并計(jì)算堿提甘蔗皮多糖的含量。

        1.3.6.2 堿提甘蔗皮多糖的純度鑒定 將精制后的多糖用蒸餾水溶解配制成濃度為1 mg·mL-1的溶液,利用紫外分光光度計(jì)(SP-2102UV)在波長(zhǎng)為 190—400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

        1.3.6.3 堿提甘蔗皮多糖分子量分布的測(cè)定(HPLC)采用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)對(duì)多糖樣品分子量進(jìn)行測(cè)定[12]。精確稱取樣品2 mg溶于1 mL超純水,過(guò)水膜后,取20 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析。色譜條件:色譜柱:TSK gel G4000 PWXL column(7.8 mm×300 mm);檢測(cè)器:折射率檢測(cè)器(RID);流動(dòng)相:超純水;流速:0.6 mL·min-1;柱溫:35℃。以葡聚糖T-2000、T-500、T-110、T-70、T-40和T-10(分子量分別為 2 000 000、500 000、110 000、70 000、40 000和10 000 Da)為標(biāo)準(zhǔn)品,根據(jù)分子量及保留時(shí)間繪制分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.3.6.4 堿提甘蔗皮多糖的紅外光譜分析(FT-IR)將干燥的多糖樣品1 mg與干燥的KBr 150 mg混合,研磨均勻后利用壓片機(jī)將其壓成透明薄片。利用傅里葉變換紅外光譜儀(Thermo Nicolet Corporation,USA)進(jìn)行掃描[13]。掃描范圍:400—4 000 cm-1,分辨率:4 cm-1,掃描次數(shù):16。

        1.3.6.5 堿提甘蔗皮多糖的單糖組成分析 堿提甘蔗皮多糖的單糖組成參考ZHANG等[14]的氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)測(cè)定。稱取樣品(5 mg)置于具塞試管中,用2 mL 2.0 mol·L-1TFA(三氟乙酸)在110℃水解 3 h。水解后,向全水解樣品中加入鹽酸羥胺(10 mg),內(nèi)標(biāo)物肌醇六乙酸酯(2 mg)和吡啶(0.5 mL),振蕩均勻后,于90℃油浴鍋中反應(yīng)30 min。冷卻后,繼續(xù)加入醋酸酐(0.5 mL)于90℃油浴下反應(yīng)30 min。得到的糖精乙酸酯衍生物用N2吹干,加入1 mL二氯甲烷重新溶解,取0.2 μL進(jìn)行氣質(zhì)色譜分析。色譜條件:色譜柱:HP-5MS(30 mm×0.25 mm×0.25 μm);檢測(cè)器:氫火焰電離檢測(cè)器(FID);載氣:N2;流速1.0 mL·min-1;程序升溫:100℃保持 2 min→260℃(10℃·min-1)→260℃保持3 min。6種單糖(L-鼠李糖,D-阿拉伯糖,D-木糖,D-甘露糖,D-葡萄糖,D-半乳糖)處理方式同上。

        1.3.7 堿提甘蔗皮多糖的α-葡萄糖苷酶抑制作用α-葡萄糖苷酶抑制活性的反應(yīng)體系參照 LIU等[15]的方法,并略作改進(jìn)。分別配制 0.1 moL·L-1磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(pH 6.8)、0.6252 mmoL·L-1PNPG 溶液(PBS 溶解)、1 U·mL-1α-葡萄糖苷酶酶液(PBS溶解)以及 0.1 moL·L-1Na2CO3溶液(PBS溶解);待測(cè)樣品用蒸餾水溶解,采用倍比稀釋法稀釋至濃度為4、2、1、0.5、0.25和0.125 mg·mL-1的待測(cè)液。用阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照,同樣將濃度稀釋為 4、2、1、0.5、0.25 和 0.125 mg·mL-1。取40 μL的樣品,加入到96孔板中,然后加入40 μL的酶液(1 U·L-1),混勻,于37℃黑暗中孵育10 min,加入20 μL的PNPG溶液,于37℃黑暗中孵育 30 min,最后加入 0.1 moL·L-1Na2CO3溶液100 μL結(jié)束反應(yīng),于410 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值,每組做3個(gè)平行。按照公式計(jì)算抑制率,溶液具體加入量見(jiàn)表2。

        表2 堿提甘蔗皮多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Experimental design of polysaccharide with alkaline-extracted from sugarcane peel on α-Glucosidase inhibition

        1.4 數(shù)據(jù)分析

        每組試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Design Expert 8.0.7軟件對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)分析、Origin 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與作圖,并利用SPSS 20.0軟件中的Duncan法進(jìn)行方差分析,以P<0.05表示顯著性差異。

        2 結(jié)果

        2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

        2.1.1 提取溫度對(duì)甘蔗皮多糖提取的影響 不同提取溫度對(duì)堿提甘蔗皮多糖得率的影響如圖1所示,當(dāng)溫度在15—35℃,堿提甘蔗皮多糖得率隨著溫度升高而增加;當(dāng)提取溫度為35℃時(shí),多糖得率達(dá)到最大值5.86%;當(dāng)溫度超過(guò)35℃后,多糖得率反而下降。一定程度上升高提取溫度會(huì)增加樣品多糖的溶出,提高多糖得率,但是過(guò)高的提取溫度可能會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu),致使多糖得率低[16]。因此,選擇提取溫度為35℃。

        2.1.2 NaOH濃度對(duì)堿提甘蔗皮多糖得率的影響 堿液濃度在2%—6%時(shí),堿提甘蔗皮多糖得率隨堿液濃度升高而增加;當(dāng)NaOH濃度超過(guò)6%后,堿提甘蔗皮多糖得率反而下降,可能堿液濃度過(guò)高會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)[17];當(dāng)NaOH濃度為6%時(shí),其多糖得率最高為6.82%(圖2)。綜合考慮各項(xiàng)因素,選擇NaOH濃度為6%效果最佳。

        2.1.3 料液比對(duì)堿提甘蔗皮多糖得率的影響 隨著料液比的增加,在 1﹕20—1﹕40(g·mL-1)范圍內(nèi),堿提甘蔗皮多糖得率呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。當(dāng)料液比過(guò)低時(shí),溶液多黏稠狀,細(xì)胞空化不完全,導(dǎo)致多糖提取不徹底;當(dāng)料液比過(guò)高時(shí),會(huì)使得溶液體積過(guò)大,不易后續(xù)的分離操作并且浪費(fèi)資源[18-19]。當(dāng)料液比為1﹕50(g·mL-1)時(shí),堿提甘蔗皮多糖得率出現(xiàn)峰值為6.82%(圖 3)。因此,選取料液比為 1﹕50(g·mL-1)最合適。

        2.1.4 提取時(shí)間對(duì)堿提甘蔗皮多糖得率的影響 在1.0—3.0 h內(nèi),隨著提取時(shí)間的增加,曲線呈現(xiàn)一條直線,波動(dòng)較小,表明堿提甘蔗皮多糖得率基本不變,多糖得率約為7.5%(圖4)。其他條件一定,綜合考慮成本、資源利用等因素[20],選擇提取時(shí)間為1 h。

        2.1.5 提取次數(shù)對(duì)堿提甘蔗皮多糖得率的影響 提取次數(shù)為1—4次時(shí),堿提甘蔗皮多糖得率與提取次數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān);當(dāng)提取次數(shù)為 4次時(shí),多糖得率達(dá)到10.96%;當(dāng)提取次數(shù)大于4次,隨著提取次數(shù)的增加,多糖得率沒(méi)有顯著性變化(圖5)。因此,提取次數(shù)4次最優(yōu)。

        2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化堿提甘蔗皮多糖提取工藝

        2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取提取溫度(A)、NaOH濃度(B)、料液比(C)、提取次數(shù)(D)為自變量,以甘蔗皮堿提多糖得率為響應(yīng)值(Y),設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)方法,共包括29組試驗(yàn)方案,結(jié)果見(jiàn)表3。

        表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

        2.2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及數(shù)值分析 利用Design Expert軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,得到堿提甘蔗皮多糖提取率的回歸方程:

        Y=10.87+0.093A-0.066B+0.042C+0.076D+0.037AB+(2.500E-003)AC+0.083AD+0.20BC-0.30BD+ 0.012CD-0.11A2-0.15B2-0.11C2-0.28D2

        由表 4可見(jiàn)該模型顯著(P<0.0001),失擬項(xiàng)P=0.0641>0.05,不顯著。R2=0.9048,表明90%的數(shù)據(jù)可以用這個(gè)方程解釋。各因素影響堿提甘蔗皮多糖得率的主次順序?yàn)?A>D>B>C,即提取溫度>提取次數(shù)>NaOH濃度>料液比。失擬項(xiàng)各項(xiàng)數(shù)據(jù)分析表明該模型失擬不顯著,因此該二次方程能夠較好地?cái)M合真實(shí)的響應(yīng)面。另外,由表4和圖6分析可知,交互因素中,BC、BD 交互作用顯著,A2、B2、C2和D2均達(dá)到顯著。經(jīng)軟件預(yù)測(cè)分析得到堿提甘蔗皮多糖得率的最佳條件為:提取溫度 37.52℃,NaOH濃度5%、料液比為46.69 mL·g-1,提取次數(shù)為4.72次,因此,為避免資源浪費(fèi)以及實(shí)際試驗(yàn)操作的方便,將堿提甘蔗皮多糖得率的最佳條件修改為提取溫度37℃,NaOH濃度5%、料液比為46 mL·g-1,提取次數(shù)為 4次,相應(yīng)提取液中甘蔗皮多糖含量為10.98 mg·g-1。在修正后的最佳條件下重復(fù)3次平行試驗(yàn),得到甘蔗皮多糖含量平均值為10.84%,與模型預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為1.28%,說(shuō)明模型預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)實(shí)際值符合度較高,該回歸模型參數(shù)合理,能真實(shí)反映各因素對(duì)堿提甘蔗皮多糖得率的影響。

        表4 方差表分析Table 4 Analysis of variance table

        2.3 堿提甘蔗皮多糖的結(jié)構(gòu)表征

        2.3.1 堿提甘蔗皮多糖的分子量測(cè)定 采用高效凝膠滲透色譜法和高效液相色譜法對(duì)多糖的分子量分布進(jìn)行檢測(cè)。以保留時(shí)間為橫坐標(biāo),分子質(zhì)量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),得到以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程y=-0.3395x+9.2104(y=lgMw,x=Rt),R2=0.9953。如圖7所示,經(jīng)除色素、除蛋白后的堿提甘蔗皮多糖高效液相色譜圖為單一峰,說(shuō)明分子量相對(duì)均勻[21]。經(jīng)檢測(cè),SPAP中性糖含量為(86.54±0.98)%,糖醛酸含量為(2.82±0.28)%。將多糖的出峰時(shí)間(t=8.039 min)代入回歸方程,計(jì)算得 SPAP的分子量為 3.03×103kD。張斌[22]研究表明,甘蔗滓水提多糖主要由兩個(gè)組分組成,分子量分別為1.93×104Da和7.523×103Da,這些差異表明甘蔗不同部位及不同提取方式等會(huì)引起多糖間分子量的極大差異。

        2.3.2 多糖純度的鑒定 堿提甘蔗皮多糖 SPAP的紫外-可見(jiàn)光全波長(zhǎng)掃描結(jié)果如圖8所示,SPAP在260和280 nm處基本無(wú)吸收峰,表明多糖中基本不含蛋白和核酸[23]。

        2.3.3 單糖組成分析 SPAP經(jīng)TFA降解,吡啶和乙酸酐衍生化后進(jìn)行GC-MS分析。如圖9所示,混標(biāo)中1—7的出峰順序依次代表鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和內(nèi)標(biāo)肌醇六乙酸酯。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間對(duì)堿提甘蔗皮多糖水解樣品中的色譜峰進(jìn)行定位,并按照mi=Ai·ms·f/As公式計(jì)算樣品中各單糖的含量及比例(Ai、As分別代表待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積;mi、ms分別代表待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量;f為相對(duì)校正因子,計(jì)算公式:f=(m0/As)/(mi/A0),A0為標(biāo)準(zhǔn)單糖的峰面積,m0為標(biāo)準(zhǔn)單糖組分的質(zhì)量和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量)[24]。從圖中可以看出,SPAP主要由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖組成,其中木糖為主要成分。經(jīng)計(jì)算,SPAP中鼠李糖﹕阿拉伯糖﹕木糖﹕甘露糖﹕葡萄糖﹕半乳糖的摩爾比為0.47﹕5.75﹕15.47﹕1.00﹕3.22﹕2.32。

        2.3.4 堿提甘蔗皮多糖的紅外光譜分析 采用 KBr壓片法對(duì)SPAP進(jìn)行FT-IR分析,在4 000—450 cm-1范圍內(nèi)的紅外光譜如圖10所示。在3 404.708 cm-1處有一寬峰,是多糖特征的-OH和水的O-H鍵之間的伸縮振動(dòng)引起;2 920.663 cm-1處為C-H伸縮振動(dòng)[25];1 632.447 cm-1處有一強(qiáng)吸收峰,是由-COOH或-CO基團(tuán)的C=O非對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起,表示含有醛基-CHO,一般糖分子結(jié)合水在此區(qū)域都有吸收峰[26];1 420.798 cm-1周圍的吸收峰是C-H的變角振動(dòng),以上4處為多糖的特征吸收峰[27]。1 152.741 cm-1、1 072.710 cm-1、1 043.783 cm-13處特征吸收峰表明SPAP中含有吡喃型糖苷鍵,可能存在α-(1→6)糖苷鍵;897 cm-1附近的吸收峰表示SPAP中存在β型糖苷鍵[28]。FT-IR結(jié)果表明,SPAP中的單糖是吡喃糖基型,可呈現(xiàn)α或β構(gòu)型。

        2.4 堿提甘蔗皮多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

        當(dāng)樣品濃度由 0.125 mg·mL-1增加到 4.00 mg·mL-1,抑制率由28.52%上升至78.31%,抑制曲線呈現(xiàn)先上升后逐漸平緩的趨勢(shì),說(shuō)明SPAP對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用存在劑量依賴性。與陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖相比,樣品SPAP雖不及阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率,但在 4.00 mg·mL-1時(shí),抑制率達(dá)到78.31%,有較好的抑制作用(圖11)。IC50值越低,說(shuō)明樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用越好,經(jīng)計(jì)算,阿卡波糖的IC50為0.178 mg·mL-1,堿提甘蔗皮多糖的IC50為0.3 mg·mL-1,SPAP的 IC50值略高于陽(yáng)性對(duì)照。以上結(jié)果說(shuō)明,堿提甘蔗皮多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶具有良好的抑制作用。

        3 討論

        據(jù)研究,多糖的提取工藝主要有超聲解法、酶解法及水提醇沉解法等[29-30]。堿解法是一項(xiàng)經(jīng)驗(yàn)成熟的多糖提取方法,能夠準(zhǔn)確、快速及穩(wěn)定地提取多糖。此外,堿性溶液提取可以使細(xì)胞壁結(jié)合多糖更好地轉(zhuǎn)化為可溶性多糖,該方法不僅可以提高多糖提取得率、縮短反應(yīng)時(shí)間,而且提取方法簡(jiǎn)便、設(shè)備要求低、原料可再利用,有利于生產(chǎn)。本研究采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化堿提甘蔗皮多糖提取工藝,得到堿提甘蔗皮多糖最佳提取工藝。張斌[22]研究表明,甘蔗滓經(jīng)過(guò)脫脂、水提醇沉、Sevag法脫蛋白和透析后,得到甘蔗滓多糖的提取率為1.02%。肖亞聰[31]通過(guò)水提法、纖維素酶解法、木瓜蛋白酶解法、混合酶-超聲聯(lián)合法等不同提取方法提取甘蔗渣多糖發(fā)現(xiàn),不同提取方法的多糖提取率有較大的差異,整體水平上看酶解-超聲聯(lián)合法都比單種酶酶解多糖提取率要高,酶解-超聲聯(lián)合法平均提取率約在 8%。本研究采用堿提多糖工藝方法與水提、酶解等提取方法相比,甘蔗皮多糖提取得率顯著提高,該工藝參數(shù)下,原料綜合利用率高,同時(shí)可有效提高產(chǎn)出和效率。

        近年來(lái),多糖由于其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性而備受關(guān)注[32]。據(jù)報(bào)道,許多堿性溶液多糖具有各種有用的生物學(xué)功能,例如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫活性和降血糖作用[33-36]。多糖的生物活性可能與結(jié)構(gòu)特征有關(guān)[37],例如單糖組成及分子量分布。LI等[38]闡述了多糖的功能活性與分子量、單糖組成等幾個(gè)參數(shù)的綜合效應(yīng)有關(guān)。低分子量南瓜多糖具有較好的體外降血糖作用,原因可能是低分子量南瓜多糖中含有半乳糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸,可以有效增強(qiáng)多糖與α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的結(jié)合。堿提甘蔗皮多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的雜多糖,其中木糖為主要成分。已有研究證實(shí),含有更多阿拉伯糖或木糖殘基的多糖對(duì)α-葡糖苷酶表現(xiàn)出顯著的抑制作用。ZHANG等[14]用 5%NaOH溶液從甘草殘?jiān)刑崛?、分離、純化出一種中性多糖,該多糖由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖組成,其中木糖含量最高,且對(duì)α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出一定的抑制活性,與本研究結(jié)果一致。呂青青等[39]從麥麩獲得兩種多糖級(jí)分(WXA-1和 AXA-1),與 WXA-1相比,AXA-1的阿拉伯糖和木糖含量更高,這些原因可能導(dǎo)致AXA-1 比WXA-1具有更高的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性。上述結(jié)果表明,木糖可能對(duì)α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的抑制作用。但堿提甘蔗皮多糖糖苷鍵連接方式等結(jié)構(gòu)特性與生物活性之間的關(guān)系及機(jī)理機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

        4 結(jié)論

        堿提甘蔗皮多糖(SPAP)的最佳提取條件為提取溫度37℃、NaOH濃度5%、料液比1﹕46(g·mL-1)、提取次數(shù)4次,可有效利用原料、提高產(chǎn)出和效率;由 HPLC、FT-IR、GC-MS等方面初步闡述了 SPAP的結(jié)構(gòu)特性,同時(shí)SPAP對(duì)α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出良好的抑制作用,具有一定的降糖潛力。

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