王 瑤，孫宏莉，趙 穎，張 麗，朱任媛，竇紅濤，原 英，劉亞麗，劉文靜，徐英春

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科 侵襲性真菌病機(jī)制研究與精準(zhǔn)診斷北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730

女性陰道微生態(tài)系統(tǒng)由陰道內(nèi)微生物菌群、內(nèi)分泌系統(tǒng)、陰道局部解剖結(jié)構(gòu)和免疫系統(tǒng)共同組成，其菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，多種微生物共生并發(fā)揮協(xié)同/拮抗效應(yīng)。生理情況下，陰道菌群以乳桿菌為優(yōu)勢菌群[1- 2]，在體內(nèi)外各種因素的影響下，陰道微生態(tài)失衡、致菌群異常變化，可繼發(fā)陰道炎癥或陰道感染[3]，臨床常見為細(xì)菌性陰道病(bacterial vaginosis, BV)、外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis, VVC)、需氧菌性陰道炎(aerobic vaginitis, AV)和滴蟲性陰道炎(trichomonal vaginitis, TV)，由兩種及以上致病微生物導(dǎo)致的陰道炎癥屬于混合性陰道炎[4- 6]。陰道微生態(tài)評(píng)價(jià)有助于單純性陰道炎、混合性陰道炎的早期診斷，并進(jìn)行針對(duì)性治療，以促進(jìn)陰道微生態(tài)恢復(fù)平衡[3]。除陰道炎癥外，妊娠[7]、子宮惡性腫瘤術(shù)后放療[8]、宮頸病變或人乳頭瘤病毒感染[9- 10]、多囊卵巢綜合征[11]等人群陰道微生態(tài)評(píng)價(jià)的報(bào)道近年來也明顯增多。

陰道微生態(tài)評(píng)價(jià)方法主要包括形態(tài)學(xué)檢測和功能性檢測[3]，近年來二代測序技術(shù)也逐漸應(yīng)用于微生態(tài)評(píng)價(jià)[4]，但受限于價(jià)格高昂、報(bào)告時(shí)間較長等原因，目前臨床上仍以形態(tài)學(xué)檢測為其主要參考指標(biāo)。形態(tài)學(xué)檢測易受技術(shù)人員主觀因素的影響，且工作負(fù)荷較大，而自動(dòng)化鏡檢結(jié)合人工智能分析系統(tǒng)(以下簡稱“自動(dòng)化鏡檢”)有望克服上述困難。本研究旨在評(píng)估自動(dòng)化鏡檢在陰道分泌物革蘭氏染色涂片形態(tài)學(xué)分析中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

回顧性收集2020年1—5月北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科門診患者的陰道分泌物標(biāo)本(每例患者僅收集1份標(biāo)本)，所有標(biāo)本均為臨床常規(guī)檢驗(yàn)剩余樣本，并剔除樣本量過少的標(biāo)本。

本研究已通過北京協(xié)和醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審批(審批號(hào)：S-T950)。

1.2 方法

1.2.1 涂片制備及革蘭氏染色

將陰拭子置于試管中，滴加少量無菌生理鹽水，沿試管壁反復(fù)用力擠壓旋轉(zhuǎn)以洗脫標(biāo)本。滴加約0.5 mL生理鹽水進(jìn)行稀釋(根據(jù)液體濁度調(diào)整)，調(diào)節(jié)至適當(dāng)濃度后取1滴標(biāo)本稀釋液均勻涂片，理想濃度為25～30個(gè)細(xì)胞/高倍鏡視野(high power field, HPF)，且細(xì)胞均勻分布。待涂片干燥、固定后進(jìn)行革蘭氏染色。革蘭氏染色采用WST-R全自動(dòng)革蘭氏染色機(jī)(山東仕達(dá)思生物產(chǎn)業(yè)有限公司產(chǎn)品)。

1.2.2 顯微鏡檢

每張涂片均進(jìn)行自動(dòng)化鏡檢和人工鏡檢，均為低倍鏡檢測20個(gè)視野、油鏡檢測45個(gè)視野。自動(dòng)化鏡檢采用Comet- 60au高倍鏡檢分析系統(tǒng)(山東仕達(dá)思生物產(chǎn)業(yè)有限公司產(chǎn)品)，并通過人工智能技術(shù)自動(dòng)輸出判定結(jié)果。人工鏡檢由2名具有豐富經(jīng)驗(yàn)的研究人員分別獨(dú)立判定，結(jié)果不一致時(shí)由第3人進(jìn)行鏡檢復(fù)核。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

陰道微生態(tài)形態(tài)學(xué)判定標(biāo)準(zhǔn)參考Nugent評(píng)分[12]和中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)感染性疾病協(xié)作組制定的《陰道微生態(tài)評(píng)價(jià)的臨床應(yīng)用專家共識(shí)》[3]。對(duì)菌群密集度、菌群多樣性、乳桿菌樣革蘭氏陽性桿菌、陰道加德納菌及擬桿菌樣革蘭氏陰性桿菌、革蘭氏染色不定的彎曲桿菌、酵母樣孢子、假菌絲和白細(xì)胞進(jìn)行半定量分級(jí)描述，并量化評(píng)分(表1)。BV的實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)Nugent評(píng)分[12]，計(jì)算乳桿菌樣革蘭氏陽性桿菌、陰道加德納菌及擬桿菌樣革蘭氏陰性桿菌和革蘭氏染色不定的彎曲桿菌評(píng)分之和，0～3分為正常，4～6分為中間型BV，≥7分為BV。陰道菌群密集度和菌群多樣性評(píng)分均≤1者，判定為菌群抑制。以乳桿菌樣革蘭氏陽性桿菌為優(yōu)勢菌，且菌群密集度和菌群多樣性評(píng)分均為3～4者，判定為菌群增殖過度[3]。

人工鏡檢判定結(jié)果：若2名研究人員的各項(xiàng)半定量評(píng)分差值的絕對(duì)值≤1，或定性結(jié)果判斷一致時(shí)，取均值為最終結(jié)果；若2名研究人員的任何一項(xiàng)半定量評(píng)分差值的絕對(duì)值>1，則由第3名研究人員進(jìn)行獨(dú)立鏡檢，半定量評(píng)分取3次結(jié)果中最接近的2個(gè)結(jié)果的均值為最終結(jié)果；若3次評(píng)分結(jié)果兩兩差值的絕對(duì)值相等，則取3個(gè)結(jié)果的均值為最終結(jié)果。定性結(jié)果判定中，以3次結(jié)果中2次一致結(jié)果為最終結(jié)果。

1.4 觀察指標(biāo)及定義

以人工鏡檢為對(duì)照，評(píng)估自動(dòng)化鏡檢對(duì)各項(xiàng)結(jié)果檢測的準(zhǔn)確性：(1)完全一致率：自動(dòng)化鏡檢與人工鏡檢半定量評(píng)分差值的絕對(duì)值≤0.5或定性結(jié)果判斷一致的標(biāo)本數(shù)量占標(biāo)本總量的比率；(2)基本一致率：半定量評(píng)分差值的絕對(duì)值≤1.0的標(biāo)本數(shù)量占標(biāo)本總量的比率；(3)不一致率：半定量評(píng)分差值的絕對(duì)值≥1.5或定性結(jié)果判斷不一致的標(biāo)本數(shù)量占標(biāo)本總量的比率。

1.5 樣本量估算及偏倚控制

本研究按診斷性試驗(yàn)樣本量的估算方法，以人工鏡檢為對(duì)照，如自動(dòng)化鏡檢診斷的靈敏度為0.90±0.05，按95%置信區(qū)間水平，BV和VVC患者均為138例。本研究擬分別納入臨床初步診斷為BV和VVC患者各100例，并補(bǔ)充臨床初步診斷為陰道炎但未明確為BV或VVC者及非陰道炎患者各100例，以減小選擇偏倚。剔除達(dá)不到涂片細(xì)胞數(shù)要求的標(biāo)本，以減小涂片質(zhì)量對(duì)診斷準(zhǔn)確性的影響。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)算自動(dòng)化鏡檢對(duì)各項(xiàng)目的完全一致率、基本一致率和不一致率。采用Kappa一致性檢驗(yàn)評(píng)估自動(dòng)化鏡檢與人工鏡檢對(duì)Nugent評(píng)分BV分類結(jié)果和真菌定性檢測結(jié)果的一致性，結(jié)果以靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度表示。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表 1 陰道微生態(tài)形態(tài)學(xué)半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 患者一般臨床資料

共400例患者納入本研究，其中來自婦科門診293例(73.3%，293/400)，產(chǎn)科門診89例(22.3%，89/400)，計(jì)劃生育門診18例(4.5%，18/400)；平均年齡為(32.6±9.3)歲。

2.2 人工鏡檢結(jié)果

經(jīng)人工鏡檢Nugent評(píng)分判定為BV 124例(31.0%)、中間型BV 142例(35.5%)、正常134例(33.5%)。發(fā)現(xiàn)酵母樣孢子或假菌絲陽性137例(34.3%)，其中BV合并真菌陽性29例(21.2%)、中間型BV合并真菌陽性68例(49.6%)，Nugent分類正常但真菌陽性40例(29.2%)。陰道菌群抑制者33例，其中32例(97.0%)為中間型BV，1例(3.0%)為Nugent分類正常；未見陰道菌群增殖過度患者。油鏡鏡下形態(tài)見圖1。

圖 1 陰道分泌物革蘭氏染色涂片顯微鏡下形態(tài)(油鏡視野，×1000)

2.3 自動(dòng)化鏡檢對(duì)陰道微生態(tài)形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性

在半定量分級(jí)項(xiàng)目方面，自動(dòng)化鏡檢與人工鏡檢對(duì)陰道菌群多樣性檢測結(jié)果的完全一致率和基本一致率分別為52.3%和85.3%，對(duì)陰道菌群密集度、乳桿菌樣革蘭氏陽性桿菌、陰道加德納菌及擬桿菌樣革蘭氏陰性桿菌和革蘭氏染色不定的彎曲桿菌檢測結(jié)果的完全一致率和基本一致率分別為81.8%～99.5%和93.3%～100%。在定性檢測項(xiàng)目方面，自動(dòng)化鏡檢與人工鏡檢對(duì)酵母樣孢子和假菌絲檢測結(jié)果的完全一致率均高于96%，對(duì)白細(xì)胞>10個(gè)/HPF檢測結(jié)果的完全一致率為70.5%，見表2。

表 2 自動(dòng)化鏡檢對(duì)陰道微生態(tài)形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性(%)

2.4 自動(dòng)化鏡檢Nugent評(píng)分判斷的準(zhǔn)確性

以人工鏡檢為金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)Nugent評(píng)分，自動(dòng)化鏡檢對(duì)BV分類診斷的靈敏度為87.1%，特異度為96.7%，準(zhǔn)確度為90.8%，一致性檢驗(yàn)Kappa值為0.861(P<0.001)，見表3。

表 3 自動(dòng)化鏡檢對(duì)Nugent評(píng)分細(xì)菌性陰道病分類判定結(jié)果的交叉表

2.5 自動(dòng)化鏡檢對(duì)真菌定性檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性

設(shè)定酵母樣孢子或假菌絲中任一項(xiàng)檢測陽性為真菌陽性。以人工鏡檢為金標(biāo)準(zhǔn)，自動(dòng)化鏡檢對(duì)真菌定性檢測的靈敏度為86.9%，特異度為98.5%，準(zhǔn)確度為94.5%，一致性檢驗(yàn)Kappa值為0.875(P<0.001)，見表4。

表 4 自動(dòng)化鏡檢對(duì)真菌定性檢測結(jié)果的交叉表

3 討論

本研究為國內(nèi)首次對(duì)陰道分泌物革蘭氏染色涂片自動(dòng)化鏡檢結(jié)合人工智能形態(tài)學(xué)分析結(jié)果與人工鏡檢結(jié)果進(jìn)行比較，以評(píng)估自動(dòng)化鏡檢在陰道微生態(tài)評(píng)價(jià)中的臨床應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果顯示，自動(dòng)化鏡檢與人工鏡檢對(duì)陰道菌群多樣性半定量分級(jí)檢測結(jié)果的完全一致率和基本一致率分別為52.3%和85.3%，對(duì)陰道菌群密集度、乳桿菌樣革蘭氏陽性桿菌、陰道加德納菌及擬桿菌樣革蘭氏陰性桿菌、革蘭氏染色不定的彎曲桿菌半定量分級(jí)檢測結(jié)果的完全一致率和基本一致率為81.8%～99.5%和93.3%～100%，對(duì)酵母樣孢子和假菌絲定性檢測結(jié)果的一致率均高于96%，對(duì)白細(xì)胞>10個(gè)/HPF檢測結(jié)果的完全一致率為70.5%。對(duì)Nugent評(píng)分BV分類、真菌定性檢測的準(zhǔn)確度分別為90.8%和94.5%，一致性檢驗(yàn)Kappa值分別為0.861和0.875(P<0.001)，提示Comet- 60au高倍鏡檢分析系統(tǒng)對(duì)陰道分泌物革蘭氏染色涂片中細(xì)菌與真菌形態(tài)學(xué)、BV分類及真菌定性檢測結(jié)果與人工鏡檢結(jié)果的一致性均較高，對(duì)白細(xì)胞數(shù)目判定的一致性略低。

顯微鏡檢查作為一項(xiàng)形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)項(xiàng)目，對(duì)檢驗(yàn)人員的形態(tài)學(xué)經(jīng)驗(yàn)要求較高，由于檢查結(jié)果受檢驗(yàn)人員主觀因素影響較大，且工作負(fù)荷大，一直以來是臨床檢驗(yàn)技術(shù)的難點(diǎn)。近年來，人工智能與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域快速融合，在影像、病理、檢驗(yàn)等學(xué)科的應(yīng)用進(jìn)行了探索。由于微生物形態(tài)學(xué)的復(fù)雜性，目前自動(dòng)化鏡檢在臨床微生物檢驗(yàn)中僅初步應(yīng)用于復(fù)雜程度相對(duì)較低的濕片鏡檢和抗酸染色鏡檢，其在復(fù)雜程度較高的革蘭氏染色鏡檢中的應(yīng)用尚處于探索性研究階段。在顯微鏡圖像自動(dòng)化采集方面，雖然已有廠家開發(fā)了相關(guān)技術(shù)平臺(tái)，但在革蘭氏染色微生物形態(tài)學(xué)人工智能識(shí)別方面，鮮有可直接應(yīng)用于臨床的成熟技術(shù)。

Comet- 60au高倍鏡檢分析系統(tǒng)是基于深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)搭建的目標(biāo)檢測模型結(jié)合機(jī)器視覺方法，旨在實(shí)現(xiàn)對(duì)陰道微生態(tài)顯微圖像中多種類型目標(biāo)物的檢測和分析。檢測過程中將涂片插入裝載模塊后，顯微鏡可自動(dòng)加載涂片并自動(dòng)對(duì)焦、切換物鏡、滴加鏡油，自動(dòng)采集圖像、識(shí)別并輸出結(jié)果以及計(jì)算Nugent評(píng)分，閱片結(jié)束后自動(dòng)歸位涂片、清洗物鏡，檢測速度不低于50張涂片/h。人工智能分析系統(tǒng)可識(shí)別的目標(biāo)物包括桿菌、酵母樣孢子、假菌絲、上皮細(xì)胞、白細(xì)胞等，每種目標(biāo)物根據(jù)數(shù)量分為“多、少、無”3種情況，桿菌從形態(tài)上分為“長且卷曲”和“短且直立”兩種類型，酵母樣孢子從形態(tài)上分為“卵圓形孢子”和“芽生孢子”，假菌絲從形態(tài)和方向上標(biāo)化為“水平”和“垂直”，上皮細(xì)胞和白細(xì)胞從染色程度上分為“深染”和“正?！眱煞N情況。以上標(biāo)化特征經(jīng)排列組合可組成23 318種不同的顯微圖像場景，可見陰道微生態(tài)形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)具有高度復(fù)雜性。通過采集上述所有類型的樣本圖像，經(jīng)微生物學(xué)專家對(duì)所需識(shí)別的病原體和細(xì)胞人工標(biāo)注后建立訓(xùn)練集。依托百萬級(jí)訓(xùn)練集，建立基于深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)搭建的目標(biāo)檢測模型，針對(duì)每一種圖像識(shí)別類型設(shè)計(jì)優(yōu)化的人工智能算法，最終實(shí)現(xiàn)陰道微生態(tài)形態(tài)學(xué)分析。

新的檢驗(yàn)程序常規(guī)應(yīng)用于臨床前，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)其性能進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)《臨床微生物檢驗(yàn)程序驗(yàn)證指南》，微生物顯微鏡檢查評(píng)價(jià)方法與對(duì)照方法檢測結(jié)果的符合率≥80%，即通過驗(yàn)證[13]。本研究結(jié)果顯示，自動(dòng)化鏡檢與人工鏡檢對(duì)陰道菌群密集度、乳桿菌樣革蘭氏陽性桿菌、陰道加德納菌及擬桿菌樣革蘭氏陰性桿菌檢測結(jié)果的完全一致率和基本一致率分別為81.8%～83.0%和93.3%～97.8%；陰道菌群多樣性作為復(fù)雜程度更高的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，自動(dòng)化鏡檢與人工鏡檢對(duì)其檢測結(jié)果的完全一致率雖偏低，但基本一致率可達(dá)85.3%，提示Comet- 60au高倍鏡檢分析系統(tǒng)對(duì)陰道微生態(tài)形態(tài)學(xué)的評(píng)定性能可滿足臨床檢測要求。在對(duì)Nugent評(píng)分BV分類的判斷中，以人工鏡檢為對(duì)照，自動(dòng)化鏡檢的準(zhǔn)確度為90.8%，Kappa值為0.861(P<0.001)，提示兩種方法對(duì)BV分類判定的一致性亦較高。酵母樣孢子和假菌絲陽性是診斷VVC的鏡檢指標(biāo)，本研究自動(dòng)化鏡檢與人工鏡檢對(duì)酵母樣孢子和假菌絲定性檢測結(jié)果的完全一致率分別為96.8%和97.3%，自動(dòng)化鏡檢的準(zhǔn)確度為94.5%，Kappa值為0.875(P<0.001)，說明在對(duì)真菌定性檢測中，Comet- 60au高倍鏡檢分析系統(tǒng)與人工鏡檢亦具有較高的一致性。白細(xì)胞>10個(gè)/HPF是Donders評(píng)分[14]中進(jìn)行AV診斷的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。本研究自動(dòng)化鏡檢與人工鏡檢對(duì)白細(xì)胞>10個(gè)/HPF判定結(jié)果的完全一致率略低(70.5%)，可能原因：Donders評(píng)分所采用的檢測方法為濕片鏡檢，本研究自動(dòng)化鏡檢所采用的是革蘭氏染色油鏡鏡檢，然后將油鏡視野下的判定結(jié)果換算為高倍鏡視野下的結(jié)果，而人工鏡檢則直接采用高倍鏡鏡檢。油鏡鏡檢(×1000)與高倍鏡鏡檢(×400)的鏡下面積存在差異，加之標(biāo)本中白細(xì)胞并非完全均勻分布于整個(gè)涂片，鏡檢視野的選擇可能會(huì)影響兩種方法對(duì)白細(xì)胞鏡下數(shù)目判定結(jié)果的一致率。算法的進(jìn)一步優(yōu)化，將有助于提高這一指標(biāo)的準(zhǔn)確性。此外，Comet- 60au系統(tǒng)已進(jìn)行了陰道分泌物濕片人工智能自動(dòng)化鏡檢功能的研發(fā)和驗(yàn)證，以滿足Donders評(píng)分和滴蟲鏡檢的方法學(xué)要求。

本研究局限性：(1)僅收集2例革蘭氏染色不定的彎曲桿菌陽性標(biāo)本，自動(dòng)化鏡檢對(duì)該項(xiàng)目的檢測性能需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。(2)采用Nugent評(píng)分作為BV的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其獲得了2015年美國疾病控制與預(yù)防中心制定的《2015年性傳播疾病治療指南》[15]、2020年美國婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)制定的第215號(hào)實(shí)踐指南《非妊娠患者陰道炎》[16]和中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)感染性疾病協(xié)作組制定的《細(xì)菌性陰道病診治指南(2021修訂版)》[17]共同推薦。但自動(dòng)化鏡檢未對(duì)其他BV形態(tài)學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)(如Hay-Ison標(biāo)準(zhǔn)[18])的檢測準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。(3)僅對(duì)陰道分泌物涂片進(jìn)行革蘭氏染色，對(duì)細(xì)菌、真菌和白細(xì)胞等進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，但對(duì)于革蘭氏染色難以觀察到的滴蟲、支原體、衣原體、病毒等陰道炎病原體，以及使用其他鏡檢方法進(jìn)行判定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，未能進(jìn)行自動(dòng)化鏡檢準(zhǔn)確性驗(yàn)證。對(duì)于AV的診斷，《2018歐洲國際性病控制聯(lián)盟/世界衛(wèi)生組織關(guān)于陰道分泌物(陰道炎癥)管理指南》[19]和中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)感染性疾病協(xié)作組制定的《需氧菌性陰道炎診治專家共識(shí)(2021版)》[20]均采用Donders評(píng)分[14]，其需對(duì)陰道分泌物進(jìn)行濕片鏡檢，因而本文未對(duì)該系統(tǒng)診斷AV的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)定；對(duì)于VVC的診斷，美國指南[15- 16]、歐洲指南[19]和我國中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)感染性疾病協(xié)作組2012年《外陰陰道假絲酵母菌病(VVC)診治規(guī)范修訂稿》[21]均推薦進(jìn)行真菌鏡檢，其中陰道分泌物濕片鏡檢的靈敏度為40%～60%，革蘭氏染色鏡檢的靈敏度約為65%[19]，本研究僅采用了革蘭氏染色，未對(duì)濕片鏡檢法進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上，在對(duì)陰道分泌物革蘭氏染色涂片陰道微生態(tài)形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)中，自動(dòng)化鏡檢與人工鏡檢具有較好的一致性，可通過Nugent評(píng)分、酵母樣孢子和假菌絲鏡檢結(jié)果提供BV和VVC的診斷依據(jù)，顯著提高實(shí)驗(yàn)室鏡檢效率、降低人工鏡檢勞動(dòng)負(fù)荷，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

作者貢獻(xiàn)：王瑤負(fù)責(zé)研究方案設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)采集與分析及論文撰寫；孫宏莉、趙穎、張麗、朱任媛、竇紅濤、原英、劉亞麗和劉文靜負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)采集；徐英春負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)審核及內(nèi)容審校。

利益沖突：本研究獲得山東仕達(dá)思生物產(chǎn)業(yè)有限公司的技術(shù)支持，所有研究人員均不存在利益沖突