劉麗，袁孟珂，李月，劉進(jìn)哲，鄧楠

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040

不孕癥指婚后未避孕、有正常性生活、同居至少1年而未孕者，屬于婦科疑難病，困擾著廣大有生育需求的婦女。目前我國(guó)不孕癥的發(fā)病率為3.5%～11.3%[1]，其中輸卵管的因素約占40%[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，由于病原體感染或急性炎癥未得到及時(shí)治療引起管壁黏膜破壞，輸卵管完全阻塞等而致不孕，所涉及的病原體有支原體、衣原體、淋球菌、金黃色葡萄球菌等[3]。治療上多用宮腔鏡、腹腔鏡內(nèi)鏡微創(chuàng)及輔助生殖技術(shù)等，但存在成本高、反復(fù)發(fā)作等問(wèn)題。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，不孕癥是由于濕、熱、瘀、毒相搏結(jié)，導(dǎo)致氣血運(yùn)行不暢，胞絡(luò)不通而不能受孕，病機(jī)關(guān)鍵在于“瘀”[4]。劉麗教授基于該病機(jī)理論，治療上以“通”為主，運(yùn)用膈下逐瘀湯(出自清代王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》)加減化裁，臨床上有很好的治療效果。本研究通過(guò)復(fù)制氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕大鼠模型，旨在從抑制免疫反應(yīng)及抗纖維化的角度去探討膈下逐瘀湯的治療機(jī)理。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)SD雌性大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g；SPF級(jí)SD雄性大鼠10只，體質(zhì)量 250～280 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001，在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，合格證號(hào)：SYXK(黑)2016-004，標(biāo)準(zhǔn)化環(huán)境(室溫18～24 ℃，相對(duì)濕度：40%～75%，12 h晝夜交替)飼養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑膈下逐瘀湯(牡丹皮15 g，枳殼15 g，延胡索20 g，赤芍15 g，鱉甲15 g，地龍15 g，烏藥15 g，香附20 g，川芎15 g，桃仁15 g)(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥飲片藥局提供，批號(hào)：20180306)。水合氯醛(上海山浦化工有限公司，批號(hào)：20160709)；金黃色葡萄球菌(北京東方賽瑞生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：FSCC223005)；Trizol試劑(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：C6028)；TGF-β1、p38 MAPK及β-actin 的引物由北京博奧森生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 儀器-80 ℃超低溫冰箱(德國(guó)Eppendorf公司)；電子天平(北京賽多利儀器有限公司)；鋪片器(中國(guó)天津久恒醫(yī)療電子儀器有限公司)；SDG-1聲、光、電刺激儀(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)研究室)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 藥物的制備取膈下逐瘀湯各味中藥，第1次以10倍量水，第2次以8倍量水煎煮，每次均加熱回流2 h，合并兩次藥液，濃縮至適當(dāng)濃度后轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，于真空干燥箱中干燥至恒重，得到膈下逐瘀湯水煎液干粉，實(shí)驗(yàn)時(shí)加蒸餾水配置。

2.2 動(dòng)物造模、分組與給藥將60只雌性大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組、膈下逐瘀湯(低、中、高劑量)(0.324 g·kg-1、0.648 g·kg-1、1.296 g·kg-1)組，每組12只。除空白組外，其余大鼠均用10%水合氯醛腹腔麻醉，向輸卵管注入 4×109CFU·mL-1的金黃色葡萄球菌混懸液 0.1 mL，1周后待大鼠傷口愈合后，行聲光電、夾尾、傾斜鼠籠復(fù)合刺激，持續(xù)3周[5]。造模后第29天開(kāi)始進(jìn)行相應(yīng)藥物的灌胃，空白組及模型組給予同體積的蒸餾水，連續(xù)給藥28 d。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 觀察大鼠的宏觀表征觀察大鼠的精神狀態(tài)、舌象，為方便觀察與統(tǒng)計(jì)分析，參考臨床模式對(duì)大鼠的宏觀表征進(jìn)行量化[6]，見(jiàn)表1。

表1 大鼠的精神狀態(tài)、舌象評(píng)分表

2.3.2 計(jì)算受孕率將10只成熟雄性大鼠隨機(jī)分為5組，每組2只，分別與各組的6只雌性大鼠進(jìn)行合籠處理，10 d后計(jì)算受孕率。

2.3.3 HE染色觀察大鼠輸卵管組織形態(tài)每組隨機(jī)取3只大鼠，開(kāi)腹后肉眼觀察輸卵管形態(tài)、色澤、彈性、管壁厚度、有無(wú)積水積膿，管壁有無(wú)血管腫脹及與周?chē)M織有無(wú)粘連等，取雙側(cè)輸卵管，進(jìn)行HE染色觀察其病理學(xué)變化。

2.3.4 RT-PCR法檢測(cè)輸卵管組織TGF-β1mRNA、p38MAPKmRNA水平每組隨機(jī)選取3只大鼠，以10%水合氯醛腹腔麻醉后，取雙側(cè)輸卵管，置入凍存管內(nèi)，放入液氮中，-80 ℃保存。以Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加入下游引物進(jìn)行擴(kuò)增。檢測(cè)TGF-β1mRNA、p38MAPKmRNA水平，具體引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列

3 結(jié)果

3.1 大鼠的宏觀表征與空白組相比，模型組大鼠精神狀態(tài)異常，舌底偏黯，舌靜脈增粗，評(píng)分升高(P<0.05)；與模型組相比，膈下逐瘀湯低、中、高劑量組大鼠精神狀態(tài)有明顯改善(P<0.05)，膈下逐瘀湯中、高劑量組大鼠舌質(zhì)有明顯改善(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 大鼠精神狀態(tài)及舌象評(píng)分情況 分)

3.2 對(duì)輸卵管炎性不孕模型大鼠受孕率的影響與空白組相比，模型組大鼠的受孕率降低；與模型組相比，膈下逐瘀湯低、中、高劑量組大鼠的受孕率升高，見(jiàn)表4。

表4 對(duì)輸卵管炎性不孕模型大鼠受孕率的影響

3.3 大鼠輸卵管組織的病理變化空白組大鼠輸卵管管壁顏色紅潤(rùn)，質(zhì)地光滑，粗細(xì)均勻，彈性良好，與周?chē)M織無(wú)粘連，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)構(gòu)良好；模型組大鼠輸卵管管壁顏色紫暗，增粗積水，彈性差，與周?chē)M織粘連，可見(jiàn)輸卵管周?chē)罅垦准?xì)胞浸潤(rùn)(淋巴細(xì)胞為主)，組織腫脹明顯，黏膜上皮細(xì)胞脫落，輸卵管組織結(jié)構(gòu)排列紊亂；膈下逐瘀湯高劑量組大鼠輸卵管組織周?chē)?jiàn)少量炎性細(xì)胞，上皮細(xì)胞輕度脫落；膈下逐瘀湯中劑量組大鼠可見(jiàn)少許淋巴細(xì)胞，少量黏膜上皮細(xì)胞脫落，管腔可見(jiàn)少量滲出液；膈下逐瘀湯低劑量組大鼠輸卵管滲出液較多，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞脫落明顯，胞體腫脹。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠輸卵管組織的病理變化(HE，×200)

3.4 對(duì)輸卵管炎性不孕模型大鼠輸卵管組織TGF-β1mRNA、p38MAPKmRNA的影響與空白組相比，模型組大鼠輸卵管組織TGF-β1mRNA、p38MAPKmRNA水平均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，膈下逐瘀湯中、高劑量組大鼠輸卵管組織TGF-β1mRNA水平均明顯降低(P<0.05)，膈下逐瘀湯低、中、高劑量組輸卵管組織p38MAPKmRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

注：與空白組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖2 大鼠輸卵管組織中TGF-β1 mRNA、p38 MAPK mRNA的表達(dá)

4 討論

本研究通過(guò)向輸卵管注菌及復(fù)合刺激大鼠等方式復(fù)制氣滯血瘀型輸卵管炎性不孕病證結(jié)合模型。結(jié)果顯示，膈下逐瘀湯組大鼠宏觀表征積分降低、輸卵管組織TGF-β1mRNA、p38MAPKmRNA水平降低、受孕率提高。TGF-β1、p38 MAPK均與炎癥損傷、纖維化密切相關(guān)，纖維化是炎癥增生的修復(fù)反應(yīng)，但過(guò)表達(dá)可使原有組織遭到破壞，影響器官的正常功能[7-8]。

TGF-β1是TGF-β家族中含量最豐富、作用最強(qiáng)的一類(lèi)相關(guān)生長(zhǎng)因子，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遷移、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)的生成均有調(diào)節(jié)作用，也是目前對(duì)多種組織器官纖維化治療的新靶點(diǎn)[9]。在纖維化進(jìn)程中，TGF-β1/Smad通路是普遍認(rèn)為的關(guān)鍵信號(hào)通路[10]，TGF-β1是上游啟動(dòng)因子，與相應(yīng)受體結(jié)合后，開(kāi)始發(fā)生纖維化，經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的下游信號(hào)傳導(dǎo)，可啟動(dòng)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)基因的表達(dá)，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增生，并轉(zhuǎn)化為大量的肌成纖維細(xì)胞，從而導(dǎo)致粘連的發(fā)生[11-12]。研究證明，TGF-β1在肝、肺、腎纖維化及腸粘連、腹腔粘連等的發(fā)生發(fā)展中均起著重要作用[13-18]。輸卵管阻塞患者輸卵管內(nèi)膜TGF-β1表達(dá)較對(duì)照組明顯增高[19-20]。同時(shí)，TGF-β1的表達(dá)和宮腔粘連程度呈正相關(guān)性[21]。

p38 MAPK信號(hào)通路是MAPK通路家族的一個(gè)亞族，參與炎癥反應(yīng)，且在該家族中占有至關(guān)重要的作用[22]，當(dāng)被應(yīng)激(如H2O2、缺氧等)、炎癥因子(如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1等)及病原體成分刺激后發(fā)生磷酸化，進(jìn)一步影響轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，啟動(dòng)相關(guān)基因，參與對(duì)多種細(xì)胞因子的調(diào)控[23]。研究表明，p38 MAPK在調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，抑制該通路可降低促炎因子水平，緩解炎癥[24-26]。p38 MAPK作用廣泛，它可同細(xì)胞內(nèi)其他信號(hào)通路之間相互聯(lián)系，作為共同通路或是交匯點(diǎn)參與到多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中去，并在多因素誘導(dǎo)的疼痛中起著重要作用[27-28]，其抑制劑對(duì)炎性疼痛模型大鼠發(fā)揮良好的鎮(zhèn)痛作用[29]。TGF-β1 可激活腎成纖維細(xì)胞，作為上游信號(hào)，通過(guò)激活TGF-β1/p38 MAPK通路發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[30]，也可作為下游信號(hào)產(chǎn)物參與肝纖維化過(guò)程[31-32]。

研究顯示，模型組TGF-β1mRNA、p38MAPKmRNA水平升高而治療組降低，說(shuō)明膈下逐瘀湯可能是通過(guò)抑制了與該因子相關(guān)的纖維化過(guò)程。但是在該模型中TGF-β1、p38 MAPK表達(dá)升高后，引起通路中各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生的具體改變及變化程度，及所涉及的其他相關(guān)通路，有待進(jìn)一步研究。