李小梅,李榮華,符小玉,李 穎,傅 蕾*

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院a.感染科&湖南病毒性肝炎重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;b.核醫(yī)學(xué)科,中國湖南長沙410008)

乙型肝炎相關(guān)慢加急性肝衰竭(hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure,HBVACLF)是在慢性乙肝病毒感染基礎(chǔ)上發(fā)生的急性肝功能衰竭,可有出血、感染、肝性腦病和肝腎綜合征等嚴(yán)重并發(fā)癥,4周病死率為39.9%[1]。HBVACLF患者病情進(jìn)展隱匿,出現(xiàn)臨床癥狀時疾病大多已進(jìn)入晚期,內(nèi)科綜合治療效果差,預(yù)后不良[2]。因此,尋找能早期診斷HBV-ACLF的新的標(biāo)志物,在疾病早期及時干預(yù),阻止病情進(jìn)一步發(fā)展,改善患者預(yù)后,成為急需解決的問題。Wu等[3]發(fā)現(xiàn),外周血中纖溶酶原的水平隨著慢性肝病的進(jìn)展不斷降低,纖溶酶原水平與HBV-ACLF的臨床病程密切相關(guān),纖溶酶原可能是HBV-ACLF潛在的早期診斷和預(yù)后標(biāo)志物。但是,這項(xiàng)研究尚處于初步階段,許多發(fā)現(xiàn)還需進(jìn)一步嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)來反復(fù)驗(yàn)證,纖溶酶原指標(biāo)距離臨床應(yīng)用還有很長的路要走。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lnc-RNA)是轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt且不具備編碼蛋白質(zhì)功能的一類RNA。其在表觀遺傳學(xué)、基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾和翻譯過程中均具有作用,在多個層面調(diào)控基因的表達(dá),廣泛地參與機(jī)體的生理病理過程[4～5]。研究表明,lncRNA MCM3AP-AS1[6]、lnc-RNA-PXN-AS1[7]和 lncRNA CASC9[8]在肝癌組織中表達(dá)失調(diào),其表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān),這些lncRNA分子可能是肝癌潛在的早期分子診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。lncRNA在肝炎、非酒精性脂肪肝、肝纖維化等肝臟疾病中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[9],但目前尚無關(guān)于lncRNA在HBV-ACLF患者中表達(dá)水平的文獻(xiàn)報道。因此,本研究首次通過高通量測序檢測HBV-ACLF患者中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜,并進(jìn)一步對lncRNA在HBV-ACLF中的功能進(jìn)行探討。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本實(shí)驗(yàn)分為乙肝攜帶者(asymptomatic carrier,ASC)組和HBV-ACLF患者組,每組各選取5例患者進(jìn)行研究,樣本收集自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院感染科門診和住院部。ASC與HBV-ACLF患者是根據(jù)2015年《慢性乙型肝炎防治指南》[10]和2018年《肝衰竭診治指南》[11]中的標(biāo)準(zhǔn)來確診的。排除標(biāo)準(zhǔn):1)其他各型病毒性肝炎;2)酒精性肝炎;3)自身免疫性肝病;4)非酒精性脂肪肝等;5)妊娠患者;6)合并腫瘤等。該研究符合人體倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn),已獲得中南大學(xué)湘雅醫(yī)院倫理委員會的許可(倫理委員會批號:2019030199),并得到了參與研究患者的知情同意。

1.2 試劑及材料

Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司);2100生物分析儀及其配套使用的RNA 6000 Nano Lab-Chip試劑盒(美國Agilent公司);核糖體RNA去除試劑盒Epicentre Ribo-Zero Gold(美國Illumina公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Illumina公司);測序儀Il lumina HiSeq 4000(杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司)。

1.3 全血總RNA提取及純化

應(yīng)用Trizol試劑盒提取外周血中總RNA,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。對提取的總RNA采用2100生物分析儀和RNA 6000 Nano LabChip試劑盒進(jìn)行質(zhì)檢,RNA完整值(RNA integrity number,RIN)在7.0以上為質(zhì)檢合格。選取10 μg通過質(zhì)檢的RNA,使用Epicentre Ribo-Zero Gold試劑盒去除核糖體RNA,操作過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 芯片雜交和高通量測序

純化后的聚(A)-或聚(A)+RNA在高溫下被二價陽離子降解為RNA片段。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA片段逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增以構(gòu)建測序文庫,配對末端文庫的平均插入片段為300(±50)bp。在 Illumina HiSeq 4000測序儀上對測序文庫采用單端測序(single-end sequencing)程序進(jìn)行高通量測序,測序模式PE150。

1.5 差異表達(dá)分析

對高通量測序獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,以獲得有效數(shù)據(jù)。采用FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)來度量lncRNA及mRNA在不同樣本中的表達(dá)水平,即lncRNA/mRNA表達(dá)量=FPKM值。應(yīng)用DESeq軟件包對兩組樣本的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平進(jìn)行差異計(jì)算,同一轉(zhuǎn)錄本在兩組樣本間是否差異表達(dá)主要根據(jù)P值及差異倍數(shù)(fold change,FC)來確定。P<0.05表明差異表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,|log2FC|≥1表明同一個lncRNA或mRNA在兩組樣本間差異表達(dá)。

1.6 GO功能注釋、KEGG通路富集分析及cis預(yù)測

應(yīng)用基因本體論(Gene Ontology,GO;http://david.abcc.ncifcrf.gov/)分析描述差異表達(dá)lncRNA的功能屬性。把所有差異表達(dá)lncRNA的基因向GO數(shù)據(jù)庫的各條目映射,計(jì)算各個條目上差異表達(dá)基因的數(shù)目,然后根據(jù)基因數(shù)目確定差異表達(dá)基因顯著富集的GO條目,從而探索差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能[12]。應(yīng)用京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG;www.genome.jp/kegg)分析探討差異表達(dá)基因參與的信號通路。以KEGG通路為單位,找出差異表達(dá)基因富集的信號通路,并通過費(fèi)希爾精確檢驗(yàn)(Fisher’s exact test)計(jì)算每條通路上差異基因富集的顯著性(以P<0.05作為篩選條件,P值越小,差異基因與此信號通路的關(guān)系越密切)[13]。lncRNA調(diào)控基因表達(dá)的方式主要包括順式調(diào)控(cis regulation)和反式調(diào)控(trans regulation)兩類[14～15]。Cis調(diào)控是指lncRNA調(diào)節(jié)其上游和下游100 kb范圍內(nèi)編碼基因的轉(zhuǎn)錄激活,從而影響mRNA的表達(dá)水平。根據(jù)cis調(diào)控方式進(jìn)行l(wèi)ncRNA靶基因預(yù)測,主要是基于lncRNA與靶基因之間的位置關(guān)系,并以Pearson相關(guān)系數(shù)≥0.95且P≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。文中應(yīng)用cis調(diào)控預(yù)測差異表達(dá)lncRNA調(diào)控的靶mRNA。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的臨床特征

HBV-ACLF組和ASC組的5例患者均為3名男性、2名女性,年齡均在40歲左右。HBV-ACLF組總膽紅素(total bilirubin,TBIL)均在171 μmol/L以上,且凝血酶原活動度(prothrombin activity,PTA)均在40%以下。而ASC組的肝酶均在正常范圍內(nèi),且HBV-DNA值均低于檢測下限,提示ASC組為非活動性乙肝攜帶者(表1)。

表1 兩組患者的臨床特征Table 1 Clinical characteristics of two groups of patients

2.2 HBV-ACLF組和ASC組間差異表達(dá)的lnc-RNA及mRNA

高通量測序結(jié)果表明,與ASC組相比,HBVACLF組的lncRNA表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化,共有131個lncRNA在HBV-ACLF組差異表達(dá)。其中,114個lncRNA表達(dá)上調(diào)(log2FC≥1,P<0.05),17個 lncRNA 表達(dá)下調(diào)(log2FC≤-1,P<0.05)(圖1)。上調(diào)最顯著的前4位lncRNA分別為PIGC(FC=14.60)、CYB5R4(FC=4.71)、SCAF11(FC=4.60)和IRAK3(FC=4.03)(表2),下調(diào)最顯著的4個lnc-RNA 依次為 THRB(FC=0.25)、ABCC4(FC=0.29)、RP11-25K21.6(FC=0.29)和TNFSF13B(FC=0.30)(表3)。研究表明,lncRNA可通過多種方式作用于mRNA,影響mRNA的表達(dá)[16]。因此,本研究同時對兩組樣本的mRNA表達(dá)譜進(jìn)行了高通量測序分析,共篩選出338個差異表達(dá)的mRNA,其中137個mRNA在HBV-ACLF組中表達(dá)上調(diào)(log2FC≥1,P<0.05),201個mRNA表達(dá)下調(diào)(log2FC≤-1,P<0.05)(圖2)。

圖1 HBV-ACLF組與ASC組的lncRNA差異表達(dá)譜(A)聚類熱圖。縱坐標(biāo)代表前100個差異表達(dá)最顯著的lncRNA,橫坐標(biāo)上LQ、XQ、ZHX、YJL和XWF為ASC組樣本,LSG、YJG、YCM、YYH和DYF為HBV-ACLF組樣本;(B)火山圖。Fig.1 Differentially expressed lncRNAs between HBV-ACLF group and ASC group(A)The heat map.The ordinate represents the top 100 lncRNAs with the most significantly differential expression.The abscissa includes samples LQ,XQ,ZHX,YJL and XWF from the ASC group,and LSG,YJG,YCM,YYH and DYF from the HBV-ACLF group;(B)The volcano map.

圖2 HBV-ACLF組與ASC組的mRNA差異表達(dá)譜(A)聚類熱圖?？v坐標(biāo)代表前100個差異表達(dá)最顯著的mRNA,橫坐標(biāo)上LQ、XQ、ZHX、YJL和XWF為ASC組樣本,LSG、YJG、YCM、YYH和DYF為HBV-ACLF組樣本;(B)火山圖。Fig.2 Differentially expressed mRNAs between HBV-ACLF group and ASC group(A)The heat map.The ordinate represents the top 100 mRNAs with the most significantly differential expression.The abscissa includes samples LQ,XQ,ZHX,YJL and XWF from the ASC group,and LSG,YJG,YCM,YYH and DYF from the HBV-ACLF group;(B)The volcano map.

表2 上調(diào)表達(dá)差異最顯著的前10位lncRNATable 2 Top 10 lncRNAs with the most significantly up-regulated expression

表3 下調(diào)表達(dá)差異最顯著的前10位lncRNATable 3 Top 10 lncRNAs with the most significantly down-regulated expression

2.3 GO功能注釋和KEGG通路富集分析結(jié)果

測序分析已表明lncRNA在HBV-ACLF中表達(dá)失調(diào)。為進(jìn)一步探究差異表達(dá)lncRNA的生物學(xué)功能,本研究對差異表達(dá)lncRNA的基因開展了GO功能注釋分析,結(jié)果顯示:差異表達(dá)lnc-RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、胞質(zhì)溶膠等細(xì)胞組分;具有蛋白質(zhì)結(jié)合、聚(A)RNA結(jié)合和ATP結(jié)合等多種分子功能;主要參與小分子物質(zhì)代謝、病毒復(fù)制、病毒過程、固有細(xì)胞免疫、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、lncRNA表達(dá)、病毒周期和病毒轉(zhuǎn)錄等生物過程(圖3)。KEGG通路富集分析表明,差異表達(dá)lnc-RNA主要與核黃素代謝、類固醇激素生物合成、果糖和甘露糖代謝、卟啉和葉綠素代謝、葉酸生物合成、氨基酸和核苷酸代謝等通路有關(guān)(圖4)。

圖3 差異表達(dá)lncRNA的GO功能注釋分析柱狀圖Fig.3 Histogram of GO function annotation analysis of differentially expressed lncRNAs

圖4 差異表達(dá)lncRNA的KEGG通路富集分析散點(diǎn)圖“Rich factor”表示該KEGG通路上差異lncRNA數(shù)與總lncRNA數(shù)的比值。Fig.4 Scatter plot of KEGG analysis of differentially expressed lncRNAs“Rich factor”represents the ratio of the number of differential lncRNAs to the total number of lncRNAs on the KEGG.

2.4 lncRNA的cis預(yù)測

本研究共篩選出206對lncRNA-mRNA順式調(diào)控子。在這206對調(diào)控子中,RP11-603J24.17、PIGC、RP11-504I13.3、MEGF9 為差異表達(dá)的 lnc-RNA(|log2FC|≥1,P<0.05),且 lncRNA PIGC 在HBV-ACLF中上調(diào)表達(dá)最顯著(表2)。另外,lnc-RNA PIGC-mRNA ENST00000484368順式調(diào)控對中的lncRNA及mRNA在HBV-ACLF中均顯著差異表達(dá)(|log2FC|≥1,P<0.05)(表 4)。

表4 lncRNA-mRNA的cis預(yù)測Table 4 lncRNA-mRNA cis prediction

3 討論

中國是乙肝大國,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染是ACLF最主要的病因。ACLF主要表現(xiàn)為高黃疸和凝血功能障礙合并腹水或肝性腦病,28 d病死率高[11]。目前,ACLF的診斷界限尚未統(tǒng)一,歐洲以TBIL>12倍正常上限值作為診斷界限;亞太肝病研究學(xué)會(Asian-Pacific Association for the Study of the Liver,APASL)以TBIL>5倍正常值上限且國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(international normalized ratio,INR)在1.5以上作為診斷界限;中國則以TBIL>10倍正常值上限且PTA<40%作為診斷界限[17]。根據(jù)中國現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)患者被診斷為HBV-ACLF時肝細(xì)胞已大量壞死,并已伴有其他多個器官功能衰竭,失去了治療良機(jī)。

lncRNA因不具備編碼蛋白質(zhì)的功能,在發(fā)現(xiàn)的初期被認(rèn)為不具備生物功能,是轉(zhuǎn)錄過程中的“分子噪音”。近年來,隨著二代測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在多種疾病中均發(fā)揮著重要調(diào)控作用。前列腺癌基因3(prostate cancer gene 3,PCA3)是前列腺癌中最具特異性的lncRNA,可以在尿液中被檢測出來,與前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen,PSA)不同,PCA3的表達(dá)水平不受患者年齡、炎癥、創(chuàng)傷或活檢的影響。PCA3作為檢測前列腺癌的標(biāo)志物已獲得美國食品藥物監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)的批準(zhǔn)[18]。lncRNA LINC00319在膀胱癌中發(fā)揮致癌作用,其在膀胱癌中的表達(dá)上調(diào)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲,很可能是膀胱癌潛在的治療靶點(diǎn)[19]。lncRNA在肝癌中同樣具有重要作用。Xie等[20]發(fā)現(xiàn)lncRNA PDIA3P1在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表達(dá)水平明顯高于其癌旁組織,且PDIA3P1的高表達(dá)能加速HCC的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。目前,lncRNA在HBVACLF中的表達(dá)情況及功能尚不清楚。

本研究通過高通量測序技術(shù)檢測HBV-ACLF組和ASC組的lncRNA表達(dá)譜,以|log2FC|≥1且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)lncRNA。結(jié)果顯示,與ASC組相比,HBV-ACLF患者中l(wèi)ncRNA的表達(dá)水平存在明顯變化(圖1,表2～3),共有131個lncRNA顯著差異表達(dá),其中114個上調(diào),17個下調(diào)。lncRNA可充當(dāng)競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)分子,與mRNA競爭性結(jié)合miRNA,從而調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)。為了更進(jìn)一步研究lncRNA在HBV-ACLF中的作用,本研究同時檢測了mRNA在HBV-ACLF組及ASC組的表達(dá)水平(圖2),結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有338個mRNA在HBV-ACLF組中顯著差異表達(dá),其中201個mRNA下調(diào),137個上調(diào)。因此,我們推測lncRNA可能通過作用于mRNA從而在HBV-ACLF的發(fā)生及進(jìn)展過程中發(fā)揮作用。

差異表達(dá)lncRNA基因的GO分析顯示,這些lncRNA主要定位于細(xì)胞質(zhì),具有與蛋白質(zhì)結(jié)合等功能(圖3)。lncRNA的功能主要由其細(xì)胞定位決定,胞質(zhì)lncRNA參與蛋白質(zhì)的翻譯后修飾,調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性,或作為ceRNA發(fā)揮分子海綿的作用[21],這與上文lncRNA通過作用于mRNA發(fā)揮作用的推測是一致的。慢性HBV感染進(jìn)展為HBV-ACLF的根本原因是HBV的復(fù)制,HBV的復(fù)制力在乙肝重癥化的過程中具有重要意義。GO分析發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)lncRNA參與病毒周期、病毒轉(zhuǎn)錄、病毒DNA復(fù)制等生物過程(圖3),因此,我們推測lncRNA通過影響肝臟內(nèi)HBV的復(fù)制及細(xì)胞周期,使HBV在肝臟內(nèi)的復(fù)制增強(qiáng),從而在HBV-ACLF進(jìn)展過程中發(fā)揮作用。HBV感染肝細(xì)胞后,自身免疫系統(tǒng)識別病毒表面蛋白,引發(fā)免疫清除反應(yīng),在清除病毒的同時破壞自身肝細(xì)胞,導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)。其中,T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,尤其是CD4+T淋巴細(xì)胞[22]。同時,固有免疫也發(fā)揮著必不可少的作用,肝臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞又稱為庫普弗細(xì)胞(Kupffer cell),當(dāng)HBV感染肝細(xì)胞后,庫普弗細(xì)胞被激活,其抗原提呈作用增強(qiáng),并招募白細(xì)胞等炎性細(xì)胞聚集,參與肝臟的炎癥反應(yīng)[23]。本研究通過GO分析證實(shí),在HBV-ACLF中差異表達(dá)的lncRNA參與固有細(xì)胞免疫過程(圖3),因此,我們推測lnc-RNA從HBV感染本身及機(jī)體免疫反應(yīng)兩方面對HBV-ACLF進(jìn)展發(fā)揮作用。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),這些差異表達(dá)lncRNA主要富集于小分子物質(zhì)代謝通路,包括核黃素、類固醇激素、果糖和甘露糖、卟啉和葉綠素、葉酸、氨基酸及核苷酸等物質(zhì)的代謝過程(圖4)。肝臟內(nèi)幾乎含有機(jī)體所有的酶類,各種代謝活動十分活躍,是機(jī)體新陳代謝的中心樞紐,是小分子物質(zhì)代謝的主要場所。因此,差異表達(dá)lncRNA通過影響肝臟營養(yǎng)物質(zhì)及非營養(yǎng)物質(zhì)的代謝,在ACLF中發(fā)揮作用。

lncRNA可通過cis調(diào)控影響基因的表達(dá)。文中的cis預(yù)測結(jié)果顯示,lncRNA PIGC能對距離其1 kb的PIGC基因發(fā)生順式調(diào)控,影響mRNA ENST00000484368的表達(dá)(表4)。結(jié)合PIGC在HBV-ACLF中差異表達(dá)上調(diào)最顯著,lncRNA PIGC很可能在HBV-ACLF中起著重要作用。磷脂酰肌醇聚糖C(phosphatidylinositol glycan C,PIGC)是磷脂酰肌醇聚糖(phosphatidylinositol glycan,PIC)家族中的一員,參與糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)的生物合成,GPI能將蛋白質(zhì)錨定到質(zhì)膜上,PIGC能影響白細(xì)胞上GPI錨定蛋白的表達(dá)[24]。有研究報道,PIGC基因的突變與智力障礙及癲癇相關(guān)[24～25]。目前,關(guān)于PIGC的研究較少,尚未發(fā)現(xiàn)PIGC基因在HBV-ACLF中的研究,我們后期擬進(jìn)一步研究PIGC基因在HBVACLF中的具體作用機(jī)制。

綜上所述,本研究首次通過高通量測序分析對HBV-ACLF和ASC樣本進(jìn)行研究,揭示了HBVACLF患者中l(wèi)ncRNA及mRNA的表達(dá)情況,并通過GO分析及KEGG分析表明lncRNA可能通過影響病毒感染本身、自身免疫反應(yīng)以及小分子物質(zhì)代謝在HBV-ACLF中發(fā)揮作用。其中,lnc-RNA PIGC在HBV-ACLF組上調(diào)表達(dá)最顯著,且能順式調(diào)控mRNA ENST00000484368的表達(dá),因此lncRNA PIGC很可能在HBV-ACLF中具有重要作用,有望成為HBV-ACLF的潛在分子標(biāo)志物或治療靶點(diǎn),但這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。