崔一芳，鄭敏，丁雙陽，朱奎?

1北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100097；2中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/國家獸藥安全評價中心，北京 100193

蠟樣芽孢桿菌是一種在自然環(huán)境中廣泛分布，可產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陽性桿菌。致病性蠟樣芽孢桿菌可產(chǎn)生多種毒素，是引起食物中毒的常見食源性條件致病菌之一[1]。致吐毒素cereulide是蠟樣芽孢桿菌分泌的主要毒素之一，能夠引發(fā)以惡心和嘔吐為主要臨床癥狀的食物中毒，嚴(yán)重的可導(dǎo)致急性肝臟衰竭、肝性腦病，并致死[2-4]。由cereulide引起的食物中毒癥狀因與金黃色葡萄球菌腸毒素導(dǎo)致的臨床癥狀相似，且癥狀輕微、病程較短，因而被低估和忽視[5]。實際上，美國報告了 1998—2008年，由蠟樣芽孢桿菌引發(fā)了235起食源性疾病[6]。法國統(tǒng)計了2007—2014年發(fā)生的140起食源性疾病，其中74起與蠟樣芽孢桿菌相關(guān)，是僅次于金黃色葡萄球菌的第二大常見食源性病原菌，并且產(chǎn)生 cereulide的蠟樣芽孢桿菌檢出率為16%[7]。同樣德國2007—2013年食源性疾病的調(diào)查結(jié)果顯示，產(chǎn)cereulide的蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒風(fēng)險被低估[8]。目前對于cereulide的毒性作用機制研究局限于其刺激傳入迷走神經(jīng)引起嘔吐癥狀，以及作為鉀離子載體，誘導(dǎo)線粒體膜電位喪失，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]，而對于其導(dǎo)致的嚴(yán)重肝臟和腦部病變的毒性作用機制研究仍十分不足。

另一方面，cereulide是由非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide-synthetase, NRPS）系統(tǒng)控制合成的一種親脂性小分子十二環(huán)肽，結(jié)構(gòu)性質(zhì)十分穩(wěn)定，并受基因及多種調(diào)節(jié)因子控制[1]。當(dāng)前對于cereulide導(dǎo)致的食物中毒癥狀并沒有良好的預(yù)防和治療方法[10-11]，一般采用添加防腐劑抑制蠟樣芽孢桿菌生長的方法保障食品安全，但cereulide可在菌株被抑制前合成，并且一旦產(chǎn)生就難以被消除[12]，因此缺乏針對cereulide的有效防控策略。此外，目前對于cereulide的生物合成過程，如合成基因簇各結(jié)構(gòu)域功能和調(diào)節(jié)因子的具體作用均不夠明確。

值得注意的是，部分蠟樣芽孢桿菌作為益生菌被廣泛應(yīng)用于人類醫(yī)療保健、畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)環(huán)境等多個領(lǐng)域[13]。例如，美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）和飼料工業(yè)協(xié)會（American Feed Industry Association, AFIA）在1989年就批準(zhǔn)了蠟樣芽孢桿菌可作為直接應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)的菌種之一[14]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 1996年也正式批準(zhǔn)蠟樣芽孢桿菌可作為飼料級微生物添加劑的菌種之一[15]。盡管目前益生菌的總體使用記錄顯示出較令人滿意的安全性結(jié)果，但相對于其應(yīng)用的廣泛度來說，益生菌的安全性并未受到充分鑒定[16]。例如，本團隊前期對益生芽孢桿菌的毒性和耐藥性進行了系統(tǒng)評估，發(fā)現(xiàn)菌株可產(chǎn)生多種毒素，其中便包括 cereulide[17-18]。此外，詳細(xì)綜述了蠟樣芽孢桿菌可能產(chǎn)生的多種毒素，包括毒素特征、毒性作用、合成機制及檢測方法，評估其對蠟樣芽孢桿菌作為益生菌使用的潛在危害[19]。

本綜述旨在針對蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的主要毒素cereulide，整理其毒性作用機制研究進展，為進一步研發(fā)cereulide防控措施提供科學(xué)依據(jù)；總結(jié)并提出其生物合成機理，對其關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域在合成過程中的功能進行了補充，為闡明類似結(jié)構(gòu)的非核糖體肽合成提供新的思路。

1 Cereulide的毒性特征

Cereulide是一種由兩個羥基酸和兩個氨基酸殘基[-D-HIC-D-Ala-L-HIV-L-Val-]經(jīng) 3次重復(fù)組成的三聚體環(huán)狀縮酚酞，分子量約為1 152 Da[20-21]。cereulide的環(huán)狀結(jié)構(gòu)外部為脂溶性，能夠與細(xì)胞膜結(jié)合；內(nèi)部為親水性，中間存在容納鉀離子的腔隙，可進行鉀離子的跨膜轉(zhuǎn)運[9]。cereulide是目前已知最強的鉀離子螯合劑，對動物和人體細(xì)胞具有普遍的毒性作用[22]。此外，cereulide性質(zhì)十分穩(wěn)定，能夠耐高溫、耐酸堿，對各種蛋白酶水解作用都有一定的抵抗力，經(jīng)過食品加工或者胃腸道消化仍可保持活性[23-24]。例如，cereulide在121℃處理2 h后仍可保持生物活性，并對pH 2.0至 pH 11.0的環(huán)境耐受[25]。研究表明，滅活cereulide不僅需要高溫處理，還依賴于pH條件，如在pH 9.5的條件下，滅活6 μg·mL-1cereulide需在121℃暴露80min或在150℃暴露60 min[26]。

目前統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中僅有1%—2%的蠟樣芽孢桿菌菌株會產(chǎn)生cereulide[27]，但在食品和臨床樣本中產(chǎn)cereulide菌株的流行率卻高達(dá)32.8%[8]。產(chǎn)cereulide的菌株通常存在于淀粉類食物如米飯和面食中，在蔬菜、水果、奶酪和肉類產(chǎn)品中也可分離到。此外，在植物根部、種子和昆蟲的腸道也發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)cereulide菌株[28]。因此，產(chǎn) cereulide菌株的廣泛流行，加之cereulide的穩(wěn)定性質(zhì)都對食品安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。

Cereulide通常引起惡心和嘔吐的臨床癥狀，癥狀一般在攝入cereulide污染的食物后0.5—6 h內(nèi)出現(xiàn)，持續(xù)24 h后可自愈[19,29]。目前研究認(rèn)為，cereulide通過與胃腸道內(nèi)分布的5-HT3受體結(jié)合，刺激迷走神經(jīng)進而引發(fā)嘔吐癥狀（圖 1-A）[30]。10 μg·kg-1的 cereulide即可誘導(dǎo)恒河猴出現(xiàn)嘔吐癥狀[31]，而人的誘導(dǎo)劑量目前尚不清楚。一般來說，cereulide常以中低濃度水平暴露于食物中，有研究發(fā)現(xiàn)在餐館隨機收集的米飯樣本中，cereulide的檢出率為7.4%，平均濃度為4 ng·g-1[32]。但也有食物中低劑量cereulide（0.01—1.28 ng·g-1）導(dǎo)致食物中毒事件的報道，即體重70 kg的成年人攝入100 g此類食物便會出現(xiàn)嘔吐癥狀[33]。因此，低劑量的cereulide雖然不會立即引起嘔吐反應(yīng)，但由于容易被忽視導(dǎo)致消費者或反復(fù)暴露于亞致吐劑量，長期可能會對健康產(chǎn)生影響。

Cereulide還可導(dǎo)致人的急性肝功能衰竭、心臟衰竭和腦部水腫等癥狀，嚴(yán)重的可致人死亡[4]，但目前這些毒性作用機制都尚未研究清楚。當(dāng)前對于cereulide的毒性作用機制研究多集中于細(xì)胞毒性作用，如研究表明cereulide對多種哺乳動物細(xì)胞具有損傷作用[34]。cereulide可以使人喉癌細(xì)胞HEp2和人肝癌細(xì)胞 HepG2細(xì)胞空泡化和線粒體損傷[35-36]；cereulide可導(dǎo)致人結(jié)腸腺癌細(xì)胞CaCo2、人肺腺癌細(xì)胞 Calu3、宮頸癌細(xì)胞 HeLa以及成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞Paju的損傷[37]；還能抑制NK細(xì)胞，降低免疫力[35]；低濃度的cereulide會誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡，這與糖尿病的發(fā)生密不可分[34,38]。最近，研究報道了cereulide對 Caco2和HepG2細(xì)胞中線粒體的影響，特別是在HepG2細(xì)胞系中，低劑量的cereulide可以完全抑制線粒體的呼吸作用（圖1-B）[36,39]。

此外，本團隊前期研究分析了cereulide在兔體內(nèi)的毒代動力學(xué)規(guī)律，cereulide在體內(nèi)的消除半衰期為（10.8±9.1）h[40]，消除半衰期短解釋了cereulide引起短暫的嘔吐癥狀并一般為自限性的臨床特征，但其毒性的分子作用機制仍需進一步探索。

2 Cereulide的生物合成特征

NRPS合成系統(tǒng)是一種大型的模塊化多酶復(fù)合物，參與多種天然產(chǎn)物的生物合成，如抗生素、表面活性劑和毒素[41]。其生物合成途徑可分為3類：線性（圖2-A），迭代型（圖2-B）和非線性（圖2-C）[42]，其中模塊數(shù)量和順序與產(chǎn)物肽中氨基酸的數(shù)量和順序相匹配，并且各個模塊通過催化反應(yīng)與保守結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，以定向方式將單體結(jié)合到天然產(chǎn)物肽中，從而確定最終產(chǎn)物的化學(xué)特性。其中腺苷酸化（adenylation, A）結(jié)構(gòu)域，肽基載體蛋白（peptide carrier protein, PCP）或硫醇化（thiolation, T）結(jié)構(gòu)域、縮合（Ccondensation, C）結(jié)構(gòu)域以及硫酯酶（thioesterase, TE）結(jié)構(gòu)域是NRPS合成的基本功能單元。合成過程一般為：首先，A域通過腺苷酸化作用特異性識別底物并激活合成前體；其次，PCP域負(fù)責(zé)攜帶不斷增長的天然產(chǎn)物鏈在每個模塊間穿梭，以此不斷催化肽鏈延伸；C域一般位于模塊末端，通過形成酰胺鍵或酯鍵催化鏈增長；最后，一旦非核糖體肽的合成完成，成熟的肽鏈將被轉(zhuǎn)移到NRPS末端的TE域，通過水解釋放線性肽，或通過分子內(nèi)親核攻擊形成環(huán)狀肽[43]。

Cereulide是NRPS迭代型合成途徑的典型產(chǎn)物，由ces基因簇（cereulide synthetase gene cluster）控制合成[44]。ces基因簇位于大小約270 kb的質(zhì)粒上，該質(zhì)粒與炭疽芽孢桿菌的毒力質(zhì)粒 pXO1具有高度相似性[45]。ces基因簇包括cesH、cesP、cesT、cesA、cesB、cesC和cesD等7個主要編碼區(qū)。cesA和cesB是典型的NRPS系列基因，負(fù)責(zé)cereulide肽鏈結(jié)構(gòu)的組裝；cesP是4'-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶基因，對于激活cereulide合成系統(tǒng)至關(guān)重要；cesT推測為II型硫酯酶基因，可以去除引發(fā)錯誤的單體；此外，cesH位于5'末端，推定為編碼水解酶的基因；cesC/D位于3'端，推測為編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白的基因（圖3-B）[46-47]。

ces基因簇的轉(zhuǎn)錄是在細(xì)菌對數(shù)生長晚期開始，并在轉(zhuǎn)變至穩(wěn)定期后迅速關(guān)閉[48]。這種嚴(yán)格的時間調(diào)控是依賴于如AbrB、Spo0A和CodY等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子實現(xiàn)的。在蠟樣芽孢桿菌中，AbrB和Spo0A調(diào)節(jié)子與芽孢的形成相關(guān)，而 CodY的功能是調(diào)節(jié)細(xì)菌染色體與ces基因簇所在質(zhì)粒間的信號傳導(dǎo)，進一步將細(xì)胞的營養(yǎng)和能量狀態(tài)與致病性聯(lián)系起來[49]。cereulide的合成除受細(xì)菌內(nèi)部基因調(diào)控之外，還受所在環(huán)境因素的影響。例如，蠟樣芽孢桿菌合成cereulide的最適溫度為20—30 ℃，并且依賴氧氣的存在，有研究表明在氧濃度低于1%—2%的條件下，菌株將不會產(chǎn)生cereulide[28]。此外，營養(yǎng)條件、pH、濕度和NaCl等因素都會影響cereulide的產(chǎn)生[50-51]，但這些外部信號如何被細(xì)菌感知，轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)節(jié)cereulide的合成過程這些問題均未闡明。

3 Cereulide的生物合成過程

隨著近年來對NRPS合成天然產(chǎn)物的研究增多，cereulide的生物合成過程也得到了進一步探索。MAGARVEY等提出ces-NRPS識別的底物并不全是氨基酸，酮酸也是識別底物之一，例如CesA1的A結(jié)構(gòu)域識別的是 α-酮基羧酸（D-α-ketocarboxylic acids,KIC），CesB1識別的底物為 α-酮異戊酸（L-αketoisovaleric acid, KIV），并提出了酮還原酶（KR）結(jié)構(gòu)域的作用[20]。此外，有研究提出了關(guān)于cereulide生物合成的新概念，即二肽是形成cereulide肽鏈的基礎(chǔ)單元，而不是單個氨基酸或羥基酸作為組裝的基本模塊[52]。并將CesA末端的縮合結(jié)構(gòu)域描述為C*域，該結(jié)構(gòu)域的功能是酯合酶而不是酰胺合酶，推測其在cereulide肽鏈的最終環(huán)化過程中與TE結(jié)構(gòu)域協(xié)同酯化作用[21]。

在現(xiàn)有文獻報道和研究數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，我們總結(jié)并提出了cereulide的生物合成機理，并著重探討TE結(jié)構(gòu)域和KR結(jié)構(gòu)域在cereulide合成中的迭代和環(huán)化作用，如圖3-A所示：

（1）二肽的合成：cereulide的主要合成單元，CesA由A-PCP-C-A-E-C*結(jié)構(gòu)域組成，CesB包含A-PCP-APCP-TE結(jié)構(gòu)域。首先，CesA1，CesA2，CesB1和CesB2 分別識別D-α-酮羧酸（KIC），L-丙氨酸（Ala），L-α-酮異戊酸（KIV）和L-纈氨酸（Val）。然后，通過KR域?qū)ⅵ?KIC（CesA1）和α-KIV（CesB1）分別還原為D-α-羥基異己酸（HIC）和L-α-羥基異戊酸（HIV）。PCP結(jié)構(gòu)域通過4'-磷酸泛酰巰基乙胺的巰基捕獲活化的前體物質(zhì)，C結(jié)構(gòu)域催化下游PCP結(jié)合的單體，并對上游PCP結(jié)合的單體進行親核攻擊，最終共價結(jié)合形成二肽。

（2）四肽的合成：依照上述過程，CesA和CesB分別合成D-HIC-D-Ala和L-HIV-L-Val，C*結(jié)構(gòu)域催化酯鍵的形成，釋放 PCP上結(jié)合的四肽D-HIC-DAla-L-HIV-L-Val，該四肽隨后轉(zhuǎn)移至 CesB末端 TE結(jié)構(gòu)域的絲氨酸羥基（Ser-OH）上。

（3）十二肽的環(huán)化：通過重復(fù)反應(yīng)合成第二個四肽，兩個四肽通過酯化形成八肽；再次重復(fù)上述反應(yīng)，形成三元絡(luò)合的產(chǎn)物肽。由于ces-NRPS的TE結(jié)構(gòu)域活性中心表面結(jié)構(gòu)阻止外部水分子進入，并誘導(dǎo)內(nèi)部親核攻擊反應(yīng)，最后 TE結(jié)構(gòu)域催化中間反應(yīng)并釋放環(huán)狀的cereulide。

3.1 KR結(jié)構(gòu)域的迭代作用-酯鍵的形成

Cereulide是十二環(huán)肽，由交替的6個酰胺鍵和6個酯鍵連接而成。ces-NRPS具有兩個A結(jié)構(gòu)域，其中在a8和a9之間插入了一個KR結(jié)構(gòu)域（圖3-B）[20,53]。KR的功能是利用NADPH作為輔助因子，催化α-酮酸還原為α-羥基酸，是酯鍵形成的基礎(chǔ)[52]。其他研究也證明了 KR結(jié)構(gòu)域的還原作用，例如在放線菌kutzerides合成中的KR結(jié)構(gòu)域蛋白KtzG，以及鏈霉菌antimycins合成過程中的KR結(jié)構(gòu)域蛋白AntC，均參與催化 α-酮酸的還原[54-55]。不同的是，kutzerides和antimycins合成基因簇中的KR結(jié)構(gòu)域未插入A結(jié)構(gòu)域中，而是位于A和PCP結(jié)構(gòu)域之間并形成獨立部分。此外，真菌的環(huán)二肽合成酶系統(tǒng)（cyclodepsipeptide synthetase systems）合成的如enniation和bassianolide，這些肽類同 cereulide類似，也由酯鍵鏈接，但與細(xì)菌NRPS系統(tǒng)不同的是，真菌環(huán)二肽合成酶簇的A結(jié)構(gòu)域可直接利用α-羥酸，無需KR結(jié)構(gòu)域進行催化還原[56]。總之，細(xì)菌NRPS系統(tǒng)的組成是靈活的，通過了解多肽類天然產(chǎn)物的迭代形成過程，可為后期通過基因工程、合成生物學(xué)和其他手段獲得理想產(chǎn)物提供新的思路。

3.2 TE結(jié)構(gòu)域的環(huán)化作用

許多NRPS合成的天然產(chǎn)物TE結(jié)構(gòu)域的功能已得到良好闡述，其功能主要為：活性絲氨酸殘基攻擊PCP結(jié)構(gòu)域結(jié)合的中間肽，并使之與TE結(jié)構(gòu)域結(jié)合，成熟肽最終通過水解或環(huán)化作用從TE結(jié)構(gòu)域釋放，形成線性肽或環(huán)肽（圖3-B）[57-58]。例如，有研究分析了枯草芽孢桿菌surfactin的TE結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)，SrfTE是一個含有碗狀活性位點的球狀結(jié)構(gòu)域[59]。并且與典型的α/β水解酶家族一樣，SrfTE域也具有保守的Ser-His-Asp催化三聯(lián)體[43,60]。因此，推測cereulide的TE結(jié)構(gòu)域“肽結(jié)合袋”表面分布有大量疏水殘基形成疏水環(huán)境，外部水分子被阻攔，分子內(nèi)羥基或氨基對羰基碳發(fā)起親核攻擊，最終通過形成內(nèi)酯或內(nèi)酰胺釋放環(huán)肽。

此外，也有研究表明若 TE結(jié)構(gòu)域活性中心位點上氨基酸為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、剛性的脯氨酸時，則會形成環(huán)狀產(chǎn)物；當(dāng)脯氨酸被骨架柔軟的氨基酸替代時，外部水分子進入 TE結(jié)合口袋充當(dāng)親核試劑，則會形成線性肽[58]。總之，阻止外部水分子進入TE的“肽結(jié)合袋”，是形成環(huán)狀產(chǎn)物的關(guān)鍵。另一方面，我們認(rèn)為TE結(jié)構(gòu)域也具有調(diào)節(jié)迭代次數(shù)的功能。例如，enniation也含有3個重復(fù)單元，其C末端的TE結(jié)構(gòu)域被PCP-C結(jié)構(gòu)域取代，這表明TE結(jié)構(gòu)域和PCP-C結(jié)構(gòu)域可能具有相似的功能或核心位點，而PCP域的功能便是控制天然產(chǎn)物鏈的延伸長度[43]。

4 結(jié)語

綜述了蠟樣芽孢桿菌主要毒素cereulide的毒性作用和生物合成過程，其毒性作用機制主要包括：與5-HT3受體結(jié)合，刺激傳入迷走神經(jīng)引起嘔吐；誘導(dǎo)線粒體膜電位耗竭，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。然而，cereulide導(dǎo)致的急性肝衰竭、心力衰竭、橫紋肌溶解和腦部病變等毒性作用的機制尚不清楚。此外，在綜述cereulide的生物合成過程中，筆者強調(diào)了催化酮酸形成酯的酮還原酶（KR）域，及形成重復(fù)單元和環(huán)肽的硫酯酶（TE）域在cereulide合成過程中的迭代和環(huán)化作用。并且這種作用并不僅限于 cereulide，而是可以作為NRPS系統(tǒng)生物合成環(huán)狀迭代天然產(chǎn)物的推廣分析，為后期通過基因工程、合成生物學(xué)和其他手段獲得理想產(chǎn)物等研究提供科學(xué)依據(jù)。