蒲衛(wèi)星，趙軍波，尹曉玲

邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056000

青光眼是由進行性視神經(jīng)退行性病變引起的以視功能與視神經(jīng)損害為主要特征的盲性眼病。致病因素較多，主要包括病理性眼壓上升、視神經(jīng)血流灌注減少等[1]。該病起病較為隱匿，許多患者因為失去最佳救治時間而失明[2]。據(jù)估計，2020年世界青光眼患者可達7 960萬[3]。該病發(fā)病率、致殘率均較高，受到人們的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，青光眼功能損傷的病理機制可能與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡有關(guān)[4]。銀杏葉提取物銀杏內(nèi)酯B能夠保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞，并抑制細胞凋亡[5]。本研究通過烙閉上鞏膜靜脈法制備高眼壓青光眼大鼠模型，觀察銀杏內(nèi)酯B對大鼠眼壓及視網(wǎng)膜p-Akt、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、Caspase-9表達的影響，探究其保護高眼壓青光眼的作用。

1 材料

1.1 動物40只SPF級健康SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，購自成都達碩實驗動物有限公司，合格證號：SYXK(川)2014-189。飼養(yǎng)環(huán)境于溫度20～25 ℃，相對濕度55%～75%，自然光照。實驗過程嚴格遵循《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》，倫理號：nssb6000842。

1.2 藥物與試劑銀杏內(nèi)酯B(成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號：019221)；Caspase-9抗體(深圳市豪地華拓生物科技有限公司，貨號：PL-0301735)；NF-κB抗體(武漢Proteintech公司，貨號：14220-1-AP)；p-Akt抗體(廈門慧嘉生物科技有限公司，貨號：F48643)；鹽酸丙美卡因滴眼液(蘇州工業(yè)園區(qū)天龍制藥有限公司，批號：L1901221)；金霉素眼膏(北京雙吉制藥有限公司；批號：20191011)；氯霉素滴眼液(四川美大康華康藥業(yè)有限公司；批號：7325144)；戊巴比妥鈉(上海思域化工科技有限公司，批號：201908072)。

1.3 儀器Mias-2000型圖形圖像分析儀(美國Media Cybernetics公司)；CX23型顯微鏡(日本Olympus公司)；BX51型眼科顯微鏡(日本Olympus公司)；Mikro 200R型冷凍離心機(德國Hettich公司)；RM2235型石蠟切片機(德國Leica公司)。

2 方法

2.1 動物分組與模型建立大鼠納入標(biāo)準(zhǔn)：①無歪頸；②雙眼瞳孔直接(間接)對光反射正常；③無外眼疾病。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后測量大鼠眼壓，將眼壓 9～18 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)范圍內(nèi)的大鼠進行隨機分組，即對照組、模型組與銀杏內(nèi)酯B組。本研究選擇的40只大鼠眼壓測量結(jié)果均合格。將大鼠隨機分為對照組(10只)、模型組(15只)、銀杏內(nèi)酯B組(15只)，除對照組外，其余大鼠在眼科顯微鏡下通過烙閉上鞏膜靜脈法制備高眼壓青光眼模型。將大鼠稱重后，腹腔注射30 g·L-1戊巴比妥鈉進行麻醉，并給予手術(shù)眼(右眼)5 g·L-1鹽酸丙美卡因滴眼液進行角結(jié)膜表面麻醉，撐開眼瞼，從距離角鞏膜緣1～2 mm處將球結(jié)膜剪開使筋膜分離充分暴露角鞏膜緣。用眼科手術(shù)止血器對大鼠上直肌旁兩條鞏膜上靜脈及顳側(cè)一條鞏膜上靜脈進行烙閉，整復(fù)球結(jié)膜[6]。左眼作為對照眼不進行烙閉，右眼涂金霉素眼膏。對照組大鼠不采取任何措施，術(shù)后模型組與銀杏內(nèi)酯B組大鼠采用2.5 g·L-1氯霉素滴眼液滴眼，每天2次。7 d后檢測模型組與銀杏內(nèi)酯B組大鼠眼壓水平，手術(shù)眼與正常眼眼壓差>10 mm Hg為模型復(fù)制成功[7]，剔除造模失敗大鼠，各組均保留10只大鼠進行后續(xù)實驗研究。銀杏內(nèi)酯B組按40 mg·kg-1的劑量腹腔注射銀杏內(nèi)酯B，對照組與模型組均注射等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥8周。

2.2 檢測指標(biāo)

2.2.1 檢測大鼠各階段眼壓水平采用眼壓計檢測各組大鼠造模前、造模后與給藥后的眼壓水平。

2.2.2 觀察大鼠眼球組織形態(tài)變化給藥8周后，將大鼠進行麻醉，沿眼角膜緣將球結(jié)膜剪開分離大鼠眼球。用40 ng·L-1多聚甲醛固定眼球，脫水、包埋后進行切片，用蒸餾水沖洗后采用蘇木素染色，5～10 min后沖洗干凈，并用 10 g·L-1鹽酸乙醇分化 0.5 min；在蒸餾水中浸泡15 min并用伊紅復(fù)染；2～5 min后用乙醇(95%乙醇Ⅰ-95%乙醇Ⅱ-無水乙醇Ⅰ-無水乙醇Ⅱ)進行脫水，在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各浸泡1 min，透化，之后采用中性樹脂進行封片；通過顯微鏡觀察大鼠眼球組織形態(tài)變化。

2.2.3 檢測大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量及視網(wǎng)膜厚度采用顯微鏡觀察大鼠視網(wǎng)膜組織病理變化，20倍物鏡下記錄各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell，RGC)數(shù)量，每張切片分別取10個視野，10個視野的觀察均值即為該張切片RGC數(shù)量的測量值。從視盤出開始，分別向兩側(cè)各取5個視野，觀察各組視野測量大鼠視網(wǎng)膜厚度，采用圖形圖像分析儀測量大鼠視網(wǎng)膜厚度，每張切片10個視野的測量均值即為該張切片視網(wǎng)膜厚度的測量值。

2.2.4 免疫組化法檢測大鼠視網(wǎng)膜p-Akt、Caspase-9、NF-κB的表達視網(wǎng)膜石蠟切片常規(guī)脫蠟后用3%雙氧水常溫孵育10 min，用蒸餾水沖洗后在PBS內(nèi)浸泡5 min；往視網(wǎng)膜組織切片滴加血清進行封閉，并在室溫下孵育10 min；去除血清后分別滴加p-Akt、Caspase-9、NF-κB 抗體(稀釋比例均為1100)，4 ℃孵育過夜；用0.01 moL·L-1PBS洗滌3次；滴加生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min，用PBS洗滌3次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37 ℃孵育30 min，用PBS洗滌3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，沖洗4 min并經(jīng)梯度酒精脫水，在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各浸泡1 min，中性樹脂封片，鏡檢；p-Akt、Caspase-9、NF-κB 陽性染色細胞呈棕黃色，每張切片各取5個視野，采用圖形圖像分析儀檢測其表達水平。

3 結(jié)果

3.1 大鼠各時期眼壓的檢測造模前，3組大鼠眼壓水平比較均無明顯差異(P>0.05)；造模后與造模后8周，模型組與銀杏內(nèi)酯B組大鼠眼壓均明顯高于同期對照組(P<0.05)；模型組大鼠造模后與造模后8周眼壓水平比較無明顯變化(P>0.05)；銀杏內(nèi)酯B組大鼠造模后8周眼壓水平較造模后有所降低。見表1。

表1 各組大鼠各時期眼壓水平比較

3.2 觀察大鼠眼球組織形態(tài)變化對照組大鼠視神經(jīng)纖維排列較為緊密，且未出現(xiàn)炎性細胞；模型組大鼠視神經(jīng)纖維排列較為雜亂，纖維間質(zhì)間出現(xiàn)空泡與水腫，神經(jīng)元細胞大量死亡，細胞核聚集、胞膜破裂；銀杏內(nèi)酯B組大鼠神經(jīng)纖維排列不整齊，纖維間質(zhì)間也出現(xiàn)水腫與空泡，但較模型組有所改善。見圖1。

注：A：對照組；B：模型組；C：銀杏內(nèi)酯B組圖1 各組大鼠眼球組織形態(tài)變化(HE，×200)

3.3 大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量及視網(wǎng)膜厚度的檢測與對照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量明顯減少，視網(wǎng)膜厚度明顯變薄(P<0.05)；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量明顯增多，視網(wǎng)膜厚度明顯變厚(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量及視網(wǎng)膜厚度比較

3.4 大鼠視網(wǎng)膜p-Akt、Caspase-9、NF-κB表達的檢測與對照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜Caspase-9平均光密度明顯增加(P<0.05)，p-Akt、NF-κB平均光密度明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，大鼠視網(wǎng)膜Caspase-9平均光密度明顯減少(P<0.05)，p-Akt、NF-κB平均光密度明顯增加(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 大鼠視網(wǎng)膜p-Akt、Caspase-9、NF-κB表達的檢測

注：A：對照組；B：模型組；C：銀杏內(nèi)酯B組圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜免疫組化檢驗結(jié)果(×200)

4 討論

當(dāng)前治療青光眼主要是降低患者眼壓[8]。但仍有部分患者會出現(xiàn)眼壓降至正常水平，但視野缺損與RGC凋亡仍呈進行性發(fā)展的情況，可見單純降低眼壓并不能有效避免青光眼視神經(jīng)進行性損傷[9]。保留患者視功能的關(guān)鍵仍在于延長RGC的存活時間，并增加RGC的數(shù)量[10]。

中醫(yī)學(xué)將青光眼歸為“青盲”“五風(fēng)內(nèi)障”的范疇，認為其病機在于神水瘀滯、脈絡(luò)不利，久病則脈絡(luò)瘀滯、肝腎虛損，終成“青盲”[11]?！侗静菥V目》中記載銀杏葉性平，味甘、苦、澀，具有斂肺、平喘、活血化瘀、止痛的功效。研究表明，銀杏葉中包含20余種銀杏內(nèi)酯與黃酮類物質(zhì)[12]，銀杏內(nèi)酯又可分為A、B、C、J、M與白果內(nèi)酯等單體。研究報道，銀杏葉提取物可用于神經(jīng)元變性疾病的治療[13]，同時具有抑制血小板活化因子、谷氨酸毒性及一氧化氮合酶，還能保護線粒體功能，起到抗缺血、抗氧化作用[14]。銀杏葉提取物可通過抗氧化對視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞起到保護作用，還可改善視網(wǎng)膜的血供情況，從而抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡[15]。

銀杏內(nèi)酯B是從銀杏葉中提取的有效成分，有保護肝臟、抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)眼部損傷、保護胃腸黏膜、降低心肌再灌注損傷等作用[16-17]。方敏等[18]研究指出，銀杏內(nèi)脂B微乳油劑能增加大鼠眼動脈24%血流量，對大鼠視網(wǎng)膜線粒體有保護作用，從而改善大鼠的視神經(jīng)功能。本研究結(jié)果表明，高眼壓青光眼大鼠RGC數(shù)量明顯減少，說明高眼壓青光眼大鼠視功能受到嚴重損傷，RGC大量凋亡，導(dǎo)致視功能損傷及視野缺損。經(jīng)過銀杏內(nèi)酯B治療后，大鼠RGC數(shù)量明顯增多，提示銀杏內(nèi)脂B可以促進視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞增殖分化，從而改善高眼壓青光眼大鼠視功能。

研究證實，PI3K/Akt通路的激活能促進神經(jīng)元存活，有效抑制RGC凋亡[19]，作用機制可能涉及對p-Akt、Caspase-9、NF-κB表達的調(diào)控。Akt是PI3K的下游靶標(biāo)，主要負責(zé)生物信息的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[20]。PI3K的第二信使與Akt及磷酸酰基醇依賴性蛋白激酶PH結(jié)構(gòu)域相結(jié)合可以產(chǎn)生具有磷酸酶活性的p-Akt，并啟動與細胞增殖分化凋亡等相關(guān)程序，作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細胞器，發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用[21]。當(dāng)細胞受到不良刺激時 NF-κB 會被快速活化并與細胞基因的增強子與啟動子相結(jié)合，從而起到調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的作用，介導(dǎo)細胞生長的凋亡過程[22]，以NF-κB為中心的正向級放大信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有抗細胞凋亡的作用[23]。體外細胞實驗證實，NF-κB可降低RGC的凋亡率，提示其可通過介導(dǎo)抗細胞凋亡途徑起到保護青光眼患者的視力[24]。Caspase家族蛋白可通過級聯(lián)反應(yīng)促進細胞凋亡[25]，在眼部分布十分廣泛，在RGC、感光細胞中均可檢出[26]。其中Caspase-3與Caspase-9是參與細胞凋亡的重要激活劑，當(dāng)細胞受到不良刺激時，細胞色素C從線粒體內(nèi)進入胞漿并與Apaf-1相結(jié)合，通過激活Caspase-9進而激活Caspase-3，從而開啟凋亡程序[27]。研究發(fā)現(xiàn)，高眼壓青光眼大鼠眼壓升至32 mm Hg時，Caspase-9表達到達峰值，RGC大量凋亡，從而得出RGC凋亡與Caspase-9表達上調(diào)相關(guān)[28]。本研究表明，銀杏內(nèi)酯B明顯上調(diào)p-Akt、NF-κB表達，下調(diào)Caspase-9表達，進一步抑制對細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，從而有效保護高眼壓青光眼大鼠。綜上所述，銀杏內(nèi)酯B可促進視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞增殖分化，改善高眼壓青光眼大鼠視功能。