李芝明，付勝奇，劉變化，劉欣

1.鄭州人民醫(yī)院，河南 鄭州 450053； 2.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，河南 鄭州 450007

腦出血是腦卒中的一種，世界范圍內(nèi)每年發(fā)病人數(shù)約為200萬，致死率、致殘率極高，嚴(yán)重影響患者的生命健康及生存質(zhì)量[1]。目前關(guān)于腦出血的治療以服用降顱壓、降血壓、控制腦水腫等藥物為主，但缺乏針對性治療手段，多數(shù)患者仍存在神經(jīng)功能缺損[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，腦出血發(fā)生后，神經(jīng)元細(xì)胞繼發(fā)性持續(xù)死亡是導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損的重要因素，而小膠質(zhì)細(xì)胞自噬是神經(jīng)元細(xì)胞繼發(fā)性持續(xù)死亡的主要形式，同時(shí)也是影響神經(jīng)功能恢復(fù)的重要因素[4]。因此，尋找有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞自噬的藥物對臨床治療腦出血有重要意義。近年來，中醫(yī)藥在治療腦出血疾病中發(fā)揮重要作用。中醫(yī)認(rèn)為腦出血的病因?yàn)轲鰺嶙韪[，故治療以活血散熱、散瘀止痛為主[5-7]。石菖蒲為天南星科植物，具有醒神益智、降火清痰、保護(hù)心肌細(xì)胞的功效。研究證實(shí)，石菖蒲有減輕腦出血后細(xì)胞腫脹，減輕腦水腫，保護(hù)腦組織的作用[8]，但關(guān)于石菖蒲腦保護(hù)的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。研究表明，趨化因子受體4(chemokine receptor 4，CXCR4)-磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號(hào)通路在小膠質(zhì)細(xì)胞自噬過程中起重要調(diào)控作用[9]。因此，本研究建立腦出血大鼠模型，觀察石菖蒲通過CXCR4-PI3K信號(hào)通路對模型大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞自噬的影響及神經(jīng)保護(hù)作用，為臨床治療腦出血疾病提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物健康雄性SD大鼠，8周齡，50只，體質(zhì)量250～300 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SYXK(京)2018-0086。

1.2 藥物與試劑石菖蒲萃取物(長沙華康生物技術(shù)開發(fā)有限公司，粉末狀，批號(hào)：180507)。水合氯醛(廣州市虎傲化工有限公司，貨號(hào)：302-17-0)；多聚甲醛、氨水、二甲苯、乙醇、戊二醛、檸檬酸鉛(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號(hào)：C104190、A299541、X139941、E111994、G105907、L303843)；蘇木精染液、伊紅染液(德州潤昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，批號(hào)：180201、180604)；磷酸緩沖液(美國Sigma公司，貨號(hào)：P5368-10PAK)；醋酸雙氧鈾(海德創(chuàng)業(yè)生物科技有限公司，貨號(hào)：HD28000)；10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素(美國Hyclone公司，貨號(hào)：SH30088.02、SV30010、SV30079.01)；總RNA提取試劑盒(Trizol法)(美國Invitrogen公司，貨號(hào)：15596-018)；SYBR Premix Ex Taq試劑盒(日本TAKARA公司，貨號(hào)：DRR041A)；Taq Man反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)：QN0943)；鹽酸乙醇、RIPA裂解液(碧云天生物科技有限公司，貨號(hào)：C0165S、P0013C)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，美國Biovision公司，貨號(hào)：2119-10)；10×TBST緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：T1081)；BCA蛋白定量檢測試劑盒(武漢默沙克生物科技有限公司，貨號(hào)：69-97682)；兔抗大鼠CXCR4、PI3K、AKT、Beclin-1、GAPDH一抗及山羊抗兔IgG(二抗)(美國Abcam公司，貨號(hào)：ab124824、ab154598、ab38449、ab207612、ab181602、ab6721)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 儀器腦立體定位儀(美國Stoelting公司)；E-Gel Imager凝膠成像儀(北京普瑞麥迪實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司)；ABI 7900型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；DYY-4C型電泳儀(上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司)；ZPS0850型光學(xué)顯微鏡(蘇州瑞文光電科技有限公司)；CX23型電子顯微鏡(日本Olympus Corporation公司)。

2 方法

2.1 造模分組及藥物干預(yù)50只SD大鼠隨機(jī)取10作為假手術(shù)組，剩余40只采用Rosenberg法[10]建立腦出血大鼠模型，以350 mg·kg-1的10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頭部固定于腦立體定位儀上，取正中部位，頭皮消毒，切口，用手術(shù)刀剝離骨膜，使其冠狀縫和前鹵裸露。前囟前2.0 mm，中線右側(cè) 3.0 mm 處鉆直徑為1.0 mm的圓孔，用微量注射器從股動(dòng)脈抽取50 μL血液，以2 μL·min-1的速度將血液注射到圓孔內(nèi)，留針5 min后出針，縫合傷口，消毒防止感染。以模型大鼠清醒后出現(xiàn)同側(cè)Horner征為造模成功標(biāo)準(zhǔn)，即沒有方向性的自主活動(dòng)、提尾時(shí)自行向右轉(zhuǎn)圈、右前肢癱瘓或內(nèi)收、曲頭朝向右側(cè)背部。36只大鼠造模成功，隨機(jī)分為模型組及石菖蒲低、中、高劑量組，每組9只。石菖蒲低、中、高劑量組以10 mL·kg-1體積腹腔注射 0.05 g·mL-1、0.1 g·mL-1、0.2 g·mL-1石菖蒲溶劑，假手術(shù)組和模型組腹腔注射等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥7 d。

2.2 神經(jīng)功能評估給藥干預(yù)7 d后，采用Garcia法[11]對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，共6項(xiàng)測試：自主運(yùn)動(dòng)0～3分；活動(dòng)對稱性0～3分；觸摸反應(yīng)1～3分；金屬絲鼠籠攀援1～3分；前肢對稱性0～3分；觸摸雙側(cè)軀干反應(yīng)1～3分，各項(xiàng)得分總和為神經(jīng)功能評分，分?jǐn)?shù)越低代表神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

2.3 組織取材神經(jīng)功能評分完成后處死大鼠，立即取出傷灶側(cè)大腦皮質(zhì)。每組4只大鼠的大腦皮質(zhì)放4%多聚甲醛中固定，剩余5只大鼠的大腦皮質(zhì)放于-80 ℃保存，備用。

2.4 大腦皮質(zhì)病理學(xué)觀察取出固定的大腦皮質(zhì)，石蠟包埋，冠狀切片厚度4 μm，脫蠟，自來水沖洗，蘇木精染液染色2 min，自來水沖洗，0.5 %鹽酸乙醇液分化2 s，自來水沖洗，1%氨水返藍(lán)5 s，自來水沖洗，伊紅染液浸染1 min，自來水沖洗后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選5個(gè)不同視野拍照。

2.5 大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬的超微結(jié)構(gòu)觀察取-80 ℃保存的大腦皮質(zhì)，放4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中，4 ℃固定24 h，0.1 mol·L-1磷酸緩沖液漂洗，3%戊二醛固定2 h，環(huán)氧樹脂包埋，冠狀切片，厚度約0.12 μm，用1 %醋酸雙氧鈾、0.2%檸檬酸鉛染色，電子顯微鏡下觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

2.6CXCR4、PI3K、AKT、Beclin-1mRNA相對表達(dá)量檢測取-80 ℃保存的大腦皮質(zhì)，采用Trizol法總蛋白提取試劑盒提取總RNA，Taq Man反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA模版，參照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書要求進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，57 ℃退火 35 s，72 ℃延伸1 min，設(shè)40次循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-△△CT法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 CXCR4、PI3K、AKT、Beclin-1蛋白相對表達(dá)量檢測取-80 ℃保存的大腦皮質(zhì)，加入1 mmol·L-1RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，離心半徑10 cm，取上清，置沸水浴 10 min，再次離心取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量，之后將蛋白放置于裝有沸水的燒杯中10 min，使其變性，蛋白變性后置冰上冷卻10 min。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，每孔上樣20 μL，100 V 電壓進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后，將膜放5% BSA中封閉1 h，加入一抗(11 000)，4 ℃過夜，TBST清洗3次，加二抗(13 000)，室溫孵育 1 h，TBST清洗3次，將膜放入凝膠成像系統(tǒng)中掃描，Image 軟件分析目的條帶灰度值，目的條帶與內(nèi)參條帶GAPDH灰度值的比值表示蛋白表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 石菖蒲對腦出血大鼠神經(jīng)功能評分的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低(P<0.001)；與模型組比較，石菖蒲低、中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能評分顯著升高(P<0.05)，其中石菖蒲高劑量組神經(jīng)功能評分顯著高于中、低劑量組(P<0.01)，中劑量組神經(jīng)功能評分顯著高于低劑量組(P<0.05)。提示石菖蒲能改善腦出血大鼠的神經(jīng)功能。見表2。

表2 石菖蒲對腦出血大鼠神經(jīng)功能評分的影響 分)

3.2 石菖蒲對腦出血大鼠腦組織病理學(xué)的影響假手術(shù)組大腦皮質(zhì)細(xì)胞排列規(guī)則，胞核形狀均勻，細(xì)胞間隙正常；模型組腦組織病理損傷嚴(yán)重，細(xì)胞排列散亂，胞核固縮，細(xì)胞間隙增大；石菖蒲低、中、高劑量組腦組織病理損傷程度、細(xì)胞排列散亂程度均減輕，其中石菖蒲高劑量組減輕最明顯。提示石菖蒲能改善腦出血大鼠的腦組織病理狀態(tài)。見圖1。

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：石菖蒲低劑量組；D：石菖蒲中劑量組；E：石菖蒲高劑量組圖1 石菖蒲對腦出血大鼠腦組織病理學(xué)的影響(HE染色，×400)

3.3 石菖蒲對腦出血大鼠大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬超微結(jié)構(gòu)的影響假手術(shù)組未見明顯自噬細(xì)胞；模型組出現(xiàn)大量雙模結(jié)構(gòu)的自噬細(xì)胞，含有多種被分解的殘余細(xì)胞器；石菖蒲低、中、高劑量組自噬細(xì)胞數(shù)量減少，其中石菖蒲高劑量組最少，但仍存在少量自噬細(xì)胞。提示石菖蒲能降低腦出血大鼠大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞的自噬。見圖2。

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：石菖蒲低劑量組；D：石菖蒲中劑量組；E：石菖蒲高劑量組；紅色箭頭表示自噬細(xì)胞圖2 石菖蒲對腦出血大鼠大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬超微結(jié)構(gòu)的影響(×10 000)

3.4 石菖蒲對腦出血大鼠大腦皮質(zhì)CXCR4-PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響與假手術(shù)組比較，模型組CXCR4、Beclin-1mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，石菖蒲低、中、高劑量組CXCR4、Beclin-1mRNA水平顯著降低(P<0.05)，其中石菖蒲各劑量組間CXCR4、Beclin-1mRNA的水平均有顯著性差異(P<0.05)。提示石菖蒲能顯著抑制腦出血大鼠大腦皮質(zhì)CXCR4-PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。見表3。

表3 石菖蒲對腦出血大鼠大腦皮質(zhì)CXCR4-PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

3.5 石菖蒲對腦出血大鼠大腦皮質(zhì)CXCR4-PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的影響與假手術(shù)組比較，模型組CXCR4、Beclin-1蛋白表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的水平顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，石菖蒲低、中、高劑量組CXCR4、Beclin-1蛋白表達(dá)量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平顯著降低(P<0.05)，且石菖蒲各劑量組間蛋白表達(dá)水平有顯著性差異(P<0.05)。提示石菖蒲能顯著抑制腦出血大鼠大腦皮質(zhì)CXCR4-PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。見表4，圖3。

表4 石菖蒲對腦出血大鼠大腦皮質(zhì)CXCR4-PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的影響

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：石菖蒲低劑量組；D：石菖蒲中劑量組；E：石菖蒲高劑量組圖3 石菖蒲對腦出血大鼠大腦皮質(zhì)CXCR4-PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的影響

4 討論

腦出血是由非外傷性腦內(nèi)血管破裂引起的，是腦血管疾病中致死率最高的疾病之一，腦出血患者3個(gè)月內(nèi)的病死率達(dá)20%[12]。腦出血后血腫部位周圍發(fā)生繼發(fā)性腦損傷，產(chǎn)生神經(jīng)元壞死，引發(fā)神經(jīng)功能障礙[13-14]。目前對腦出血的主要治療手段有顱內(nèi)壓治療及血壓控制，但上述手段不能盡快控制腦出血產(chǎn)生的繼發(fā)性損傷。越來越多的研究證實(shí)，細(xì)胞自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，過度自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，是許多腦損傷疾病產(chǎn)生的機(jī)制之一[15-17]。因此，尋找有效的治療藥物抑制細(xì)胞自噬，對治療腦出血疾病有重要意義。

石菖蒲是多年生草本植物，具有開竅、寧心安神、祛濕等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，石菖蒲具有保護(hù)神經(jīng)元、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用[18-19]。ZHANG等[20]研究發(fā)現(xiàn)，石菖蒲能有效改善帕金森鼠的行為學(xué)能力。石菖蒲是破血逐瘀方中的主要中藥材，鐘建斌等[21]研究發(fā)現(xiàn)，破血逐瘀方聯(lián)合依達(dá)拉奉能降低腦出血血腫周圍組織水腫，改善腦出血患者的神經(jīng)功能。陳璐等[22]研究發(fā)現(xiàn)，石菖蒲揮發(fā)油能抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬，進(jìn)而保護(hù)大腦的神經(jīng)功能。本研究發(fā)現(xiàn)，石菖蒲組大鼠的神經(jīng)功能評分顯著高于模型組，腦組織損傷程度、細(xì)胞排列散亂程度以及細(xì)胞自噬程度均較模型組有所減輕，說明石菖蒲能有效改善腦出血大鼠的神經(jīng)功能。

CXCR4是趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)的特異性受體，SDF-1與CXCR4結(jié)合形成SDF-1/CXCR4信號(hào)軸，在腦出血導(dǎo)致的神經(jīng)功能受損中發(fā)揮重要作用[23]。研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)自噬蛋白Beclin-1參與腦出血引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化，對輕、中度腦出血有保護(hù)作用，但過度自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，是許多腦損傷疾病產(chǎn)生的機(jī)制之一[24]。PI3K磷酸化影響細(xì)胞自噬活動(dòng)，SDF-1/CXCR4信號(hào)軸與PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號(hào)通路結(jié)合，可形成復(fù)雜的CXCR4-PI3K信號(hào)通路，在調(diào)控細(xì)胞自噬、修復(fù)神經(jīng)和保護(hù)大腦等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[25-27]。HUANG等[28]研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4抑制劑可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移，改善腦出血大鼠的神經(jīng)功能。仇至富等[29]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯能激活腦出血大鼠腦組織中CXCR4-PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制細(xì)胞自噬，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)大鼠的神經(jīng)功能。以上研究表明，CXCR4-PI3K信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞自噬并影響神經(jīng)功能。本研究發(fā)現(xiàn)，石菖蒲可顯著降低CXCR4、Beclin-1mRNA及蛋白相對表達(dá)量及 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平，說明石菖蒲能通過CXCR4-PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制細(xì)胞自噬，對腦出血引起的神經(jīng)功能紊亂起保護(hù)作用。

綜上所述，石菖蒲能降低腦出血大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞自噬，改善大腦神經(jīng)功能，可能是通過CXCR4-PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用，為腦出血相關(guān)藥物研發(fā)及臨床治療提供參考。