朱 濤,毛金磊,劉怡鳴,趙葉利

(溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,中國浙江溫州325035)

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用,為細(xì)胞的生存以及活動提供適宜的場所,同時(shí)也可影響細(xì)胞的形狀以及增殖、遷移和分化等功能。正常情況下,細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解維持在一個(gè)動態(tài)平衡[1～2]。一旦這種平衡遭到破壞,就會引起各種各樣的疾病,如組織纖維化、炎性疾病甚至癌癥[3～4]。因此,維持細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解的動態(tài)平衡,對機(jī)體的生命活動至關(guān)重要。

膠原(collagen)作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分以及機(jī)體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì),在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn),在機(jī)體發(fā)生病變或組織重構(gòu)時(shí),如皮膚創(chuàng)傷或燒傷,膠原會分解或者變性成明膠(gelatin)[5]。同時(shí),機(jī)體免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)會被激活并募集到病變部位釋放大量的炎性因子,從而影響疾病的發(fā)展進(jìn)程[6]。膠原的片段能夠通過介導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子的釋放影響炎癥反應(yīng)[7]。變性的膠原通過結(jié)構(gòu)同源性模仿白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8),從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[8]。研究報(bào)道,在不同的培養(yǎng)條件下,膠原片段增加或抑制IL-1β的生成[9～10]。明膠作為膠原的降解或變性產(chǎn)物,目前主要用于藥物遞送和醫(yī)藥行業(yè)[11～12]。本研究以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為研究對象,考察明膠對巨噬細(xì)胞的影響,以探索明膠在介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

RAW264.7細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫);PDTC(pyrrolidinedithiocarbamic acid)和甲基噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(Sigma公司,美國);DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Gibco公司,美國);明膠(Nippi公司,日本);ELISA試劑盒(達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司);RIPA裂解液和BCA蛋白試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);核因子 κB(nuclear factor-κB,NF-κB)抗體和山羊抗兔二抗(CST公司,美國)。

1.2 RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)

將RAW264.7細(xì)胞置于含有10%FBS、100U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行所有的實(shí)驗(yàn)。

1.3 明膠包被培養(yǎng)

用0.5 mmol/L冰醋酸將明膠稀釋成1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL等不同質(zhì)量濃度,將配置好的明膠沿側(cè)壁緩慢地加入到6孔板中,搖勻,放置于37℃培養(yǎng)箱孵育過夜。細(xì)胞接種前,棄掉明膠包被液后用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)輕輕洗滌6孔板表面,最后將細(xì)胞埋于有明膠包被培養(yǎng)的6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。如果細(xì)胞給予抑制劑處理,抑制劑需要與細(xì)胞同時(shí)接種于明膠包被的培養(yǎng)板上培養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為4組,即空白對照組(control):未包被明膠培養(yǎng)的細(xì)胞;明膠組(gelatin):1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL等不同質(zhì)量濃度的明膠包被培養(yǎng)細(xì)胞;NF-κB抑制劑和明膠共處理組:NF-κB抑制劑PDTC(5 μmol/L)與細(xì)胞同時(shí)培養(yǎng)在明膠(10 mg/mL)包被的6孔板上24 h;NF-κB抑制劑組:PDTC處理未包被明膠培養(yǎng)的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 形態(tài)學(xué)觀察

取對數(shù)期生長的RAW264.7細(xì)胞,胰酶消化后離心,以4×105個(gè)/孔的密度接種到明膠包被的6孔板中培養(yǎng)到對應(yīng)時(shí)間點(diǎn),倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.6 細(xì)胞存活率檢測

細(xì)胞經(jīng)明膠包被培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)后,加入0.5 mg/mL的MTT溶液 20 μL,于37℃條件下孵育3 h;隨后加入十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、異丁醇和HCl組成的三聯(lián)溶液孵育過夜。三聯(lián)溶液配制:SDS 10 g,異丁醇5 mL,10 mol/L HCl 0.1 mL,用雙蒸水配成100 mL溶液。最后,使用酶標(biāo)儀檢測在570 nm波長下的光密度(A)。細(xì)胞活力計(jì)算公式如下:細(xì)胞存活率(%)=(Asample-Ablank)/(Acontrol-Ablank)×100%。

1.7 促炎性因子的檢測

用10 mg/mL明膠包被培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞24 h,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測培養(yǎng)液中的IL-1β和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法

處理后的細(xì)胞樣品用RIPA裂解液裂解1 h,4°C條件下12×103g離心10 min后收集上清液,用BCA蛋白試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。使用10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳以分離蛋白質(zhì),接著把分離在膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上(250 mA,轉(zhuǎn)印1.5 h)。PVDF膜使用前需放在甲醇中浸泡15 s以活化膜表面的陽離子。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜后,使用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,隨后用NF-κB抗體(1∶1 000)4°C孵育過夜,TBST洗3次,每次10 min,再用辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h,TBST洗3次,每次10 min。將ECL發(fā)光液均勻涂于膜上,最后將蛋白質(zhì)印記呈現(xiàn)于底片上,底片購買于ThermoFisher Scientific公司(Rockford,USA)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 19.0(Statistics Package for Social S-cience,SPSS,Chicago,IL)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和分析。采用單因素方差分析(ANOVA),不同組間選擇方差齊性檢驗(yàn)下的LSD檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析。數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。P<0.05被認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 明膠包被培養(yǎng)促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞形成多細(xì)胞聚集體

為了考察明膠包被培養(yǎng)對RAW264.7細(xì)胞的形態(tài)是否有影響,采用10 mg/mL明膠包被培養(yǎng)細(xì)胞24 h。相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),明膠包被培養(yǎng)方式下,RAW264.7細(xì)胞形成多細(xì)胞聚集體,并從培養(yǎng)板脫離,懸浮于培養(yǎng)液中(圖1)。

圖1 明膠對RAW264.7細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響相差顯微鏡觀察拍照(標(biāo)尺:100 μm)。Fig.1 Effect of gelatin on morphology of RAW264.7 cellsThe images were taken under a phase contrast microscope(scale bar:100 μm).

2.2 明膠以濃度和時(shí)間依賴性的方式促進(jìn)多細(xì)胞聚集體的形成

為了考察多細(xì)胞聚集體的大小是否與明膠濃度和作用時(shí)間有關(guān),采用不同質(zhì)量濃度明膠包被培養(yǎng)細(xì)胞24 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞多聚體的大小隨著明膠質(zhì)量濃度的增加而增大(圖2A)。而且,當(dāng)RAW264.7細(xì)胞在10 mg/mL明膠上培養(yǎng)12 h、24 h、36 h和48 h時(shí),細(xì)胞聚集體的大小隨時(shí)間延長而增加(圖2B)。這些結(jié)果說明,明膠誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞形成多細(xì)胞聚集體具有一定的濃度和時(shí)間依賴性。我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用10 mg/mL明膠培養(yǎng)24 h。

為了考察傳統(tǒng)培養(yǎng)對多細(xì)胞聚集體的影響,將用不同質(zhì)量濃度的明膠包被培養(yǎng)24 h的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到未包被明膠的培養(yǎng)板中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)多細(xì)胞聚集體重新培養(yǎng)到未包被明膠的培養(yǎng)板上時(shí),這些多細(xì)胞聚集體解離并重新貼壁生長(圖2C)。

圖2 明膠以濃度和時(shí)間依賴性的方式促進(jìn)多細(xì)胞聚集體的形成(A)不同質(zhì)量濃度明膠培養(yǎng)RWA264.7細(xì)胞24 h;(B)10 mg/mL明膠培養(yǎng)12 h、24 h、36 h和48 h;(C)未包被明膠的培養(yǎng)板促進(jìn)多細(xì)胞聚集體解聚并貼壁生長。相差顯微鏡觀察拍照(標(biāo)尺:100 μm)。Fig.2 Gelatin induced the aggregate formation of RAW264.7 cells in a concentration-and time-dependent manner(A)Cell culture on plates coated with different concentrations of gelatin solution for 24 h;(B)Cell culture on 10 mg/mL gelatin for different incubation times;(C)Cell culture on plates without gelatin coating(the cell aggregate disaggregated and grew adhering to the wall).All the images were taken under a phase contrast microscope(scale bar:100 μm).

2.3 明膠對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

為了考察細(xì)胞聚集是否影響RAW264.7細(xì)胞的存活率,采用不同質(zhì)量濃度的明膠分別培養(yǎng)細(xì)胞24 h和48 h,用MTT法檢測細(xì)胞的存活情況。結(jié)果顯示,不同質(zhì)量濃度明膠包被培養(yǎng)不同時(shí)間下,RAW264.7細(xì)胞形成的多細(xì)胞聚集不影響細(xì)胞的存活(圖 3)。

圖3 明膠不影響RAW264.7細(xì)胞的存活率采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和分析。數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。Fig.3 Gelatin did not influence the viability of RAW-264.7 cellsData are presented as mean±SD from three independent experiments,analyzed by SPSS 19.0 software.

2.4 明膠包被培養(yǎng)促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子

在皮膚燒傷等病理環(huán)境下,膠原會變性成明膠,同時(shí)誘導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。我們猜想炎癥反應(yīng)是否與明膠大量生成有關(guān)。因此,將RAW264.7細(xì)胞用10 mg/mL明膠包被培養(yǎng)24 h,檢測培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),明膠包被培養(yǎng)促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞生成IL-1β和TNF-α(圖4)。這提示明膠的大量生成可介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

圖4 明膠包被培養(yǎng)促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞生成促炎性細(xì)胞因子采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和分析。數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。*P<0.05,**P<0.01,與control組相比。Fig.4 Gelatin-coated plates promoted production of proinflammatory cytokines in RAW264.7 cellsData are presented as mean±SD from three independent experiments,analyzed by SPSS 19.0 software.*P<0.05,**P<0.01 versus the control group.

2.5 明膠通過NF-κB促進(jìn)多細(xì)胞聚集體的形成和促炎性細(xì)胞因子的釋放

NF-κB作為參與炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子,可以誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。我們猜想NF-κB是否在明膠促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子中發(fā)揮重要作用?；诖?我們首先通過蛋白質(zhì)印跡法考察了明膠對RAW264.7細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,明膠(10 mg/mL)顯著上調(diào)NF-κB蛋白的表達(dá)(圖5A)。隨后,采用NF-κB抑制劑PDTC處理細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),明膠促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞釋放IL-1β和TNF-α,但PDTC的處理顯著逆轉(zhuǎn)了此作用(圖5B～C)。為了進(jìn)一步考察NF-κB是否調(diào)控細(xì)胞多聚體的形成,我們觀察了PDTC處理后細(xì)胞的形態(tài),發(fā)現(xiàn)PDTC能夠抑制細(xì)胞多聚體的形成(圖5D)。這些結(jié)果說明,明膠通過NF-κB介導(dǎo)細(xì)胞聚集和促炎因子的生成。

圖5 明膠通過NF-κB促進(jìn)多細(xì)胞聚集體的形成和促炎性細(xì)胞因子的釋放(A)明膠包被培養(yǎng)上調(diào)RAW264.7細(xì)胞中NF-κB蛋白的表達(dá);(B)PDTC處理可抑制明膠對IL-1β生成的促進(jìn)作用;(C)PDTC處理可抑制明膠對TNF-α生成的促進(jìn)作用;(D)PDTC處理抑制了明膠對細(xì)胞多聚體形成的促進(jìn)作用。相差顯微鏡觀察拍照(標(biāo)尺:100 μm)。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和分析。數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。***P<0.001,與control組相比;##P<0.01,###P<0.001,與gelatin組相比。Fig.5 Gelatin acted on RAW264.7 cells through NF-κB signaling pathway(A)Gelatin increased the expression of NF-κB protein in RAW264.7 cells;(B)Increased release of IL-1β in RAW264.7 cells cultured on a gelatin-coated plate was reversed by PDTC treatment;(C)TNF-α production increased by gelatin was inhibited by PDTC treatment;(D)Cell aggregation promoted by gelatin was suppressed by PDTC treament.All the images were taken under a phase contrast microscope(scale bar:100 μm).Data are presented as mean±SD from three independent experiments,analyzed by SPSS 19.0 software.***P<0.001 versus the control group;##P<0.01,###P<0.001 versus the gelatin-coated group.

3 討論

細(xì)胞外基質(zhì)作為維持細(xì)胞微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要組成部分,其成分的改變會導(dǎo)致細(xì)胞行為和功能發(fā)生異常,從而誘導(dǎo)組織纖維化、慢性炎癥以及癌癥等多種疾病的發(fā)生[4]。膠原是機(jī)體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)。皮膚創(chuàng)傷或燒傷會導(dǎo)致膠原降解或變性成明膠。同時(shí),皮膚燒傷會激活并募集巨噬細(xì)胞遷移到炎癥部位,釋放大量的促炎因子[13～14]。這提示明膠在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。因此,研究明膠對免疫細(xì)胞的影響,對更好地探究細(xì)胞外基質(zhì)成分改變在疾病發(fā)展中的作用具有深遠(yuǎn)意義。

有研究發(fā)現(xiàn),慢性銀屑病皮膚炎癥可誘導(dǎo)單核細(xì)胞聚集[15]。本研究發(fā)現(xiàn),明膠包被培養(yǎng)促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞形成多細(xì)胞聚集體,同時(shí)對細(xì)胞的存活無影響(圖1和圖3)。膠原釋放的片段可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[7]。我們的研究結(jié)果顯示,明膠能夠促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞釋放IL-1β和 TNF-α (圖4)。NF-κB可介導(dǎo)促炎因子的表達(dá)[16],本研究發(fā)現(xiàn)明膠可通過NF-κB促進(jìn)促炎因子的釋放(圖5)。免疫細(xì)胞在炎癥過程中起著關(guān)鍵的作用。這提示膠原的變性或降解產(chǎn)物可能通過影響免疫細(xì)胞的行為和功能介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。炎性細(xì)胞募集到損傷部位后可產(chǎn)生大量活性氧,同時(shí)分泌炎性介質(zhì),從而導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的過度表達(dá),MMPs的過表達(dá)可進(jìn)一步增加細(xì)胞外基質(zhì)的降解[17]。這說明明膠的大量產(chǎn)生會加劇炎癥反應(yīng),而炎癥反應(yīng)又可能促進(jìn)膠原的降解,從而加重疾病。有文獻(xiàn)報(bào)道,促炎因子可增加白細(xì)胞的聚集[18]。本研究發(fā)現(xiàn)NF-κB抑制劑PDTC能夠抑制RAW264.7細(xì)胞的聚集(圖5)。此外,有研究發(fā)現(xiàn)吞噬細(xì)胞黏附到細(xì)胞外基質(zhì)衍生片段能夠增強(qiáng)其吞噬功能,如纖維連接蛋白[19]。我們猜想明膠促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞形成多細(xì)胞聚集體的同時(shí)是否會增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能？因此,后續(xù)研究可以進(jìn)一步探究明膠對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及吞噬功能的影響。

綜上所述,本研究顯示,明膠通過NF-κB信號通路促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞形成多細(xì)胞聚集體和釋放促炎性細(xì)胞因子。這為未來更好地研究細(xì)胞外基質(zhì)在疾病發(fā)展過程中的作用提供了一定的數(shù)據(jù)支撐。