魏 穎，郭 穎，李明亮，陳 亮，王雨辰，姜 盛*，谷瑞增*

（1中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 北京 100015 2華狐生物科技（中國）有限公司 沈陽 110000）

疲勞（Fatigue）是一種非特異性、多層面的癥狀，包含了生物、心理、社會和行為過程之間復(fù)雜的相互作用[1]。生理性疲勞分為中樞疲勞和外周疲勞兩類，外周性疲勞又稱慢性疲勞，主要指由肌肉本身，如能源不足、代謝物堆積等原因引起[2]。隨著科技的發(fā)展，人們的工作和生活節(jié)奏不斷加快，越來越多的人經(jīng)受著疲勞的困擾?，F(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究認為，生物活性肽易被機體消化吸收，能有效改善細胞代謝，恢復(fù)機體生理環(huán)境，從而達到延緩疲勞的效果[3]。

近年來，通過營養(yǎng)干預(yù)緩解疲勞的研究受到越來越多的關(guān)注[4]。其評價方法主要采用灌胃方式，檢測小鼠運動耐力及相關(guān)生化指標[5]。其中，應(yīng)用較多的是小鼠負重游泳評價模型，以延長小鼠負重游泳時間來評價活性物質(zhì)的抗疲勞功效[6]。根據(jù)能源耗竭學(xué)說和代謝物質(zhì)堆積學(xué)說，與疲勞相關(guān)的生化指標主要包括肌/肝糖原含量、BLAS、BUN、LDH 水平等[7]。目前有關(guān)活性肽的抗疲勞作用已有報道。例如，草魚抗疲勞肽能夠增加機體糖原儲備，減少代謝物的堆積[8]；Liu 等[9]發(fā)現(xiàn)花生肽也能增強小鼠運動耐力，對調(diào)節(jié)糖代謝，減少乳酸積累有明顯的作用。

紫蘇[Perilla frutescens（L.） Britt.]是一種唇形科紫蘇屬一年生草本植物，主要種植在亞洲國家，如中國、印度、日本、越南、泰國等[10]。在我國，紫蘇已有兩千多年的種植歷史[11]。紫蘇籽、根莖、葉片等都富含多種營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)，紫蘇籽脂肪酸含量高，其油酸、亞油酸、亞麻酸總含量約占總脂肪酸的93%[12]。紫蘇籽的蛋白質(zhì)含量約為25%，氨基酸種類豐富且組成合理[13]。目前，對紫蘇油開發(fā)利用比較廣泛，然而對紫蘇分離蛋白和紫蘇肽的開發(fā)不足。本文采用雙酶解法制得紫蘇籽肽，研究其抗疲勞活性及作用機理，為高值化利用紫蘇籽肽提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗動物：雄性SPF 級ICR 小鼠，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22±2）℃，相對濕度50%～70%，自由飲水、進食，光照循環(huán)12 h 亮/暗。

材料與試劑：紫蘇籽蛋白粉，黑龍江珍愛生物科技有限公司；中性蛋白酶（200 000 U/g）、木瓜蛋白酶（800 000 U/g），南寧龐博生物工程有限公司；血尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、血乳酸（Blood lactic acid，BLA）、肝糖原（Liver glycogen，LG）、肌糖原（Muscle glycogen，MG）、乳酸脫氫酶（Lactic dehydrogenase，LDH）試劑盒，南京建成生物工程研究所；乳清蛋白，上海源葉生物科技有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標儀，美國貝克曼；Millipore Elix 15 純水儀，默克化工有限公司；UV-755B 紫外-可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；ST2100 實驗室pH 計，奧豪斯儀器（常州）有限公司；EL104 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LG-5真空冷凍干燥機，上海市離心機械研究所；HYP消化爐，上海纖檢儀器有限公司；80-2 離心沉淀器，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；79-1 磁力加熱攪拌器，國華電器有限公司；JB90-D 型強力電動攪拌機，上海標本模型廠；電子萬用爐，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；玻璃游泳缸（80 cm×80 cm×70 cm），廈門美成展示設(shè)備有限公司；WB-10L1 恒溫水浴鍋，德國Memmert 公司。

1.3 方法

1.3.1 紫蘇籽肽的制備 將紫蘇籽蛋白粉以1∶15 的固液比混合勻漿，調(diào)pH 值至7.0，加熱至50℃后，按1 g/L 的質(zhì)量濃度加入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶混合物（中性蛋白酶與木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為1∶1），在50 ℃下攪拌2 h，滅酶；離心收集上清液，調(diào)pH 值至6.0 后用陶瓷膜過濾，得到一級過濾液；然后采用Cl 型陰離子交換樹脂吸附濾液中帶負電的短肽及氨基酸；過納濾膜，并收集截留液，得到二級過濾液；經(jīng)減壓濃縮，硅藻土過濾，噴霧干燥后得到紫蘇籽肽。

1.3.2 紫蘇籽肽主要成分測定 水分含量采用105 ℃恒重法，依照GB 5009.3-2016 方法測定[14]；灰份含量采用550 ℃灼燒法，依照GB 5009.4-2016 方法測定[15]；蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法，依照GB/T 5009.5-2016 方法測定[16]；多肽含量采用三氯乙酸法[7]；游離氨基酸含量測定參照GB/T 5009.124-2016 方法[17]。

1.3.3 動物實驗分組及給藥劑量 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將小鼠隨機分為5 組，每組10 只，并記錄初始體重。5 組分別為空白對照組（Control）、陽性對照組（WP）、低劑量組（LP）、中劑量組（MP）、高劑量組（HP）。陽性對照組為乳清蛋白，灌胃劑量為0.8 g/（kg·d）；紫蘇籽肽低、中、高劑量組劑量分別為0.4，0.8，1.2 g/（kg·d）；空白對照組給予等體積的蒸餾水。小鼠灌胃體積為0.2 mL/只，灌胃期間，小鼠自由攝食、飲水，實驗周期為28 d。

1.3.4 小鼠負重游泳實驗 采用Wei 等[12]的方法并稍作修改：末次灌胃30 min 后，在小鼠尾中負荷體重5%的鉛絲，放入裝有（30±3）℃溫水的玻璃游泳槽中，開始計時，不時攪動水，使小鼠保持四肢運動。直至小鼠的頭部沉入水中，經(jīng)7 s 仍不能返回水面停止計時，記為小鼠的負重游泳時間。

1.3.5 抗疲勞生化指標測定 將負重游泳的小鼠吹干，休息30 min 后處死，取肝臟和腿部腓腸肌，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干，根據(jù)試劑盒檢測方法測定肌糖原、肝糖原含量。

末次灌胃30 min 后，小鼠不負重于（30±3）℃溫水中游泳60 min，將小鼠從水槽中撈出并吹干，休息30 min 后，取血。取部分全血，按照BLA 試劑盒方法分析BLA 含量。剩余血液室溫靜置30 min后，3 000 r/min 離心15 min，取上清液，按照試劑盒方法檢測BUN 含量和LDH 活力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇籽肽主要成分測定

所制備的紫蘇籽肽的成分分析如表1所示。其中，總蛋白質(zhì)含量為87.70%，灰分含量為6.21%，總游離氨基酸含量為5.87%，小肽含量為78.05%，分子質(zhì)量低于1 000 u 的短肽含量達到80.12%。

表1 紫蘇籽肽的主要成分分析Table 1 The main components of Perilla frutescens seed peptides

2.2 紫蘇籽肽對小鼠體重的影響

紫蘇籽肽對小鼠體重的影響如表2所示。結(jié)果表明，與空白對照組和陽性對照組相比，紫蘇籽肽各劑量組小鼠的體重變化趨勢大致相同，無顯著差異（P＞0.05）。說明攝入紫蘇籽肽的小鼠生長正常，不會引起肥胖。

表2 紫蘇籽肽對小鼠體重的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of Perilla frutescens seed peptides on body weight in mice（±s，n=10）

表2 紫蘇籽肽對小鼠體重的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of Perilla frutescens seed peptides on body weight in mice（±s，n=10）

組別 0 周 1 周 2 周 3 周 4 周空白對照組 26.94±0.56 30.76±1.13 32.31±0.55 32.25±1.24 34.38±1.66陽性對照組 26.40±1.86 28.45±1.97 32.15±2.24 33.13±1.66 34.88±1.73低劑量組 26.59±0.33 26.10±1.04 30.11±1.07 31.49±0.96 33.70±1.15中劑量組 27.30±0.25 27.95±0.13 32.74±1.37 33.04±1.07 36.34±1.77高劑量組 26.16±0.65 27.21±0.74 31.01±0.76 32.45±0.64 36.00±0.32

2.3 紫蘇紫肽對小鼠負重游泳時間的影響

實驗結(jié)果如圖1所示。灌胃紫蘇籽肽28 d后，低、中、高劑量組小鼠負重游泳時間較空白對照組分別提高了10.61%，22.76%，56.14%。其中，高劑量組負重游泳時間到達116.40 min，顯著高于陽性對照組的104.19 min（P<0.05）。此外，隨著紫蘇籽肽劑量的增加，小鼠負重游泳時間越長，說明紫蘇籽肽抗疲勞活性存在明顯的量效關(guān)系。

圖1 紫蘇籽肽對小鼠負重游泳時間的影響（n=10）Fig.1 Effect of Perilla frutescens seed peptides on weight loading swimming time of mice（n=10）

2.4 紫蘇籽肽對小鼠BUN 水平的影響

如圖2所示，灌胃28 d 后，紫蘇籽肽低、中、高劑量組中BUN 水平均顯著（P<0.05）低于空白對照組。與此同時，紫蘇籽中、高劑量組BUN 水平（11.40±0.16）mmol/L 和（11.12±0.31）mmol/L 也顯著（P < 0.05）低于陽性對照組（12.56±0.26）mmol/L。結(jié)果表明，紫蘇籽肽能有效促進BUN 在體內(nèi)的分解代謝，其效果更優(yōu)于乳清蛋白。

圖2 紫蘇籽肽對小鼠尿素氮（BUN）水平的影響（n=10）Fig.2 Effect of Perilla frutescens seed peptides on BUN level in mice（n=10）

2.5 紫蘇籽肽對小鼠肌糖原、肝糖原含量的影響

連續(xù)灌胃28 d 后，紫蘇籽肽高劑量組肌糖原、肝糖原含量分別為（1.63±0.01）mg/g、（13.11±0.36）mg/g，顯著（P<0.05）高于陽性對照組的（1.56±0.05）mg/g 和（9.07±0.56）mg/g（圖3）。與空白對照組相比，紫蘇籽肽高劑量組肌糖原、肝糖原含量分別提高了117.33%，89.73%。結(jié)果說明，紫蘇紫肽能有效提高肌糖原和肝糖原的積累，從而增加了機體的能量供給。

圖3 紫蘇籽肽對小鼠肌糖原含量（a）和肝糖原含量（b）的影響（n=10）Fig.3 Effect of Perilla frutescens seed peptides on muscle glycogen content（a）and liver glycogen content（b） in mice（n=10）

2.6 紫蘇籽肽對小鼠BLA、LDH 水平的影響

如圖4所示，紫蘇籽肽各劑量組LDH 活性均高于空白對照組。相應(yīng)地，紫蘇籽肽中、高劑量組BLA 水平分別為（5.89±0.31）mmol/L 和（5.73±0.20）mmol/L，較空白對照組（8.56±0.15）mmol/L 均顯著降低（P<0.05）。本研究結(jié)果顯示，紫蘇籽肽可以提高LDH 活力，降低BLA 堆積，從而有效提高機體抗疲勞效果。

圖4 紫蘇籽肽對小鼠LDH（a）和BLA（b）水平的影響（n=10）Fig.4 Effect of Perilla frutescens seed peptides on LDH（a） and BLA（b） levels in mice（n=10）

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)：灌胃低、中、高3 個劑量紫蘇籽肽4 周后，小鼠負重游泳時間分別提高了10.61%，22.76%，56.14%，與作用濃度呈正相關(guān)，顯著提升了小鼠的運動能力。在抗疲勞機理研究方面，在機體運動過程中肌糖原首先被消耗，肝糖原繼而被消耗供能，因此，糖原消耗量與疲勞程度密切相關(guān)[18]。與空白對照組相比，紫蘇籽肽高劑量組肌糖原、肝糖原含量分別提高了117.33%和89.73%，有效增加肌肉和肝臟糖原的積累，從而為機體運動提供了更多能量。

當機體氧氣供給不足時，肌肉有氧活動轉(zhuǎn)化為厭氧代謝，導(dǎo)致乳酸積累[19]。乳酸含量的增加會影響循環(huán)系統(tǒng)和骨骼肌系統(tǒng)功能，導(dǎo)致肌肉運動能力下降[20-21]。而LDH 可以促進肌肉中過多的乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸?，減少乳酸積累，延緩疲勞[22]。本研究得出，3 個劑量的紫蘇籽肽均可顯著提高機體LDH 活力。在運動過程中，明顯加快了血液中的BLA 和BUN[23]的分解代謝，效果均優(yōu)于陽性對照乳清蛋白組，延緩了肌肉運動能力的下降[24]。

綜上所述，本研究采用酶解制備的紫蘇籽肽能夠通過增加機體糖原積累，提高LDH 活性，促進代謝產(chǎn)物的清除，從而有效提高小鼠的運動能力，具有良好的抗疲勞效果。