徐永霞，王 瑞，尹一鳴，趙洪雷，李學(xué)鵬，儀淑敏，王明麗，周小敏，勵(lì)建榮*

（1渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 國(guó)家魚糜及魚糜制品加工技術(shù)研發(fā)分中心生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013 2蓬萊京魯漁業(yè)有限公司 山東煙臺(tái) 265600 3浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司 浙江舟山 316120）

我國(guó)淡水魚資源豐富，其中白鰱魚、鳙魚等低值淡水魚產(chǎn)量高，價(jià)格低，且具有良好的凝膠性能，是生產(chǎn)魚糜及魚糜制品的良好原料[1-2]。然而，淡水魚固有的腥味較重，在加工過(guò)程中難以脫除，嚴(yán)重制約了我國(guó)淡水魚魚糜加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]。引起淡水產(chǎn)生魚腥味的物質(zhì)種類多樣，組成復(fù)雜，主要包括醛酮類、醇類、含氮含硫類、烴類及萜烯衍生物等[4-5]。在淡水魚加工及貯藏過(guò)程中，微生物和酶的作用以及脂肪的氧化是魚腥味產(chǎn)生的重要原因。

魚肉中的腥味物質(zhì)大部分與蛋白基質(zhì)結(jié)合而難以有效脫除[1]，其中肌原纖維蛋白、肌球蛋白作為魚糜的主要組成成分，也是魚糜中腥味物質(zhì)的主要結(jié)合受體，直接影響最終產(chǎn)品的質(zhì)地、保水性和風(fēng)味等。目前關(guān)于蛋白質(zhì)與風(fēng)味物質(zhì)相互作用的研究主要集中在大豆蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白和牛血清蛋白等蛋白上，而關(guān)于肉類蛋白尤其是魚肉蛋白與風(fēng)味物質(zhì)相互作用的研究較少。劉璘等[1]利用頂空-固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究了白鰱魚肉蛋白質(zhì)與典型腥味物質(zhì)的結(jié)合作用，Damodaran 等[6]研究了魚肉中的肌動(dòng)球蛋白對(duì)醛酮類風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)合作用，Cao 等[7]研究了雙氧水處理后草魚肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)變化及對(duì)醛醇類風(fēng)味物質(zhì)吸附能力的影響。研究者大多采用色譜、光譜、核磁共振及分子模擬等方法研究小分子氣味物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)理，獲得作用力類型、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)等信息[8-9]。其中作為研究模型的β-乳球蛋白與醛、酮、醇類等風(fēng)味化合物的結(jié)合位點(diǎn)主要分布在蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域，并且存在多個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)，且這些作用位點(diǎn)對(duì)不同結(jié)構(gòu)風(fēng)味化合物的結(jié)合具有選擇性[10]。不同類型和結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)對(duì)于風(fēng)味化合物的作用效應(yīng)各有不同，關(guān)于魚肉蛋白與風(fēng)味物質(zhì)相互作用的研究目前還較少。

鑒于此，本文以花鰱魚為研究對(duì)象，選取魚肉中6 種典型腥味化合物【己醛、庚醛、辛醛、壬醛、（E）-2-庚烯醛和1-辛烯-3-醇】，建立魚肌球蛋白-腥味化合物作用模型體系，通過(guò)頂空-氣相色譜/質(zhì)譜法、差示掃描量熱法、拉曼光譜及分子模擬等技術(shù)，分析魚肌球蛋白與腥味物質(zhì)的結(jié)合作用特征，旨在為淡水魚蛋白產(chǎn)品中腥味物質(zhì)的調(diào)控及風(fēng)味品質(zhì)改善提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮花鰱魚（Aristichthys nobilis），錦州市林西街水產(chǎn)市場(chǎng)，平均尾重（1 500±50）g。

己醛、庚醛、辛醛、壬醛、（E）-2-庚烯醛、1-辛烯-3-醇均為色譜純級(jí)，美國(guó)Sigma 公司：腺苷-5'-三磷酸二鈉鹽水合物（ATP），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鉀、氯化鎂、乙酸鎂、馬來(lái)酸、β-巰基乙醇、乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）、碳酸氫鉀等均為分析純級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent 公司；LabRAM HR Evolution 拉曼光譜儀，崛場(chǎng)（中國(guó)）貿(mào)易有限公司；NanoBrook 粒度儀，美國(guó)布魯克海文儀器公司；970CRT 熒光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Q2000 差示掃描熱量?jī)x，美國(guó)TA 儀器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 肌球蛋白的提取及成分分析 新鮮花鰱魚宰殺后取背部肌肉，參照Park 等[11]的方法提取肌球蛋白。肌球蛋白濃度采用雙縮脲法測(cè)定，用牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

參照Qi 等[12]的方法，利用十二烷基硫酸鈉-丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對(duì)肌球蛋白組成進(jìn)行分析，采用Quantity One 軟件對(duì)膠進(jìn)行掃描與分析。

1.3.2 腥味物質(zhì)儲(chǔ)備液的制備 將己醛、庚醛、辛醛、壬醛、（E）-2-庚烯醛和1-辛烯-3-醇分別溶于20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（含0.5 mol/L NaCl，pH 7.0）中，超聲2 min，制得最終質(zhì)量濃度為2 000 mg/L 的腥味物質(zhì)儲(chǔ)備液，密封后于4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 肌球蛋白-腥味化合物作用體系的構(gòu)建采用Tris-HCl 緩沖液（含0.5 mol/L NaCl，pH 7.0）將肌球蛋白溶液稀釋至5 mg/mL，取10 mL 蛋白溶液置于頂空瓶中，分別加入上述腥味物質(zhì)儲(chǔ)備液，使最終蛋白樣品溶液中腥味物質(zhì)的質(zhì)量濃度為1 mg/L，立即用PTFE 硅膠隔墊瓶蓋密封，高速振蕩混勻1 min 后，在30 ℃避光條件下恒溫振蕩1 h。以不添加任何腥味物質(zhì)儲(chǔ)備液的蛋白溶液為對(duì)照組。

1.3.4 肌球蛋白對(duì)腥味化合物結(jié)合能力的測(cè)定參考Wang 等[13]的方法，并稍加修改。采用頂空-氣相色譜-質(zhì)譜法（HS-GC-MS）測(cè)定振蕩平衡后試樣中各風(fēng)味化合物的濃度，空白組以含相同濃度揮發(fā)物的緩沖溶液代替。上述振蕩后的樣品，置于氣相自動(dòng)進(jìn)樣托盤上。樣品進(jìn)樣前在40 ℃下孵化10 min，然后通過(guò)頂空進(jìn)樣的方式吸取1 mL 樣品空氣插入GC 進(jìn)樣口，250 ℃下解吸5 min，不分流進(jìn)樣。

GC 條件：HP-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為99.999%高純氦氣，流速1.0 mL/min；柱箱初溫40 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min 的速率升溫至120 ℃，保持5 min。MS 條件：色譜-質(zhì)譜傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；離子化方式：EI；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍30～550 m/z。

肌球蛋白對(duì)腥味化合物的結(jié)合能力用空白緩沖液組進(jìn)樣瓶中頂部空間風(fēng)味物質(zhì)的含量與蛋白質(zhì)存在情況下其含量變化的百分比表示，見式（1）。

1.3.5 表面疏水性的測(cè)定 參照Chelh 等[14]的方法，采用ANS（8-苯胺-1-萘磺酸）熒光探針?lè)ㄟM(jìn)行測(cè)定。用20 mmol/L PBS 緩沖液（含0.6 mol/L KCl，pH 7.0） 將肌球蛋白樣品梯度稀釋至0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL，向4 mL 蛋白樣品中加入50 μL 8 mmol/L ANS（用20 mmol/L pH 7.0 的PBS 緩沖液配制）后混合均勻，避光反應(yīng)10 min，使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度。以相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)肌球蛋白濃度作圖，曲線初始階段的斜率即為肌球蛋白的表面疏水性指數(shù)。

1.3.6 Zeta 電位的測(cè)定 參照Beliciu 等[15]的方法，并稍加修改。采用Brookhaven 90 Plus 納米粒度分析儀進(jìn)行Zeta 電位的測(cè)定，將蛋白樣品用20 mmol/L 的PBS（含0.6 KCl，pH 7.0） 稀釋至0.05 mg/mL，測(cè)試前超聲1 min 去除氣泡。設(shè)定參數(shù)：采用35 mW 固態(tài)激光器，“高精度” 模式，波長(zhǎng)660 nm，溶劑為水，測(cè)定溫度25 ℃。

1.3.7 總巰基和活性巰基含量的測(cè)定 參照李穎暢等[16]的方法進(jìn)行總巰基和活性巰基含量的測(cè)定，計(jì)算方法見式（2）。

式中，ε——巰基摩爾消光系數(shù)，此處為13 600 L/（mol·cm）。

1.3.8 拉曼光譜分析 參照Alix 等[17]的方法，采用高分辨率拉曼光譜儀，以氬離子激光器為光源對(duì)冷凍干燥后的蛋白樣品進(jìn)行測(cè)定。設(shè)定參數(shù)：激發(fā)波長(zhǎng)532 nm，狹縫200 μm，功率120 mW，曝光時(shí)間60 s，掃描范圍400～3 600 cm-1。以苯丙氨酸（1 003 cm-1）為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行歸一化。

1.3.9 熱穩(wěn)定性分析 稱取5～10 mg 冷凍干燥后的肌球蛋白樣品于鋁盒中，利用差示掃描量熱儀進(jìn)行熱穩(wěn)定性測(cè)定。參數(shù)設(shè)定：初始溫度20 ℃，升溫速率5 ℃/min，結(jié)束溫度80 ℃。

1.3.10 分子靜態(tài)動(dòng)力學(xué)模擬 從UniProtKB 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到花鰱魚肌球蛋白的氨基酸序列（https：//www.uniprot.org/）（PDB ID：E9JM97），利用SWISSMODEL server 進(jìn)行同源建模，篩選不同的結(jié)果，通過(guò)觀察模型蛋白氨基酸序列對(duì)源蛋白氨基酸序列的覆蓋率及其拉試圖的合理區(qū)域，選取覆蓋率超過(guò)70%、拉試圖合理區(qū)域超過(guò)90%的蛋白模型，獲得的同源性蛋白模型被導(dǎo)入到Discovery Studio（DS，版本2.1，NeoTrident Technology LTD）中，通過(guò)最小化協(xié)議進(jìn)行優(yōu)化。

小分子配體：在DS 中建立己醛、庚醛、辛醛、壬醛、（E）-2-庚烯醛和1-辛烯-3-醇的三維模型，使用Minimization 協(xié)議對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。受體蛋白：除去受體蛋白的水分子和雜原子，并添加氫原子和Charmn 力場(chǎng)。使用DS/CDOCKER 方案對(duì)受體與配體進(jìn)行對(duì)接。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA）和Duncan 檢驗(yàn)，使用Origin 9.0軟件繪圖，GC-MS 數(shù)據(jù)處理利用NIST11/Wiley7.0標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行鑒定。數(shù)據(jù)后的肩標(biāo)不同字母表示差異顯著（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌球蛋白SDS-PAGE 分析

肌球蛋白在高溫、高壓等強(qiáng)變性條件下會(huì)降解成6 條多肽鏈，包括2 條重鏈和4 條輕鏈，重鏈分子質(zhì)量約為200 ku，輕鏈分子質(zhì)量約為20 ku，另外2 條輕鏈約為15 ku 和25 ku[18]?；桇~肌球蛋白的SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。由圖可知，本試驗(yàn)中提取的花鰱魚肌球蛋白主要包含1 條肌球蛋白重鏈（分子質(zhì)量約200 ku）和2 條肌球蛋白輕鏈（分子質(zhì)量約為18 ku 和25 ku）。此外還有少量的肌動(dòng)蛋白，分子質(zhì)量約為43 ku。

圖1 肌球蛋白電泳圖Fig.1 The SDS-PAGE patterns of myosin

2.2 結(jié)合能力分析

食品中的蛋白質(zhì)除了通過(guò)降解形成風(fēng)味物質(zhì)外，還可以通過(guò)分子鍵與風(fēng)味物質(zhì)相結(jié)合進(jìn)而改變食品中風(fēng)味組分的存在狀態(tài)[19]。蛋白質(zhì)與揮發(fā)性風(fēng)味小分子之間的作用主要取決于蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的多樣性，同時(shí)也受高級(jí)結(jié)構(gòu)的影響；此外，風(fēng)味物質(zhì)的種類、疏水性及分配系數(shù)對(duì)兩者的結(jié)合作用也有直接影響[20]。不同腥味化合物與魚肉肌球蛋白的結(jié)合能力如圖2所示。1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、（E）-2-庚烯醛、辛醛和壬醛與肌球蛋白的結(jié)合能力分別為20.82%，21.4%，23.59%，25.29%，26.86%和28.25%，由此發(fā)現(xiàn)隨著風(fēng)味化合物碳鏈長(zhǎng)度、不飽和度以及官能團(tuán)的改變，結(jié)合能力也隨之改變。隨著直鏈醛碳鏈長(zhǎng)度及不飽和度的增加，結(jié)合能力逐漸增大（P<0.05），這可能是由于隨著風(fēng)味化合物碳鏈的增長(zhǎng)和不飽和度的增加，疏水性逐漸增強(qiáng)，從而擁有更多的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)也說(shuō)明兩者之間的作用力可能為疏水相互作用[20]。此外，醛類中的不飽和雙鍵可能會(huì)和蛋白組成中的賴氨酸、組氨酸殘基發(fā)生加成反應(yīng)，從而增強(qiáng)其結(jié)合能力[21]。醇類物質(zhì)由于極性較強(qiáng)，與蛋白質(zhì)之間的疏水相互作用相對(duì)較弱，因此結(jié)合能力較低。Kühn 等[21]提出，大部分揮發(fā)性物質(zhì)在自然狀態(tài)下都具有疏水性，某些特定基團(tuán)，如羰基的存在對(duì)蛋白與風(fēng)味化合物之間的相互作用具有顯著影響，其中醛類化合物與蛋白質(zhì)的作用能力要高于酮類和醇類化合物。Tan 等[22]通過(guò)數(shù)學(xué)模型發(fā)現(xiàn)風(fēng)味化合物與蛋白質(zhì)之間的作用能力主要受碳原子數(shù)、氫原子數(shù)、鏈長(zhǎng)及沸點(diǎn)大小等的影響。Brewer 和Vega[23]研究表明，疏水相互作用及氫鍵是影響蛋白質(zhì)與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)吸附能力的主要作用，蛋白結(jié)構(gòu)的展開也會(huì)提供更多的吸附位點(diǎn)。

2.3 表面疏水性的變化

表面疏水性可以有效地反映蛋白表面與外界極性水環(huán)境接觸的疏水性氨基酸的相對(duì)含量，常被用來(lái)評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的變性程度[7]。如圖3所示，對(duì)照組的表面疏水性最低，添加不同種類的腥味化合物均使肌球蛋白的表面疏水性顯著增加（P<0.05）。這是由于醛醇類腥味化合物的存在導(dǎo)致肌球蛋白發(fā)生變性，使其結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的脂肪族及芳香族氨基酸側(cè)鏈等疏水性基團(tuán)，從而導(dǎo)致肌球蛋白表面疏水性的增加，并且風(fēng)味化合物結(jié)構(gòu)不同產(chǎn)生的影響具有顯著差異。此外，隨著醛類化合物碳鏈長(zhǎng)度的增加，肌球蛋白的變性程度也逐漸增加（P<0.05）。相比于飽和醛庚醛，不飽和醛（E）-2-庚烯醛使肌球蛋白的表面疏水性有所增加，然而無(wú)顯著性差異（P>0.05）。由此可見，相對(duì)于不飽和鍵，風(fēng)味化合物的碳鏈長(zhǎng)度對(duì)肌球蛋白的溶解度有著更大的影響。此外，1-辛烯-3-醇對(duì)肌球蛋白表面疏水性的影響要顯著低于醛類物質(zhì)（P<0.05）。由此可見，與鏈長(zhǎng)及不飽和度相比，風(fēng)味化合物官能團(tuán)的變化對(duì)蛋白質(zhì)與風(fēng)味化合物之間的相互作用影響更大。

圖3 肌球蛋白與腥味化合物結(jié)合后表面疏水性的變化Fig.3 Changes in surface hydrophobicity of myosin binding of fishy odor compounds

2.4 Zeta 電位分析

蛋白質(zhì)雙螺旋結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈上含有多種類型的極性基團(tuán)（如羥基、羧基及氨基），天然結(jié)構(gòu)中親水性極性基團(tuán)會(huì)暴露在外部水環(huán)境中，使得蛋白質(zhì)表面帶有一定數(shù)量的電荷，這些基團(tuán)所帶電荷的多少以及電荷的正負(fù)性將直接影響蛋白質(zhì)溶液的Zeta 電位值，當(dāng)溶液體系中的Zeta 電位絕對(duì)值降低時(shí)，表明蛋白質(zhì)表面所帶電荷減少，親水性基團(tuán)被包埋，暴露出更多的疏水性基團(tuán)，蛋白構(gòu)象發(fā)生改變[24]。添加不同種類腥味化合物后，魚肌球蛋白溶液的Zeta 電位絕對(duì)值變化情況如圖4所示。由圖可知，腥味化合物的存在使肌球蛋白的Zeta 電位絕對(duì)值降低，除1-辛烯-3-醇外，己醛、庚醛等醛類化合物使肌球蛋白的Zeta 電位值顯著降低（P<0.05），其中對(duì)照組、添加1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和（E）-2-庚烯醛肌球蛋白組的Zeta 電位絕對(duì)值分別為26.36，24.48，22.05，16.95，13.93，10.47，12.15 mW?？梢钥闯?，風(fēng)味化合物碳鏈長(zhǎng)度及不飽和度的增加會(huì)使蛋白質(zhì)的變性程度增加，從而使蛋白樣液的Zeta 電位絕對(duì)值逐漸降低，并且醇類物質(zhì)的影響相對(duì)較小，這與前面蛋白表面疏水性的變化結(jié)果相一致。

圖4 肌球蛋白與腥味化合物結(jié)合后Zeta 電位的變化Fig.4 Changes in zeta potential of myosin binding of fishy odor compounds

2.5 總巰基及活性巰基的變化

巰基（-SH）是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中最具反應(yīng)活性的基團(tuán)之一，其含量變化直接影響蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性?？値€基主要包括活性巰基和包埋在蛋白內(nèi)部的巰基，SH1、SH2和SHa 是肌球蛋白分子中巰基的主要類型，其中SH1、SH2主要存在于肌球蛋白的頭部區(qū)域，當(dāng)?shù)鞍讟?gòu)象發(fā)生改變時(shí)，埋藏在蛋白內(nèi)部的巰基會(huì)暴露出來(lái)，因此巰基含量的變化是衡量蛋白質(zhì)變性程度的重要指標(biāo)[25]。肌球蛋白與腥味化合物結(jié)合后巰基含量的變化如圖5所示，醛醇類物質(zhì)的存在使肌球蛋白的總巰基和活性巰基含量顯著升高（P<0.05）。與對(duì)照組相比，添加1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和（E）-2-庚烯醛后肌球蛋白總巰基含量分別增加了2.17，4.39，5.47，8.23，12.48，6.61 mol/105mg。這是由于風(fēng)味化合物的存在使肌球蛋白發(fā)生變性，蛋白結(jié)構(gòu)展開，導(dǎo)致更多的巰基暴露在蛋白表面，從而使得總巰基和活性巰基的含量都呈上升趨勢(shì)，并且隨著化合物碳鏈長(zhǎng)度及不飽和度的增加，影響更加顯著。此外，醛類化合物對(duì)肌球蛋白巰基含量的影響要顯著高于醇類化合物，這一結(jié)果與前面肌球蛋白表面疏水性的變化趨勢(shì)一致。蛋白表面疏水性增加的同時(shí)，會(huì)伴隨著巰基含量的增加以及表面電荷數(shù)的降低，從而導(dǎo)致蛋白自身穩(wěn)定性降低。

圖5 肌球蛋白與腥味化合物結(jié)合后巰基含量的變化Fig.5 Changes in sulfhydryl groups content of myosin binding of fishy odor compounds

2.6 拉曼光譜分析

拉曼光譜分析可以反映蛋白質(zhì)肽鏈的骨架振動(dòng)、氨基酸側(cè)鏈周圍微環(huán)境的變化[26]，其中蛋白質(zhì)主鏈的構(gòu)象及其二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量都與酰胺I 區(qū)（1 600～1 700 cm-1）的譜帶信息有關(guān)[27]。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α-螺旋（1 650～1 660 cm-1）、β-折疊（1 665～1 680 cm-1）、β-轉(zhuǎn)角（1 680 cm-1附近）和無(wú)規(guī)則卷曲（1 660～1 665 cm-1），其中α-螺旋是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有序性的代表，β-轉(zhuǎn)角等代表蛋白質(zhì)的無(wú)序性和松散性[28]。魚肌球蛋白與腥味化合物結(jié)合前、后的拉曼光譜圖及二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的變化情況分別如圖6和表1所示。由表可知，添加風(fēng)味物質(zhì)后，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量顯著降低（P<0.05），β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量顯著上升（P<0.05），這可能是由于醛類和醇類物質(zhì)的作用使肌球蛋白結(jié)構(gòu)展開，使α-螺旋結(jié)構(gòu)向β-折疊和β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變。與對(duì)照組相比，添加1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和（E）-2-庚烯醛后α-螺旋含量分別下降了7.09%，10.75%，11.5%，13.54%，14.14%和12.34%。研究表明[27-28]，蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性主要依靠疏水作用、氫鍵、二硫鍵、靜電相互作用等維持，其中α-螺旋結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象最主要的結(jié)構(gòu)，它主要決定于多肽鏈上羰基（C=O）和氨基（-NH）之間形成的氫鍵。添加腥味化合物可能使氫鍵破壞，α-螺旋解旋，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生變性，并且化合物碳鏈長(zhǎng)度的增加，碳碳雙鍵的存在，會(huì)增加腥味化合物與肌球蛋白之間的結(jié)合作用，促使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)從有序向無(wú)序轉(zhuǎn)變，從而增大了蛋白質(zhì)的變性程度。

圖6 肌球蛋白與腥味化合物結(jié)合后的拉曼光譜圖Fig.6 The Raman spectrum of myosin binding of fishy odor compounds

表1 肌球蛋白與腥味化合物結(jié)合后二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的變化Table 1 The relative content of secondary structures of myosin binding of fishy odor compounds

2.7 熱穩(wěn)定性分析

腥味化合物對(duì)魚肌球蛋白熱變性中點(diǎn)溫度（Tm）及變性焓值（ΔH）的影響如表2所示。研究表明，蛋白質(zhì)的熱力學(xué)轉(zhuǎn)變溫度與其熱穩(wěn)定性有直接關(guān)系，Tm值越高，蛋白熱穩(wěn)定性越高，破壞其空間穩(wěn)定性所需能量也就越高，ΔH 值越大[28]。由表2可知，與對(duì)照組相比，1-辛烯-3-醇使肌球蛋白的熱變性溫度略有降低，而醛類化合物使肌球蛋白的熱變性溫度顯著降低（P<0.05），兩類化合物均使肌球蛋白的焓變值顯著降低（P<0.05），這是由于腥味化合物誘導(dǎo)肌球蛋白發(fā)生部分變性，使維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的α-螺旋結(jié)構(gòu)破壞，從而降低了蛋白質(zhì)變性所需要的焓變值，導(dǎo)致其熱穩(wěn)定性降低，并且隨著化合物碳鏈長(zhǎng)度的增加影響越顯著。Wang 等[13]在探究豌豆蛋白與風(fēng)味物質(zhì)結(jié)合作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。

表2 肌球蛋白與腥味化合物結(jié)合熱穩(wěn)定性的變化Table 2 Changes of the thermal properties of myosin binding of fishy odor compounds

2.8 分子靜態(tài)動(dòng)力學(xué)模擬

同源建模獲得的花鰱魚肌球蛋白3D 模擬圖如圖7所示，通過(guò)DS 軟件的CDOCKER 程序?qū)Φ鞍资荏w與腥味化合物（配體）進(jìn)行對(duì)接，結(jié)果如圖8所示。從圖8中可以看出，腥味化合物可以與蛋白上的Phe101，Ile104，Ile100，Leu116，Phe45 等氨基酸通過(guò)氫鍵結(jié)合，同時(shí)還以共價(jià)鍵的形式與Phe101，Lys166 等氨基酸結(jié)合。此外，與醇類物質(zhì)相比，醛類物質(zhì)還可以與蛋白上的Lys109 和Thr168 通過(guò)疏水相互作用結(jié)合，分子模擬的結(jié)果輔助驗(yàn)證了疏水性相互作用、氫鍵及共價(jià)鍵是花鰱魚肌球蛋白與所選腥味化合物結(jié)合的主要方式。

圖7 花鰱魚肌球蛋白同源模擬3D 圖Fig.7 3D homology modeling diagram of bighead carp myosin

圖8 腥味化合物與花鰱魚肌球蛋白對(duì)接結(jié)果3D 圖Fig.8 3D docking diagram of fishy odor compounds binding to bighead carp myosin

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)HS-GC-MS、分子模擬結(jié)合光譜等技術(shù)探究了魚肌球蛋白與6 種特征腥味化合物

之間的結(jié)合作用機(jī)制。結(jié)果表明，醛類物質(zhì)與肌球蛋白之間的結(jié)合能力隨著碳鏈長(zhǎng)度及不飽和度的增加而顯著增大，且1-辛烯-3-醇的結(jié)合能力顯著低于醛類；所選的特征腥味物質(zhì)與肌球蛋白之間的作用力主要是疏水相互作用、氫鍵和共價(jià)鍵；小分子腥味物質(zhì)的存在使肌球蛋白結(jié)構(gòu)展開，疏水性基團(tuán)暴露，總巰基和活性巰基含量增加，蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性降低，并且醛類物質(zhì)對(duì)肌球蛋白結(jié)構(gòu)的影響顯著高于醇類。