李登云，顏國(guó)華，曹世霞，陳文霞，趙新永

鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 451100

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性、復(fù)發(fā)性強(qiáng)的胃腸道功能紊亂性疾病，屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases，IBD)范疇。該病主要發(fā)生在結(jié)腸黏膜且病變多從結(jié)腸遠(yuǎn)端發(fā)展，主要臨床表現(xiàn)以腹瀉、血便、黏液膿血便以及體質(zhì)量減輕為主，重癥患者伴有高熱及中毒癥狀。本病反復(fù)發(fā)作、遷延難愈，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，潰瘍性結(jié)腸炎在歐美等國(guó)家較為常見(jiàn)，我國(guó)近年來(lái)的發(fā)病率也呈顯著上升趨勢(shì)。我國(guó)潰瘍性結(jié)腸炎的年患病率已達(dá)到2/10 000，與八十年代相比提高6倍[3-4]?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，該病的發(fā)生是由帶有易感基因和腸道內(nèi)菌群相互作用導(dǎo)致的，這些易感基因都與免疫系統(tǒng)有關(guān)。遺傳易感者的致病因素會(huì)激活免疫系統(tǒng)引發(fā)炎癥反應(yīng)，中性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞參與UC發(fā)生發(fā)展的不同階段，它們釋放的各種炎癥因子如白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)是公認(rèn)的介導(dǎo)UC的促炎因子[5]，這些炎性因子均可引起結(jié)腸黏膜的損害，導(dǎo)致UC的發(fā)生[6]。正常情況下腸道黏膜表面與腸道管腔之間存在一道天然免疫屏障——黏液屏障，對(duì)腸黏膜起到保護(hù)作用。構(gòu)成結(jié)腸組織黏液屏障的主要成分是杯狀細(xì)胞分泌的一種黏蛋白(mucins，MUC)，其中MUC2是結(jié)直腸中最主要的分泌型黏蛋白，也是結(jié)腸黏液層中最主要的成分，對(duì)炎癥性腸病的發(fā)生、發(fā)展和愈合起重要作用[7]。

臨床上用于治療UC的藥物主要包括氨基水楊酸類、免疫抑制劑類、糖皮質(zhì)激素類及微生態(tài)制劑等[8]。這些藥物在治療UC中都起到了很好的治療作用，但是它們的不良反應(yīng)時(shí)有報(bào)道[9-10]。因此，尋找新的治療作用顯著且副作用小的藥物迫在眉睫。

中醫(yī)認(rèn)為，UC屬于中醫(yī)上“腸澼”“痢疾”“饗泄”以及“小腸泄”等范疇，基本病機(jī)為濕熱蘊(yùn)腸、氣滯絡(luò)瘀，病位主要在大腸，發(fā)病基礎(chǔ)為脾虛失健。蒼防湯出自《素問(wèn)病機(jī)氣宜保命集》，“蒼術(shù)去皮，四兩，麻黃去根節(jié)，四兩，防風(fēng)去蘆頭，五錢。上為粗末，每服一兩，生姜七片，水二盞，煎至一盞，去滓溫服”。該方全稱蒼術(shù)防風(fēng)湯，原為治“饗泄”而設(shè)，主治脾失健運(yùn)而致飧泄、完谷不化之癥，現(xiàn)在多用于痢疾、痹證等風(fēng)寒濕阻型病癥，在原方中加入白術(shù)增強(qiáng)其健脾祛濕的效果。目前，關(guān)于蒼防湯在治療UC的療效以及機(jī)理方面還未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)DSS誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，來(lái)闡明蒼防湯治療UC的作用及其機(jī)理，為臨床治療UC提供現(xiàn)代分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物12周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠100只，體質(zhì)量300～350 g，購(gòu)于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002。飼養(yǎng)條件：溫度(22±2) ℃，濕度(45±10)%，光/暗循環(huán)12 h/12 h。鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)本研究涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，編號(hào)：2020-010。

1.2 藥物與試劑柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine，SASP，上海信宜制藥公司，批號(hào)：H31020668)；葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS，上海翊圣生物科技有限公司，貨號(hào)：60316ES25)；HE染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：C0105)；Cleaved caspase-3、MUC2抗體(CST公司，貨號(hào)：9664、3033S)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、硝酸纖維素膜(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：PC0020、YA1711)；兔二步法免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：PV9001、ZLI 9018)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)A0208)；Trizol(美國(guó)Invirogen公司，貨號(hào)：15596026)；熒光PCR試劑盒(美國(guó)Taqman公司，批號(hào)：A15869)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 儀器CX21型生物顯微鏡(日本Olympus Corporation公司)；DYC-Mini1型垂直蛋白電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；FD-1C-80型冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康技術(shù)有限公司)；Multiskan FC型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；H2500R-2型低溫高速離心機(jī)(離心半徑：22.5 cm，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；GelDoc EZ型免疫印跡分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；752N型紫外分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；7500型熒光PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

2 方法

2.1 藥物制備取蒼術(shù)180 g，防風(fēng) 150 g，麻黃 60 g，白術(shù)150 g，生姜90 g。去離子水覆蓋藥材，浸泡并常規(guī)煎煮，80目過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，其剩余藥材加入適量去離子水再次煎煮。合并兩次所得濾液，通過(guò)冷凍干燥制成凍干粉備用。所有中藥材均購(gòu)于亳州市中藥材市場(chǎng)。

2.2 動(dòng)物模型100只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性組、蒼防湯低、高劑量組，每組20只。大鼠饑餓12 h后(斷食不斷水)，恢復(fù)正常飲食，并給予5.0%的DSS無(wú)菌水溶液，連續(xù)5 d，建立UC模型[11-12]，正常組大鼠正常飲水。第6天，大鼠出現(xiàn)腹瀉、大便出血、體質(zhì)量明顯下降等癥狀，停止DSS飲水，給予大鼠正常飲水并灌胃給藥，陽(yáng)性組大鼠給予0.67 g·kg-1SASP，蒼防湯低、高劑量組分別給予1.0 g·kg-1和10.0 g·kg-1的蒼防湯凍干粉溶液，正常組大鼠給予等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)治療2周。

2.3 一般指標(biāo)檢測(cè)用藥開(kāi)始后，每天測(cè)量大鼠體質(zhì)量、觀察糞便及便血情況，根據(jù)觀察情況計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)。體質(zhì)量下降：<1%計(jì)0分，1%～5%計(jì)1分，6%～10%計(jì)2分，11%～15%計(jì)3分，>15%計(jì)4分；便血：陰性計(jì)0分，陽(yáng)性計(jì)2分，嚴(yán)重出血計(jì)4分；糞便形成：正常計(jì)0分，便溏計(jì)2分，腹瀉計(jì)4分。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，切除其結(jié)腸，并根據(jù)Minaiyan等[13]的研究在顯微鏡下觀察結(jié)腸組織創(chuàng)面大小和炎癥程度并計(jì)分。潰瘍創(chuàng)面：無(wú)潰瘍計(jì)0分，<3 mm計(jì)1分，>3 mm計(jì)2分；炎癥計(jì)分：無(wú)炎癥計(jì)0分，輕度炎癥計(jì)1分，重度炎癥計(jì)2分。根據(jù)結(jié)腸組織潰瘍創(chuàng)面計(jì)分和炎癥計(jì)分，計(jì)算腸黏膜損傷指數(shù)。損傷程度評(píng)分：未損傷黏膜層計(jì)0分；損傷黏膜下層計(jì)1分；損傷黏膜肌層計(jì)2分；損傷漿膜層計(jì)3分。

2.4 HE染色觀察結(jié)腸組織病理變化4%多聚甲醛固定結(jié)腸組織，95%乙醇脫水，石蠟包埋，切成 5 μm 厚切片，脫蠟，蒸餾水清洗，蘇木精染色1 min，鹽酸乙醇分化3 s，蒸餾水沖洗，氨水返藍(lán)，伊紅素復(fù)染2 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，封片，置顯微鏡下觀察。

2.5 免疫組化檢測(cè)結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡情況嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作：切片常規(guī)處理后，用pH 6.0、10 mmol·L-1檸檬酸鈉緩沖溶液高壓鍋內(nèi)蒸煮 15 min 進(jìn)行抗原修復(fù)，3%H2O2封閉10 min，清洗，5% BSA封閉，加入一抗(11 500)，4 ℃過(guò)夜，PBS清洗，室溫下加入二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色 5 min，鹽酸乙醇分化，復(fù)染，梯度脫水，二甲苯透明并封片，顯微鏡下觀察。

2.6 定量PCR檢測(cè)結(jié)腸組織中IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ及MUC2的mRNA水平每組取1 g結(jié)腸組織，勻漿，用Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)體系：上下游引物各0.5 μL，5×PCR buffer 10 μL，dNTPs 0.5 μL，Tap酶1 μL，cDNA模板5 μL，補(bǔ)加雙蒸水至50 μL。擴(kuò)增條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法 計(jì)算目的mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot 檢測(cè)MUC2蛋白的表達(dá)水平取15mg新鮮結(jié)腸組織于1.5 mL試管內(nèi)，加入含100 nmol·L-1蛋白酶抑制劑的 RIPA組織裂解液300 μL，用超聲粉碎儀打碎混勻，13 000 rpm·min-1離心15 min，吸取上清液，用BCA測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白含量。取50 μg蛋白用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至于硝酸纖維素膜，PBS洗3次，5%BSA室溫封閉1.5 h，分別加入MUC2(11 500)及β-actin(12 000)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS清洗3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(15 000)，室溫孵育1.5 h，Pierce ECL Plus發(fā)光液顯影，每組獨(dú)立灰度掃描3次，以β-actin為內(nèi)參蛋白，分析目的蛋白條帶灰度值[14]。

3 結(jié)果

3.1 蒼防湯對(duì)大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)、腸黏膜損傷指數(shù)及損傷程度評(píng)分的影響與正常組相比，模型組大鼠DAI、腸黏膜損傷指數(shù)及損傷程度評(píng)分均顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，蒼防湯低、高劑量組大鼠DAI、損傷指數(shù)及損傷程度評(píng)分均明顯降低(P<0.05)。提示蒼防湯可明顯減輕潰瘍性結(jié)腸炎的結(jié)腸損傷程度。見(jiàn)表2。

表2 蒼防湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠DAI、腸黏膜損傷指數(shù)及損傷程度評(píng)分的影響

3.2 蒼防湯對(duì)結(jié)腸形態(tài)學(xué)的影響與正常組大鼠結(jié)腸組織相比，模型組大鼠結(jié)腸組織中出現(xiàn)明顯的潰瘍和炎癥，組織結(jié)構(gòu)被破壞，可見(jiàn)大量深染的白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；與模型組相比，蒼防湯組大部分上皮細(xì)胞和隱窩損傷被修復(fù)，結(jié)構(gòu)趨于恢復(fù)正常，炎癥浸潤(rùn)基本消失。提示蒼防湯能夠抑制結(jié)腸炎癥，減輕結(jié)腸組織損傷。見(jiàn)圖1(箭頭所指為損傷處)。

3.3 蒼防湯對(duì)結(jié)腸細(xì)胞凋亡的影響與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中陽(yáng)性細(xì)胞較多(染色為深褐色，黃色箭頭所指)；與模型組相比，蒼防湯組陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞顯著減少，幾乎觀察不到。表明蒼防湯可以劑量依賴性地降低DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖2。

注：A：正常組；B：模型組；C：陽(yáng)性組；D：蒼防湯低劑量組；E：蒼防湯高劑量組圖1 蒼防湯對(duì)結(jié)腸形態(tài)學(xué)的影響(HE染色，×100)

注：A：正常組；B：模型組；C：陽(yáng)性組；D：蒼防湯低劑量組；E：蒼防湯高劑量組圖2 蒼防湯對(duì)結(jié)腸細(xì)胞凋亡的影響(×100)

3.4 蒼防湯對(duì)結(jié)腸中IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ及MUC2mRNA表達(dá)水平的影響與模型組相比，蒼防湯低、高劑量組均能顯著降低結(jié)腸組織中IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，顯著升高IL-10及MUC2的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，其中高劑量蒼防湯的作用更為明顯。表明蒼防湯可劑量依賴性地改善炎癥相關(guān)因子及MUC2的mRNA表達(dá)。見(jiàn)表3。

表3 蒼防湯對(duì)結(jié)腸組織中IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和MUC2 mRNA表達(dá)水平的影響

3.5 蒼防湯對(duì)結(jié)腸組織中MUC2蛋白表達(dá)的影響與模型組比較，蒼防湯顯著升高結(jié)腸組織中MUC2的蛋白表達(dá)量(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)圖3，表4。

注：A：正常組；B：模型組；C：陽(yáng)性組；D：蒼防湯低劑量組；E：蒼防湯高劑量組圖3 蒼防湯對(duì)結(jié)腸組織中MUC2蛋白表達(dá)的影響

表4 蒼防湯對(duì)結(jié)腸組織中MUC2蛋白表達(dá)的影響

4 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種慢性炎癥性腸病，雖然對(duì)其進(jìn)行了大量研究，但目前其發(fā)病機(jī)制還不清楚[15]。這種疾病往往遷延不愈，而臨床中那些難治的、癥狀嚴(yán)重的患者，有時(shí)須通過(guò)手術(shù)來(lái)治療[16]，但手術(shù)存在損傷大、易復(fù)發(fā)等問(wèn)題。因此，探索其他新的治療方式，對(duì)于其臨床治療具有重要意義。中藥作為傳統(tǒng)藥物，在治療UC上顯示出良好效果[17-18]。蒼防湯具有解散風(fēng)邪、通行滯氣、健脾燥濕之功效，常用于治療“饗泄”。本研究通過(guò)復(fù)制潰瘍性結(jié)腸模型，探索蒼防湯對(duì)其的治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蒼防湯可顯著減輕模型大鼠的癥狀，提示蒼防湯治療UC 的有效性。

結(jié)腸環(huán)境在潰瘍性結(jié)腸炎的進(jìn)程中扮演著重要的角色。在UC患者和DSS誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中，結(jié)腸組織中促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6 及IFN-γ的水平顯著高于正常組，而IL-10和MUC2的水平顯著降低[19-20]。在DSS誘導(dǎo)的大鼠模型中，當(dāng)阻斷大鼠表達(dá)IL-6時(shí)，T細(xì)胞和B細(xì)胞活化鈍化，腸道炎癥相應(yīng)減少，可抑制UC的發(fā)展[21-22]。研究表明，有效抑制結(jié)腸組織中TNF-α或其他相應(yīng)炎癥因子的釋放都可以對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎患者起到治療作用[21，23]。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)UC有效的藥物大多能夠促進(jìn)MUC2蛋白的表達(dá)和分泌，而MUC2的表達(dá)和分泌可改善病人的相應(yīng)癥狀[24]。

本研究發(fā)現(xiàn)，給予蒼防湯后，大鼠結(jié)腸組織中的炎癥反應(yīng)顯著減輕，細(xì)胞凋亡減少，說(shuō)明炎癥損傷得到有效抑制。對(duì)結(jié)腸組織中炎癥因子IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ的mRNA水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，蒼防湯能顯著降低促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ表達(dá)水平，升高抑炎因子IL-10的表達(dá)，增加黏膜屏障蛋白MUC2的表達(dá)，這與我們前期研究結(jié)果一致[12]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，蒼防湯配方中的某些單味藥對(duì)炎癥性疾病有良好的作用，如蒼術(shù)可通過(guò)抑制胃組織中TNF-α、IL-6、IL-1的mRNA的表達(dá)水平，降低血液中TNF-α、IL-6、IL-1 的含量，達(dá)到治療胃潰瘍的作用[25-26]；防風(fēng)可以抑制COX-2的活性，從而降低TNF-α、IL-1和IL-6的分泌，減輕大鼠風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和肌痙攣[27]；麻黃可抑制肺部炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及TNF-α、IL-6、IFN-γ的分泌，減輕香煙誘發(fā)肺部炎癥反應(yīng)[28]。這些單味中藥在不同的炎癥疾病中，在一定程度上可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)而抑制炎癥反應(yīng)。

綜上，蒼防湯可明顯改善DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎，其作用機(jī)理可能是抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)，促進(jìn)保護(hù)性黏蛋白的增加，從而減輕結(jié)腸炎癥反應(yīng)，降低結(jié)腸組織損害。