張瓊，劉培強，王婭囡，張奇志，賈艷敏，劉暢，弓韜

1.山東省立第三醫(yī)院，山東 濟南 250031； 2.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院，山西 太原 030001

在腫瘤疾病中，肝癌是死亡率相對較高的疾病，全球疾病死亡人數(shù)中約有43%的人為肝癌患者，對人們的生命安全造成了嚴重的威脅[1-3]。癌細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲過程十分復雜，與各種細胞因子、黏附相關分子、調(diào)節(jié)因子、信號轉(zhuǎn)導通路等密切相關[4-6]。目前，肝癌治療仍以手術切除最常見，雖然術后進行放療、化療等治療，但復發(fā)和轉(zhuǎn)移風險依舊存在[7]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)等炎性因子主要由T 細胞等免疫細胞產(chǎn)生，這些炎性因子參與肝癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移過程，與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關[8]。大量研究表明，TNF-α在細胞增殖、分化及凋亡方面發(fā)揮著重要作用，對轉(zhuǎn)基因肝癌小鼠的TNF-α信號通路進行研究，發(fā)現(xiàn)其在肝癌組織中異常激活，并促進了肝癌細胞的增殖及轉(zhuǎn)移[9]。白花丹屬于藍雪科植物中的一種常見中藥，具有破瘀消積、行氣止痛等功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明，白花丹具有抗凝血、抗癌、抗氧化及保肝等作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)，從白花丹中提取的白花丹醌在抗腫瘤方面具有顯著作用，且不良反應少，明顯提高了患者的生存質(zhì)量[11]，但其具體作用機制的研究還處于起步階段，白花丹醌能否通過阻斷TNF-α信號的激活治療肝癌還有待考察。由此，本文采用人肝癌細胞進行研究，探討白花丹醌能否通過調(diào)控 TNF-α 水平對肝癌細胞活性和炎癥因子產(chǎn)生影響。

1 材料

1.1 細胞系人肝癌細胞Hep G2(上海雅吉生物科技有限公司，貨號：ZQ0022)，將細胞密封保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2 藥物與試劑白花丹醌(滁州仕諾達生物科技有限公司，貨號：SND-1261，純度：≥98%)。Trizol試劑(雷根生物科技有限公司，貨號：NR0002)；SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒(江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司，貨號：KGP113)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海研卉生物科技有限公司，貨號：FSQ-301)；RT-PCR試劑盒(美國ABI公司，貨號：7000)；胰蛋白酶(上海寶曼生物科技有限公司，貨號：E0022)；MTT粉、BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司，貨號：YT1466、YT8173)；TNF-α及β-action的引物序列由賽默飛世爾科技有限公司合成；RPMI-1640培養(yǎng)基、TNF-α一抗、IL-1β一抗及IL-6二抗(武漢益普生物科技有限公司，貨號：PM150110、ATA38860、ATA31401、FNab04283)；IL-6一抗(上海梵態(tài)生物科技有限公司，貨號：FT-B8913S)；TNF-α及IL-1β二抗(上海恒斐生物科技有限公司，貨號：bs-0078R-2、bs-0812R-2)；U6一抗[亞科因(武漢)生物技術有限公司，貨號：ABP59155]；U6二抗[青木生物技術(武漢)有限公司，貨號：ant-082]；DMEM培養(yǎng)基(上海麥克林生化科技有限公司，貨號：D6515)；生理鹽水(青島尼賽欣和生物技術有限公司，貨號：30105)；二甲基亞砜(上海吉至生化科技有限公司，貨號：D54260)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，北京伊塔生物科技有限公司，貨號：YT0230-2)；PBS溶液(上海廣銳生物科技有限公司，貨號：PR694)；乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA，北京伊塔生物科技有限公司，貨號：YT0912)；Annexin V FITC(上海經(jīng)科化學科技有限公司，貨號：AD10)；PI、RIPA裂解液(北京伊塔生物科技有限公司，貨號：YT1784、SY4680)；ECL熒光試劑盒(江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司，貨號：KGP1123)。

1.3 儀器7500型實時熒光定量PCR儀(美國 Invitrogen 公司)；5024R型高速冷凍離心機(離心半徑：8.5 cm，德國Eppendorf公司)；Analyzer 16 型流式細胞儀(德國美天旎生物技術有限公司)；CX43型顯微鏡[奧林巴斯(北京)銷售服務有限公司]。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)與分組取HepG2細胞懸浮液，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞完全貼壁后，棄掉培養(yǎng)液，加入0.25%的胰蛋白酶，用吸管吹打制成細胞懸浮液后轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)，待培養(yǎng)至第5代時收集細胞，調(diào)整細胞濃度至1×105mL-1。取1 mL細胞懸液接種于16孔板中，并分為Nc組、Bd組、Bz組及Bg組，Nc組采用細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，Bd組、Bz組及Bg組細胞培養(yǎng)基中分別加入5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1的白花丹醌培養(yǎng)，48 h后，棄去上層清液，加入DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h收集細胞備用。

2.2 MTT檢測HepG2細胞的增殖能力將上述收集的HepG2細胞密度調(diào)整至5×104mL-1，取 200 μL 細胞懸液接種于96孔板，在37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)48h后加入50 μL MTT，37 ℃下培育4 h，去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶液，12 h后使用酶標儀在490 nm波長處檢測HepG2細胞OD值。

2.3 Transwell實驗檢測HepG2細胞的遷移能力各組細胞采用無血清培養(yǎng)液進行饑餓處理18 h[12]，加入100 μL 0.25%胰蛋白酶進行溶解消化后，2 000 r·min-1離心5 min，去上清液用含BSA的培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整至5×105mL-1，在Transwell小室上層中加入200 μL細胞懸液，將其放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h后，棄掉培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，無水甲醛固定20 min后將小室適當風干，用結晶紫溶液進行染色，20 min后用棉簽輕試掉上層未遷移細胞，用PBS洗滌3次后，用顯微鏡任意選取5個視野細胞進行觀察。

2.4 流式細胞儀檢測HepG2細胞凋亡率各組細胞用PBS洗滌3次，加入100 μL不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞30 s，搖勻懸浮液后轉(zhuǎn)移至5 mL流式試管中，2 000 r·min-1離心5 min，去上清液后PBS洗滌3次，重懸細胞，加入5 μL Annexin V FITC及5 μL PI，搖勻染色，室溫避光孵育15 min后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.5 Western blot檢測HepG2細胞TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的表達水平取細胞懸浮液置于離心管中，加入0.25%胰蛋白酶后，放入冰箱中冷凍10 min使其完全裂變后，洗滌細胞3次，加入1 mL RIPA裂解液并充分攪拌，4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min后，取上清液，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒對各組細胞中蛋白進行定量分析，將各組蛋白調(diào)至等濃度后，用SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒進行電泳，半干法轉(zhuǎn)移至甲醇活化的PVDF膜上，在120V條件下轉(zhuǎn)膜1.5 h后，37 ℃、5%的BSA條件下封閉2 h。加入TNF-α、IL-1β、IL-6一抗(11 000)，4 ℃搖床振蕩孵育過夜后洗膜，加入稀釋的二抗(15 000)，37 ℃室溫孵育2 h。洗膜后，用ECL熒光試劑盒曝光、顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描各蛋白條帶的灰度值，以U6為內(nèi)參蛋白，計算TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達量。

2.6 RT-PCR檢測HepG2細胞TNF-αmRNA的水平嚴格按照試劑盒說明書進行，取HepG2細胞懸浮液加入Trizol試劑提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用實時熒光定量PCR儀，在95 ℃條件下預變性10 min，變性30 s，在72 ℃條件下延伸1 min，59 ℃條件下退火30 s，此循環(huán)進行40次，收集熒光信號，內(nèi)參采用β-action，實驗結束后，用2-ΔΔCT計算TNF-α的基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

3 結果

3.1 白花丹醌對HepG2細胞增殖能力的影響采用MTT法檢測白花丹醌對Hep G2細胞增殖能力的影響。與Nc組相比，不同濃度的白花丹醌均能顯著抑制Hep G2細胞的增殖(P<0.05)，其中Bg組效果最為顯著。見圖1。

圖1 白花丹醌對HepG2細胞增殖能力的影響

3.2 白花丹醌對HepG2細胞遷移能力的影響采用Transwell實驗檢測白花丹醌對Hep G2細胞遷移能力的影響。與Nc組相比，不同濃度的白花丹醌均能顯著抑制Hep G2細胞的遷移能力(P<0.05)，其中Bg組效果最為顯著。見圖2。

圖2 白花丹醌對HepG2細胞遷移能力的影響(×100)

3.3 白花丹醌對HepG2細胞凋亡的影響采用流式細胞術檢測白花丹醌對Hep G2細胞凋亡的影響。與Nc組相比，不同濃度的白花丹醌均能顯著促進Hep G2細胞凋亡(P<0.05)，其中Bg組效果最為顯著。見圖3，圖4。

圖3 白花丹醌對HepG2細胞凋亡的影響

3.4 白花丹醌對Hep G2細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達的影響采用Western blot檢測白花丹醌對Hep G2細胞TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達的影響。與Nc組相比，不同濃度的白花丹醌均能顯著降低Hep G2細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 蛋白的表達水平(P<0.05)，其中Bg組效果最為顯著。見圖5，圖6。

注：與Nc組相比，aP<0.05；與Bd組相比，bP<0.05；與Bz相比，cP<0.05圖4 白花丹醌對HepG2細胞凋亡的影響

圖5 白花丹醌對Hep G2細胞TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達的影響

注：與Nc組相比，aP<0.05；與Bd組相比，bP<0.05；與Bz相比，cP<0.05圖6 白花丹醌對Hep G2細胞TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達的影響

3.5 白花丹醌對Hep G2細胞中TNF-αmRNA水平的影響采用RT-PCR檢測白花丹醌對Hep G2細胞TNF-αmRNA水平的影響。與Nc組相比，不同濃度的白花丹醌均能顯著降低Hep G2細胞中TNF-αmRNA的表達水平(P<0.05)，其中Bg組效果最為顯著。見圖7。

注：與Nc組相比，aP<0.05；與Bd組相比，bP<0.05；與Bz相比，cP<0.05圖7 白花丹醌對Hep G2細胞TNF-α mRNA水平的影響

4 討論

肝癌屬于消化道惡性腫瘤，是一種發(fā)病率位居全球惡性腫瘤前十的疾病，每年死亡人數(shù)超過100萬人，中國肝癌患病率占全球4成以上，且病死率將近50%[13]。白花丹醌是集抗轉(zhuǎn)移、不易耐藥、無不良反應等多種優(yōu)點于一身的抗癌成分，廣泛應用于臨床且療效顯著[14]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α作為炎性因子參與多種腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展，而肝癌的發(fā)生與TNF-α激活有極大關系，TNF-α通過與關聯(lián)受體互相作用，與目的基因在細胞核中結合來參與肝癌進程[15]。隨著對TNF-α的深入研究，發(fā)現(xiàn)TNF-α在肝癌增殖、轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，白花丹醌能顯著抑制Hep G2細胞的增殖、遷移能力，促進Hep G2細胞凋亡，且呈濃度依賴趨勢。在中醫(yī)中，肝癌屬于“肝積”“黃疸”等范疇，多屬“肝郁脾虛”證，因此中醫(yī)對肝癌的治療，多側(cè)重于活血化瘀、散結止痛[17]。白花丹是一種常見能消腫、祛風、解毒的中藥，其提取物白花丹醌屬于萜烯類化合物，可以通過阻礙癌細胞周期來到達抗癌的目的。其次，白花丹醌可以提升腫瘤的免疫原性，對荷瘤機體中免疫細胞功能恢復具有顯著促進作用，且其具有毒副作用小、不易耐藥性等優(yōu)點[18]。對于肝癌細胞，白花丹醌主要是通過調(diào)節(jié)VEGF等基因啟動因子，負向調(diào)控細胞周期，來抑制多種信號通路的激活，抑制腫瘤新生血管生成，從而促進細胞凋亡，抑制細胞增殖及遷移。研究表明，白花丹醌在體外顯著抑制肝癌細胞增殖，可以使癌細胞生長周期受到阻滯并停留在G1 期，從而達到抑制腫瘤生長的目的[19-20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，白花丹醌能顯著降低Hep G2細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的表達水平及TNF-αmRNA的表達水平，且呈濃度依賴趨勢。報道顯示，TNF-α蛋白活性降低可抑制腫瘤癌基因的表達，從而發(fā)揮“抑癌基因”的作用[21-22]。研究表明，在癌癥患者機體中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子表達多數(shù)都呈上升趨勢，從而導致機體免疫損傷加劇，如抑制膠質(zhì)瘤中的TNF-α蛋白表達，其癌細胞放射敏感性就會隨之升高，這使得放、化療的效果得到了顯著的提高[23]。TNF-α通路與眾多腫瘤都有著密切聯(lián)系，在胃癌、乳腺癌中 TNF-α 表達變化對患者的預后有重要的指導價值，當TNF-α信號被激活時，可加快癌細胞分化，最終導致腫瘤的形成[24-26]，這與本文研究相符。劉雪梅等[27]通過體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，給予白花丹醌干預的人肝星狀細胞中TNF-αmRNA和PDGF-BB水平明顯降低，提示白花丹醌可通過抑制炎性因子表達發(fā)揮抗纖維化作用。張吉仲等[28]建立移植性肝癌小鼠模型，給予白花丹醌干預，發(fā)現(xiàn)白花丹醌干預后大鼠體內(nèi)血清中IL-2、TNF-α水平降低，且腫瘤生長抑制率明顯升高，說明白花丹醌可能是通過抑制炎性因子的表達來抑制腫瘤生長。

綜上所述，白花丹醌可通過調(diào)控TNF-α的活性，降低炎癥因子的表達，抑制肝癌細胞增殖和遷移能力。