薛剛 劉杰 許利軍 石建 凌博凡

摘要 目的：研究扶正消積膠囊在體外對人胃癌細胞BGC-823增殖抑制及凋亡的影響。方法：MTT實驗檢測扶正消積膠囊對BGC-823細胞增殖的影響;流式細胞儀檢測其對BGC-823細胞凋亡的影響;Real Time-PCR、Western blotting實驗檢測其凋亡相關基因表達。結果：與空白組比較，BGC-823細胞的增殖能被扶正消積膠囊顯著抑制（給藥24 h），此抑制率隨給藥劑量的增加而上升，在劑量為5 mg/ mL時，其抑制率達86.71%，且這種抑制呈劑量依賴關系。Annexin V/PI雙染法聯(lián)合流式細胞儀結果顯示扶正消積膠囊能誘導BGC-823細胞凋亡，BGC-823細胞早期凋亡率隨給藥劑量的增加，在給藥劑量分別為2.5 mg/mL、5 mg/mL時，BGC-823細胞早期凋亡率分別達到15.76%、38.25%;Western blotting、Real Time-PCR結果表明，Procaspase-3、9蛋白酶表達隨劑量的增加而明顯減小，Bcl-2、Bcl-xl、Survivin 3種基因表達隨給藥劑量的增加而下降，Bax基因表達則相反。結論：扶正消積膠囊能通過激活caspase級聯(lián)反應抑制胃癌細胞增殖并誘導其凋亡。

關鍵詞 扶正消積膠囊;BGC-823胃癌細胞;腫瘤;增殖;凋亡

Abstract Objective：To investigate the influence of Fuzheng Xiaoji Capsule on the proliferation inhibition of human gastric cancer cell BGC-823 and its apoptosis.Methods：Effects of Fuzheng Xiaoji Capsule on proliferation of BGC-823 cells were investigated with MTT assay.Flow cytometry was used to detect the cell apoptosis while the effect of apoptosis related gene of Fuzheng Xiaoji capsule on BGC-823 cell was measured by real time-PCR and Western blotting.Results：MTT assay showed that the BGC-823 cells were inhibited by Fuzheng Xiaoji Capsule compared with control group，after treated on 24 h.The inhibition rate increases with the increase of dose，which is dose dependent.At the dose of 5 mg/mL，the inhibition rate reached 86.71%（P<0.05）.Flow cytometry demonstrated that Fuzheng Xiaoji Capsule could induce the apoptosis of BGC-823 cells.The early apoptosis rate of BGC-823 cells increased with the dose of the drug.At the dose of 2.5 mg/mL and 5 mg/mL，respectively，the early apoptosis of BGC-823 cells reached 15.76% and 38.25% respectively.By the results of Western blotting and real time-PCR，the expression of caspase-3、caspase-9 was significantly lower as the dose increased.Also，it could reduce the activity of Bcl-2，Bcl-xl，Survivin and increase the activity of Bax.Conclusion：Fuzheng Xiaoji Capsule could inhibit the proliferation of BGC-823 cells and induce their apoptosis.The possible mechanism was through activation of caspase cascade reaction.

Keywords Fuzheng Xiaoji Capsule; BGC-823 human gastric cancer cell; Cancer; Proliferation; Apoptosis

中圖分類號：R273文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.005

胃癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，也是我國常見的惡性腫瘤之一，在我國西北以及東部沿海地區(qū)胃癌發(fā)病率高居首位[1-3]。手術仍是目前治療胃癌的主要手段，術后化療在胃癌治療中占重要地位，不良反應是大多數(shù)胃癌患者無法完成既定化療療程的主要原因。近年來，中醫(yī)藥在治療胃癌方面取得重大進展，尤其是在改善臨床癥狀、提高生命質量、延長生存時間等方面療效肯定[4-5]。臨床工作中，中藥與化療相結合既能提高化療效果，亦能減輕化療不良反應。

扶正消積膠囊為如皋市中醫(yī)院院內制劑，具有益氣健脾、解毒消積、活血通絡、抗癌止痛之功效。多年的臨床使用發(fā)現(xiàn)，扶正消積膠囊治療各類腫瘤具有相當好的療效，因而我們以胃癌細胞為目標進行實驗，探討扶正消積膠囊治療胃癌的相關分子機制[6-7]，進一步為扶正消積膠囊臨床治療打下堅實的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人胃癌細胞株BGC-823，購買自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所，培養(yǎng)液用1640培養(yǎng)液（含10%小牛血清以及1%雙抗），孵箱環(huán)境：37 ℃以及含5%CO2。

1.1.2 藥物 扶正消積膠囊（組成：黃芪、白花蛇舌草、水紅花子、黨參、生大黃、三棱、炒薏苡仁、莪術、蜈蚣、炙鱉甲、西洋參、參三七、全蝎），如皋市中醫(yī)藥院內制劑;蘇藥制字Z04001609，生產批號：100614。

1.1.3 試劑與儀器 1640培養(yǎng)液（Gibco公司，美國，貨號：2058872）;胎牛血清（常州四季青公司，貨號：22011-8612）;四甲基偶氮唑藍（MTT）（Biosharp公司，貨號：BS186）;流式凋亡試劑盒（凱基公司，貨號：KGA107）;逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司，日本，貨號：RR820A）;β-actin一抗（Sigma公司，美國，貨號：MAB1501）;Caspase-3一抗（貨號：SC-2375）、Caspase-9一抗（貨號：SC-2146）、Bax一抗（貨號：SC-2314）、Bcl-2一抗（貨號：SC-2319），以上購自美國Santa cruz公司;山羊抗鼠二抗（貨號：20180515）、山羊抗兔二抗（貨號：20180536），以上購自北京中杉生物技術公司;全自動酶標儀（BioTek公司，美國，型號：00099192）;超速離心機（型號：ZCKP20181200100019）、流式細胞儀（型號：ZCKP020200300100413）、ABI熒光定量PCR儀（型號：ZCKP0201301001001331）、伯樂凝膠成像儀（型號：ZCKP020130100100132），以上購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT實驗 將細胞接種于96孔板，每孔8×103個細胞，培育12 h，待細胞貼壁后，觀察組給予扶正消積膠囊，根據預實驗結果，選擇劑量依次為5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL，0.625 mg/mL;另設1個陰性對照組，含1‰DMSO的1640培養(yǎng)液，對照組不加任何藥物，培養(yǎng)24 h后，向96孔中每孔加入120 μL 1640培養(yǎng)液，其中含MTT 20 μL，培養(yǎng)箱中培育4 h后，棄上清液，酶標儀490 nm波長測量96孔板每孔的吸光值，計算扶正消積膠囊對BGC-823細胞增殖的抑制率，抑制率=（1-觀察組/對照組）×100%，實驗重復3次，取3次結果的平均值，繪制成柱狀圖。

1.2.2 Annexin-V/PI雙染法 消化下貼壁細胞，接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿3×105個細胞，放置培養(yǎng)箱，待細胞貼壁后給藥，設2個給藥組劑量分別為5 mg/ mL、2.5 mg/mL，1個5-FU陽性對照組50 μg/ mL，1個不加任何藥物的空白對照組。24 h后，離心收集消化下來的細胞，每組中加入Binding Buffer 500 μL，重懸各管，向各管中加入5 μL PI以及5 μL Annexin-V，隨后在暗室中避光振蕩約10 min，在流式細胞儀中檢測各藥物劑量的胃癌細胞凋亡情況。

1.2.3 RT-PCR實驗 消化下貼壁細胞，接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿，給藥方法同上，24 h后，提取各劑量組細胞總RNA，紫外分光光度計計算出所提取RNA質量，經TaKaRa RT逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，逆轉錄完成后，根據Primer Premier 3.0軟件分別設計PCR引物。見表1。隨后進行聚合酶鏈式反應（PCR）。將PCR Forward Primer（10 μmol/L）、Power SYBR Green（2×）、PCR Reverse Primer（10 μmol/L）、dH2O體系混合，7500Fast PCR儀行擴增反應，先是預變性：95 ℃ 30 s，循環(huán)1次;然后PCR：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次，最后進行融解曲線分析：95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s，循環(huán)1次，實驗中設置3個復孔，提煉出不同標本Ct值。公式△Ct=目的基因Ct值-內參照基因Ct值（內參為β-actin），△△Ct=觀察組△Ct-對照組△Ct，得出各劑量組標本RQ值（RQ=2-△△Ct）。結果繪制成柱狀圖。實驗重復3次，取3次實驗平均值。

1.2.4 Western Blotting實驗 將消化下來的胃癌細胞接種于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿，給藥方法同上，給藥24 h后，提取各組劑量相關蛋白，隨后用Bradford法進行蛋白劑量測量，不同劑量組各取20 μg蛋白經SDS PAGE分離后轉到PVDF膜上，轉膜結束后，有蛋白一面向上放入預先配制好的5%牛奶封閉液中封閉1 h，再向塑封膜里加入一抗，放置于4 ℃冰箱過夜，次日取出PVDF膜，濾紙貼角稍吸干，PBST溶液洗去一抗，加入二抗，室溫孵育1 h后，同上洗去二抗，向PVDF膜上滴入ECL液，予暗室中進行發(fā)光，最后得出Western Blotting條帶。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據分析，計量數(shù)據以均數(shù)±標準差（±s）表示，各組兩兩比較采用q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 扶正消積膠囊對人胃癌細胞BGC-823的增殖抑制 經MTT實驗檢測，結果顯示不同劑量的扶正消積膠囊作用于BGC-823細胞24 h后，在劑量為5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL時，其對BGC-823細胞抑制率分別達到（86.71±4.2）%，（68.44±5.3）%，（43.16±3.8）%，（25.63±2.9）%。見圖1。與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果亦顯示，扶正消積膠囊對BGC-823細胞的增殖抑制率隨著給藥劑量的增加而增加，在劑量為5 mg/mL時，其對BGC-823細胞增殖抑制率達到一個峰值，呈劑量依賴關系。

2.2 扶正消積膠囊對人胃癌細胞BGC-823凋亡的影響 通過MTT試驗，我們檢測出不同劑量扶正消積膠囊作用胃癌細胞BGC-823 24 h的抑制率，據此，我們選用一個高劑量5 mg/mL、中劑量2.5 mg/mL以及用常見的化療藥物5-FU作為陽性對照組作為檢測藥物劑量，流式細胞儀檢測細胞早期凋亡結果示：扶正消積膠囊在作用于人胃癌細胞BGC-823 24 h后，BGC-823細胞早期凋亡率隨著給藥劑量的增加，從6.12%增加到15.76%、38.25%（P<0.05），而5-FU陽性對照組早期凋亡為14.43%，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 扶正消積膠囊對于胃癌細胞凋亡相關基因mRNA表達的影響 RT-PCR實驗結果表明，扶正消積膠囊作用于人胃癌細胞BGC-823 24 h后，Bcl-2、Bcl-xl、Survivin mRNA的表達隨劑量的上升而下降，Bax mRNA的表達則相反，表明扶正消積膠囊能下調Bcl-2、Bcl-xl、Survivin mRNA的表達，上調Bax mRNA的表達。見表2。

2.4 扶正消積膠囊對胃癌細胞凋亡相關基因mRNA表達的影響 Western Blotting實驗結果表明，通過流式細胞儀檢測扶正消積膠囊對BGC-823細胞早期凋亡，結果顯示扶正消積膠囊能誘導人胃癌細胞凋亡，據此，運用Western Blotting實驗探討其誘導細胞凋亡的分子機制。在給藥24 h后，與對照組比較，5 mg/mL、2.5 mg/mL劑量組Procaspase-3、9蛋白酶表達量隨給藥劑量的增加而明顯減小，Bax蛋白條帶表達量隨著給藥劑量的上升明顯增高，Bcl-2蛋白表達則相反。根據實驗結果可以得出，扶正消積膠囊其能激活Caspase-3、9活性以及上調Bax蛋白表達下調Bcl-2蛋白表達，從而引起B(yǎng)GC-823細胞凋亡。見圖3、圖4。

3 討論

細胞凋亡是一種受基因調節(jié)的自主調控過程，在腫瘤的個體發(fā)育以及發(fā)病機制中有著非常重要的作用，過度增殖加上細胞凋亡程序的紊亂，是導致惡性腫瘤產生的主要原因[8]。探索腫瘤發(fā)病的機制以及尋找有效治療腫瘤的方法是現(xiàn)代醫(yī)學研究的熱點。根據腫瘤細胞凋亡機制，目前治療腫瘤有效的方法之一則是通過促進細胞凋亡過程的再啟動，因而目前很多學者重點研究腫瘤細胞凋亡信號通路的調控機制。根據凋亡信號的來源認為細胞凋亡是受細胞內外因子調控的[9-10]：外在的死亡受體介導通路;內在線粒體介導的內源性通路以及內質網應激（ERS）介導的凋亡通路。半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（Caspase）引發(fā)的級聯(lián)反應是細胞凋亡過程的中心環(huán)節(jié)，在多種癌細胞如胃癌、肝癌、食管癌、胰腺癌、宮頸癌等發(fā)現(xiàn)該基因的都存在異常表達[11-14]。作為最重要的細胞凋亡途徑執(zhí)行因子之一，Caspase-3蛋白通過上游的啟動因子Caspase蛋白酶原（Procaspase）切割特異性底物，激活下游Caspase蛋白，從而導致細胞凋亡[15-16]。此外，目前研究亦證實了凋亡基因中存在非Caspase依賴的信號通路，Bcl-2家族蛋白就是其中一員[17-18]。根據結構以及功能不同將其家族成員分為促凋亡蛋白（Bax、Bak、Bad、Bim等）凋亡誘導因子和抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bel-xL、Bcl-W等）凋亡誘導因子2種類型[19-20]。有學者研究二者之間關系發(fā)現(xiàn)，Bcl-2家族蛋白成員間的相互作用對Caspase-3、Caspase-9凋亡通路起調控作用[21]。據此，為研究扶正消積膠囊誘導人胃癌細胞凋亡的分子機制，我們選擇探討其對線粒體介導的內源性細胞凋亡通路（Caspase-3、Caspase-9）以及Bcl-2家族蛋白（Bax、Bcl-2）的這2種蛋白表達的影響。

“扶正消積”概念取自中醫(yī)治療疾病的思想：祛邪扶正、調節(jié)機體陰陽平衡。本實驗以此為理念，探討本院院內制劑扶正消積膠囊其對胃癌細胞BGC-823凋亡表達的影響。研究發(fā)現(xiàn)扶正消積膠囊能抑制BGC-823細胞增殖，通過流式細胞儀聯(lián)合Annexin-V/PI雙染法實驗結果顯示，扶正消積膠囊對胃癌細胞BGC-823細胞早期凋亡率從6.12%增加到15.76%、38.25%，差異有統(tǒng)計學意義，呈劑量依賴關系;在基因蛋白檢測方面，結果表明：Bcl-2、Bcl-xl、Survivin基因表達則下降，Bax基因蛋白的表達隨著給藥劑量的上升而上調;Caspase上游基因Procaspase-3、9蛋白酶表達隨著劑量的增加而明顯減小，這個結果表明Caspase-3、9活性成分被剪切下來，從而激活Caspase-3、9表達，導致細胞凋亡，并且呈現(xiàn)劑量依賴關系。

通過本次扶正消積膠囊作用于BGC-823胃癌細胞體外實驗，發(fā)現(xiàn)扶正消積膠囊能顯著抑制BGC-823胃癌細胞的增殖，誘導其凋亡;其可能機制為激活Caspase通路以及下調Bcl-2、Bcl-xl、Survivin蛋白表達，上調Bax的表達。

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（2020-03-15收稿 責任編輯：芮莉莉）