莫黎杰 劉夏瞳 李慧，2 陸海，2

（1. 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2. 北京林業(yè)大學(xué)林木育種國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

植物蛋白酶廣泛參與蛋白質(zhì)的成熟、重建和降解，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，調(diào)節(jié)著細(xì)胞增殖、分化、衰老和程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death，PCD）等多個生物學(xué)過程［1-2］。蛋白酶功能異常會導(dǎo)致植物正常的生長發(fā)育進(jìn)程受到影響。

蛋白酶通過水解肽鍵將底物裂解為小分子肽段。根據(jù)其催化位點(diǎn)分為4大類：半胱氨酸蛋白酶，絲氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶［3］。MEROPS蛋白酶數(shù)據(jù)庫（http：//merops.sanger.ac.uk）中根據(jù)進(jìn)化關(guān)系將蛋白酶分為253個家族和61個亞家族［4］。擬南芥植物基因組編碼約500-800蛋白酶，分布在60多個家族，30個不同亞家族中［2］，其中半胱氨酸蛋白酶約有140種，可以將其分為5個家族的15個亞家族［5］，本文將重點(diǎn)對半胱氨酸蛋白酶家族的蛋白酶進(jìn)行綜述。植物半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteases，CPs）分為木瓜蛋白酶家族（C1）、液泡加工酶（vacuolar processing enzyme，VPE）、天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶家族（C14）、鈣依賴半胱氨酸蛋白酶家族（C2）和其他半胱氨酸蛋白酶家族［3］。木瓜蛋白酶C1家族可分為C1A和C1B亞家族［6］，其中C1A半胱氨酸蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶中數(shù)量最多的蛋白之一［7］。C1A亞家族的催化位點(diǎn)由高度保守的催化三聯(lián)體組成：Cys 25，His 159和Asn 175，此結(jié)構(gòu)域是區(qū)分該亞家族的重要分類標(biāo)志［8］。根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)特征，可進(jìn)一步將C1A半胱氨酸蛋白酶分為9個亞類，分別是：RD21Alike、RD19A-like、CEP1-like、XCP2-like、XBCP3-like、THI1-like、SAG12-like、AALP-like及CTB3-like［9］。

已有研究報道，植物半胱氨酸蛋白酶在調(diào)控植物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的功能。它們參與種子的貯藏蛋白的降解，根、莖、葉和花等器官的衰老和程序性死亡過程，對目前已經(jīng)研究的參與植物生長發(fā)育過程的主要半胱氨酸蛋白酶及物種進(jìn)行統(tǒng)計 （表1）。本文對植物半胱氨酸蛋白酶在植物各組織生長發(fā)育中的功能研究及其進(jìn)展進(jìn)行綜述并展望，旨為進(jìn)一步研究半胱氨酸蛋白酶的功能提供參考。

表1 半胱氨酸蛋白酶參與植物生長發(fā)育過程Table 1 Cysteine proteases involved in plant growth and development processes

1 葉衰老過程

葉片衰老是植物自然的生理過程，在葉片衰老過程中，葉肉細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解，半胱氨酸蛋白酶介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解在該過程中發(fā)揮重要作用。葉片中蛋白質(zhì)降解后，產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸）被重新轉(zhuǎn)移到生長或儲存組織等部位，從而維持植物進(jìn)一步的生長發(fā)育［10］。研究報道，通過對擬南芥［11］和大麥［12］葉片衰老過程中進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶的表達(dá)和酶活性在葉片衰老過程中會顯著增加。Bhalerao 等［13］對田間衰老的白楊葉片和溫室中幼嫩的葉片分別構(gòu)建cDNA文庫，并對其基因表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，老葉中半胱氨酸蛋白酶的表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）豐富，且相關(guān)基因上調(diào)。

在多個植物中，半胱氨酸蛋白酶特別是木瓜蛋白酶類半胱氨酸蛋白酶C1A，參與葉片衰老過程中蛋白的降解［14］。例如，SAG12［15］、RD21A［16］、AtRD19A、RD19C、ALP / SAG2 / AALP / ALEU［17］、CTB1和CTB3等［18］。除擬南芥以外，其他植物種中發(fā)現(xiàn)與擬南芥AtSAG12同源的蛋白，編碼這些蛋白的基因在葉衰老過程中上調(diào)或在葉片衰老過程中被誘導(dǎo)，參與調(diào)控葉片的衰老過程［14，18］。例 如，油 菜（Brassica napus）BnSAG12（BnSAG12-1和BnSAG12-2）［19］、煙草NtCP1［20］和NtSAG12［21］、水稻OsSAG39［22］、橡膠樹HbSAG12H1［23］及辣椒CaCP［24］。

1.1 SAG12（senescence-associated gene 12）參與調(diào)控葉片衰老過程

半胱氨酸蛋白酶SAG12的表達(dá)模式與葉片衰老過程嚴(yán)格相關(guān)，Lohman等［15］在擬南芥中發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶SAG12蛋白酶在葉片衰老過程被誘導(dǎo)。SAG12啟動子上游-603和-571 bp處含有一段高度保守的區(qū)域［25］，負(fù)責(zé)衰老特異調(diào)節(jié)，被作為擬南芥葉片衰老標(biāo)記基因使用［26-28］。Otegui等［29］對ProSAG12：GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥分析發(fā)現(xiàn)衰老葉片中的SAG12僅含SAV的葉肉和保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)，將SAG12與GFP融合表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SAG12定位于衰老葉片葉肉細(xì)胞和保衛(wèi)細(xì)胞中具有強(qiáng)烈蛋白水解活性的衰老相關(guān)的囊泡中（senescence associated vacuoles，SAVs）。雖然與野生型相比，擬南芥sag12純合突變體并無明顯的葉衰老表型［29］。但是，James等［30］發(fā)現(xiàn)sag12純合突變體中SAG12酶活性降低能夠誘導(dǎo)其他天冬氨酸蛋白酶CND41-like活性增加，來彌補(bǔ)SAG12活性的缺失，共同參與葉片衰老過程中的Rubisco降解。同樣，在油菜葉片衰老過程中，半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等多種蛋白酶被激活，參與Rubisco蛋白降解和氮素轉(zhuǎn)移［31］。James 等［30，32］研究發(fā)現(xiàn)，SAG12在葉片衰老過程中的氮素轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用。在低氮條件下，SAG12不僅能將葉片衰老過程中釋放的氮素轉(zhuǎn)移到種子中，還能將根中蛋白質(zhì)降解釋放出的氮素轉(zhuǎn)移到種子中，為其提供氮素，從而確保種子產(chǎn)量。

水稻中存在與AtSAG12同源的蛋白，即Os-SAG12-1［33］和OsSAG12-2［34］。Singh等［34］對OsSAG12-2的生化功能進(jìn)行研究，大腸桿菌中重組OsSAG12-2能夠自我水解成有功能的蛋白酶，該酶具有蛋白水解酶功能，能水解偶氮酪蛋白底物。OsSAG12-1與AtSAG12相似度最高，在衰老和病原體感染過程中，OsSAG12-1的表達(dá)被誘導(dǎo)，RNAi轉(zhuǎn)基因水稻株系中該基因表達(dá)下調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［33］；在鹽和紫外線脅迫誘導(dǎo)條件下，OsSAG12-2在RNAi轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)下調(diào)會增強(qiáng)脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，過量表達(dá)OsSAG12-1 和OsSAG12-2可減緩死亡過程［33］。說明OsSAG12-1和OsSAG12-2都是脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)節(jié)因子［34］。

1.2 HvPap-14參與葉綠體蛋白的降解來介導(dǎo)葉片衰老過程

作為單子葉植物，大麥被用于研究單子葉植物中葉片衰老的模式植物。大麥的C1A家族由41個成員組成（HvPap-1至HvPap-42），在黑暗誘導(dǎo)條件下，對大麥葉片衰老過程中C1A家族成員的蛋白酶基因表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，HvPap-4、HvPap-7、HvPap-8、HvPap-13、HvPap-14、HvPap-15和 HvPap-22在衰老葉片中表達(dá)上調(diào)［18］。Díaz-Mendoza等［18］對黑暗誘導(dǎo)衰老葉片中的大麥半胱氨酸蛋白酶進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，HvPap-1和HvPap-19定位于衰老葉片葉肉細(xì)胞的小囊泡（可能是SAV），它們參與葉綠體蛋白降解的過程。HvPap-1在黑暗和氮缺乏的條件下被誘導(dǎo)［12］。在自然衰老和黑暗誘導(dǎo)衰老過程中，過表達(dá)HvPap-1加速了葉片的衰老，而HvPap-1沉默則延遲了葉片衰老過程［12］，說明HvPap-1參與調(diào)控葉片衰老過程。在干旱脅迫條件下，HvPap-1和HvPap-19表達(dá)上調(diào)，HvPap-1和HvPap-19的敲除可減少干旱脅迫條件下葉片蛋白質(zhì)的降解［35］。HvPap-14基因在衰老的葉片中表達(dá)量最高［36］。Frank等［37］免疫電鏡分析發(fā)現(xiàn)其酶原存在于類囊體膜和類囊體腔中，而HvPap-14的成熟酶定位于葉綠體類囊體膜上；體外激活實(shí)驗(yàn)證實(shí)HvPap-14酶原在pH<6條件下被激活為成熟酶；酶活分析發(fā)現(xiàn)HvPap-14的底物是LHCB（葉綠素a/b結(jié)合蛋白），PSBO（光系統(tǒng)II的外周蛋白）和葉綠體蛋白Rubisco大亞基，說明在葉片衰老過程中，大麥HvPap-14大量表達(dá)并被激活，通過參與葉綠體類囊體膜蛋白和Rubisco大亞基的降解，來介導(dǎo)葉片衰老的過程［12］。

總之，半胱氨酸蛋白酶通過催化葉綠體中Rubisco蛋白的降解，實(shí)現(xiàn)氮素的轉(zhuǎn)移，是葉片衰老過程中蛋白質(zhì)降解的重要途徑。除了SAG12，越來越多的半胱氨酸蛋白酶被發(fā)現(xiàn)參與該過程，它們之間存在功能相似性，在不同衰老條件下，其酶學(xué)機(jī)制及蛋白質(zhì)降解底物和降解途徑是否也存在相似性，有待進(jìn)一步研究。

2 維管組織的PCD過程

植物維管組織中木質(zhì)部細(xì)胞中導(dǎo)管分子和纖維細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡（PCD）過程，其液泡破裂，并釋放出半胱氨酸蛋白酶和其他水解酶，內(nèi)容物降解并形成空腔，同時次生壁發(fā)生增厚，從而使導(dǎo)管分子（tracheary element，TE）具有輸水功能［38-39］。

2.1 ZCP4參與導(dǎo)管分子PCD過程

半胱氨酸蛋白酶在導(dǎo)管分子PCD過程中被誘導(dǎo)。體外培養(yǎng)百日草懸浮細(xì)胞可誘導(dǎo)形成導(dǎo)管分子，被廣泛用于研究導(dǎo)管分子分化的模式系統(tǒng)。百日草ZCP4編碼木瓜蛋白酶類的半胱氨酸蛋白酶，在TE早期分化過程的PCD中起作用［40-41］。ZCP4基因在TE分化早期［42-43］表達(dá)，在擬南芥中表達(dá)proZCP4∶GUS，觀察其在木質(zhì)部導(dǎo)管分子分化過程中的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，ZCP4在子葉、胚軸和根中早期分化的導(dǎo)管分子（TE）中特異表達(dá)，而且僅在未成熟的導(dǎo)管分子中表達(dá)，而不在成熟導(dǎo)管分子和其他細(xì)胞中表達(dá)，說明可作為導(dǎo)管分子早期分化的標(biāo)記基因［44］。對ZCP4啟動子進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，11 bp的導(dǎo)管分子順式作用元件TERE（tracheary-elementregulating cis-element）序 列（CTTNAAAGCNA）是TE特異表達(dá)所必須的，它決定了該基因在TE特異性表達(dá)模式。除ZCP4以外，TERE順式作用元件也存在于TE分化過程中與PCD相關(guān)的蛋白酶基因和與次生壁形成相關(guān)基因的啟動子中，說明TERE順式作用元件也決定了這些基因在TE中的表達(dá)特 異性［45］。

2.2 AtXCP1（xylem cysteine protease 1）和AtXCP2參與木質(zhì)部導(dǎo)管分子PCD過程

擬南芥半胱氨酸蛋白酶AtXCP1和AtXCP2為同源蛋白，二者在木質(zhì)部中特異性表達(dá)，并在木質(zhì)部導(dǎo)管分子（tracheary elements，TEs）PCD中發(fā)揮作用［46］。XCP1和XCP2編碼約40 kD的前體蛋白，在酸性條件下中，去除N端信號肽和和前體結(jié)構(gòu)域，XCP1和XCP2被激活，形成具有活性的成熟蛋白酶。利用XCP1和XCP2啟動GUS融合蛋白表達(dá)，研究其在擬南芥中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)二者均在分化的TE中表達(dá)［46］。XCP1和XCP2在根的TE自溶過程中發(fā)揮作用［47］。Avci等［47］將根中TE的自溶過程分為兩個步驟，第一步是微自溶（micro-autolysis）即中央大液泡完整時發(fā)生的自溶；第二步，大規(guī)模自溶（mega-antolysis）即中央大液泡破裂后引起的自溶。通過對xcp1、xcp2單突變體和 xcp1 xcp2雙突變體根中TE的自溶過程進(jìn)行電鏡分析發(fā)現(xiàn)，XCP1和XCP2主要參與中央液泡破裂前的微自溶過程，同時也與其他水解酶一起，參與了液泡膜破裂后細(xì)胞內(nèi)容物清除的過程。在xcp1單突變體和xcp1 xcp2雙突變體中，由于XCP1表達(dá)缺失，TE空腔中出現(xiàn)內(nèi)容物未完全降解的現(xiàn)象，而且xcp1 xcp2雙突變體中未降解的內(nèi)容物比xcp1更致密，而xcp2突變體的表型與野生型差不多，說明在微自溶過程中XCP1發(fā)揮的作用要大于XCP2的作用［47］。

2.3 γVPE參與木質(zhì)部纖維細(xì)胞的PCD過程

液泡加工酶（VPE）屬于一類新的半胱氨酸蛋白酶，在植物中調(diào)節(jié)液泡蛋白的成熟和活化，通過液泡降解來介導(dǎo)植物細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡過程（PCD）。在擬南芥中有αVPE、βVPE、γVPE和δVPE四個蛋白酶，根據(jù)其表達(dá)部位，可以分為營養(yǎng)性VPE和種子型VPE，其中αVPE和γVPE在營養(yǎng)器官表達(dá)，βVPE和δVPE在種子中表達(dá)［48］。研究表明，γVPE在營養(yǎng)組織中表達(dá)，且在莖的形成層，初級韌皮部和初級木質(zhì)部中特異性表達(dá)［49-50］。γVPE在木質(zhì)部細(xì)胞的PCD過程中發(fā)揮重要作用。在與野生型擬南芥相比，γvpe突變體中木纖維細(xì)胞內(nèi)容物降解延遲和細(xì)胞次生壁增厚。體外實(shí)驗(yàn)表明，γVPE在pH 值為7.0時以酶原形式存在，在pH 值為5.5條件下可通過自催化轉(zhuǎn)化為40 kD成熟酶。半胱氨酸蛋白酶CEP1也與木質(zhì)部發(fā)育過程中PCD和次生壁增厚有關(guān)［51］，與γVPE存在上下游酶原激活關(guān)系，共同調(diào)控木質(zhì)部細(xì)胞的PCD過程。體外實(shí)驗(yàn)表明，γVPE能在體外催化CEP1酶原，使其轉(zhuǎn)化成成熟蛋白。在γvpe擬南芥突變體的莖發(fā)育過程中，利用Western能檢測大量CEP1酶原，但缺少CEP1成熟酶，說明γVPE的缺失導(dǎo)致CEP1蛋白酶的成熟受到抑制。表明γVPE通過激活CEP1酶原的成熟來調(diào)控莖木質(zhì)部細(xì)胞的發(fā)育，參與莖發(fā)育過程中木質(zhì)部纖維細(xì)胞的PCD過程［52］。

半胱氨酸蛋白酶是調(diào)控維管組織PCD過程的關(guān)鍵酶類，參與該過程的蛋白酶存在普遍的冗余現(xiàn)象，多個酶擁有相似或相近的功能，卻隸屬于不同的半胱氨酸蛋白酶家族，它們?nèi)绾螀f(xié)調(diào)發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究。

3 種子萌發(fā)過程

隨著谷物種子的發(fā)育和成熟，貯藏蛋白聚集于胚乳中；當(dāng)谷物種子萌發(fā)時，蛋白酶從盾片上皮細(xì)胞和糊粉層釋放到胚乳中，降解胚乳中的貯藏蛋白，產(chǎn)生的氨基酸和小肽被盾片吸收，然后運(yùn)輸?shù)秸谏L的幼苗中，為幼苗的生長和發(fā)育提供所需的氨基酸［53-54］。半胱氨酸蛋白酶的正常啟動是保證種子正常萌發(fā)和幼苗正常生長發(fā)育的關(guān)鍵［55］，因此必須嚴(yán)格控制蛋白酶活性啟動時間節(jié)點(diǎn)，以避免蛋白質(zhì)在非萌發(fā)期被降解而影響種子萌發(fā)。

醇溶蛋白是谷物種子中的主要儲存蛋白，在玉米和小麥種子種子萌發(fā)過程中，半胱氨酸蛋白酶能夠降解約90%醇溶蛋白。在大麥中，42種蛋白酶參與其種子萌發(fā)，其中27種是半胱氨酸蛋白酶［56］。木瓜蛋白酶類的半胱氨酸蛋白酶（C1A）和液泡加工酶（VPE）是參與雙子葉植物和單子葉植物種子萌發(fā)的主要蛋白酶［3，55，57］，負(fù)責(zé)降解種子存儲蛋白，為幼苗的生長提供營養(yǎng)。不同物種中多個半胱氨酸蛋白酶均參與種子萌發(fā)過程中的蛋白質(zhì)降解過程，如單子葉植物大麥EPA［58］、EPB［53-54］、HvPap-19和HvPap-20［59］、aleurain［60］、HvPap-1［61-62］、HvPap-4和HvPap-6［63］、WEB-1［64］、水稻OsVPE-1［65］和REP-1［66］；雙子葉植物擬南芥AP2，PAP3和RD19A［9］；紫云英pSK19［67］，黑吉豆SH-EP［68］和菜豆PvCEP-1［69］等。

3.1 半胱氨酸蛋白酶B（endoprotease B，EPB）參與儲存蛋白的降解

體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，半胱氨酸蛋白酶EPA和EPB均可降解醇溶蛋白。在黑小麥中發(fā)現(xiàn)的EP8是EPA的同源蛋白，在種子萌發(fā)過程中在糊粉層中合成，負(fù)責(zé)在種子發(fā)芽過程中動員存儲的蛋白質(zhì)，其活性可被內(nèi)源性胱抑素TrcC-4抑制［54］。Koehler 等［70］從大麥中分離和鑒定出半胱氨酸蛋白酶B（EPB1和EPB2）。Mikkonen等［53］通過原位雜交發(fā)現(xiàn)EPB在種子發(fā)芽后24 h在上皮細(xì)胞中表達(dá)，然后定位于胚乳周圍的糊粉組織表達(dá)。種子萌發(fā)過程中，胚中赤霉素含量增加并轉(zhuǎn)移到糊粉層，誘導(dǎo)相關(guān)蛋白酶基因的表達(dá)。赤霉素能夠誘導(dǎo)EPB基因的表達(dá)，EPB-1啟動子中含有赤霉素順式作用GARE元件RTAACARANTCYGG，嘧啶盒（YCTTTTY）和Box I（TATCCAT）是GA誘導(dǎo)所必需的［71］。

3.2 βVPE介導(dǎo)種子儲存蛋白的成熟和δVPE參與種皮發(fā)育過程

βVPE和δVPE屬于種子型VPE，βVPE在種子發(fā)育晚期儲存蛋白形成時期表達(dá)，介導(dǎo)種子儲存蛋白的成熟過程，而且是儲存蛋白加工成熟過程所必需的，在βvpe突變體種子中，90%VPE活性喪失［48］。當(dāng)βVPE缺失后，αVPE、γVPE和天冬氨酸蛋白酶起到部分彌補(bǔ)βVPE的作用［72］。在種子中，種皮緊緊包裹胚和胚乳，在休眠階段保護(hù)胚免受機(jī)械損傷、病蟲害侵襲及紫外線破壞，種皮還能為胚胎發(fā)育轉(zhuǎn)移母體營養(yǎng)的橋梁作用。在種子發(fā)育早期，種皮ii2和ii3兩層細(xì)胞會經(jīng)歷PCD過程。而δVPE僅在種子發(fā)育早期的種皮ii2和ii3兩層細(xì)胞中表達(dá)，參與種皮發(fā)育過程中特定細(xì)胞層的細(xì)胞死亡過程。免疫電鏡結(jié)果顯示，δVPE定位于PCD過程中的ii2和ii3細(xì)胞內(nèi)外細(xì)胞壁上。當(dāng)δVPE缺失突變，這兩層細(xì)胞的PCD延遲［73］。

3.3 HvPap-1參與種子萌發(fā)過程中蛋白質(zhì)動員

對半胱氨酸蛋白酶41個成員在大麥種子萌發(fā)過程中的表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)［18］，HvPap-4，Hv-Pap-6和HvPap-10在發(fā)芽的種子中高水平表達(dá)而且具有種子特異性表達(dá)模式［63］。HvPap-1由GA誘導(dǎo)，定位于胚中的蛋白體和囊泡，負(fù)責(zé)胚乳中的蛋白質(zhì)降解，參與大麥種子萌發(fā)過程中蛋白質(zhì)動員作用［61］。過量表達(dá)HvPap-1減少了種子中的淀粉量并提高了發(fā)芽率，而抑制HvPap-1表達(dá)則增加種子中的淀粉量且降低發(fā)芽率［62］。大麥中HvPap-1，HvPap-6和HvPap-19 定位于胚中，但HvPap-1，HvPap-6和HvPap-19 蛋白酶積累存在差異，可能不同的C1A半胱氨酸蛋白酶具有特異降解存儲蛋白的能力。

總之，半胱氨酸蛋白酶參與降解或動員種子中存儲蛋白，在種子發(fā)芽和幼苗生長中起重要作用，半胱氨酸蛋白酶的表達(dá)和活性受GA，ABA和胱抑素等的調(diào)節(jié)。

4 根的發(fā)育過程

研究表明，擬南芥中3種含KDEL基序的半胱氨酸蛋白酶［74-77］，即AtCEP1、AtCEP2和AtCEP3，以及毛果楊半胱氨酸蛋白酶基因PtCP5［78］在根的發(fā)育過程中起作用。

4.1 AtCEP2參與初生根的生長過程

AtCEP2參與了初生根的生長并影響根的發(fā)育過程［77］。AtCEP1和AtCEP2均在根的表皮層根尖細(xì)胞和側(cè)根尖的頂端（PCD位點(diǎn)）以及在側(cè)根生長期表達(dá)［74-75］。AtCEP2定位于根冠表皮細(xì)胞壁，無活性的AtCEP2酶原被運(yùn)輸或擴(kuò)散到細(xì)胞壁，在pH值低于6.5時通過自催化轉(zhuǎn)化為成熟酶［74，79］。從即將發(fā)生PCD的根冠細(xì)胞釋放出的有活性AtCEP2可能擴(kuò)散到鄰近的質(zhì)外體和細(xì)胞壁，參與蛋白質(zhì)降解，進(jìn)而影響表皮細(xì)胞伸長。AtCEP2的缺失，導(dǎo)致LR原基延遲出現(xiàn)。說明AtCEP2是根細(xì)胞生長所必需的，這可能影響了細(xì)胞壁的重塑能力［77］。

4.2 PtCP5參與主根生長過程

研究發(fā)現(xiàn)，毛果楊半胱氨酸蛋白酶PtCP5影響根的發(fā)育過程，如張強(qiáng)［78］克隆獲得了毛果楊半胱氨酸蛋白酶基因PtCP5，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PtCP5屬于木瓜類半胱氨酸蛋白酶家族中B類組織蛋白酶。利用實(shí)時定量PCR技術(shù)對PtCP5進(jìn)行了組織表達(dá)定位分析，PtCP5主要在根部和葉部表達(dá)。構(gòu)建了半胱氨酸蛋白酶基因PtCP5的正義植物表達(dá)載體，并通過花序侵染法對野生型擬南芥進(jìn)行侵染，成功獲得PtCP5正義轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。通過對PtCP5正義轉(zhuǎn)基因的擬南芥進(jìn)行了主根長度分析，結(jié)果顯示，與野生型相比，PtCP5正義轉(zhuǎn)基因擬南芥主根長度明顯長于野生型。說明PtCP5參與主根生長影響根的發(fā)育過程。

目前檢測到AtCEP1、AtCEP2和AtCEP3以及 PtCP5等半胱氨酸蛋白酶在根中表達(dá)量較高，且對根的生長發(fā)育有一定的影響，但是這些酶如何調(diào)節(jié)根的發(fā)育機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

5 花藥絨氈層PCD過程

花藥是花粉的發(fā)育場所，為花粉的發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)。絨氈層是花藥囊最內(nèi)層細(xì)胞，在花藥發(fā)育后期會經(jīng)歷PCD，絨氈層細(xì)胞降解不正常會導(dǎo)致花粉敗育。半胱氨酸蛋白酶在絨氈層的PCD過程中起著重要作用［80-81］。在多種植物中發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶類半胱氨酸蛋白酶參與了絨氈層的PCD過程。例如，煙草中的NtCP56［80］；擬南芥半胱氨酸蛋白酶51（CP51）和AtCP56［82］、CEP1［83］、βVPE［84］；甘 藍(lán)型油菜BnaC.CP20.1［85］；水稻OsCP1［86］，這些蛋白酶基因的異常表達(dá)影響了絨氈層PCD進(jìn)程，導(dǎo)致了不同程度的花粉敗育。

5.1 CEP1參與絨氈層PCD過程

半胱氨酸蛋白酶CEP1在擬南芥絨氈層細(xì)胞的程序化死亡和花粉發(fā)育的過程中起重要作用［83］。CEP1的表達(dá)量與花粉的可育程度相關(guān)，CEP1的表達(dá)量過高或者過低，都會造成花粉不同程度的敗育。根據(jù)形態(tài)變化可將擬南芥花藥的發(fā)育分為14個時期，絨氈層在第5時期開始形成，同時小孢子母細(xì)胞分化，隨后通過減數(shù)分裂形成四分體；到第9-10時期絨氈層細(xì)胞開始降解，單倍體小孢子從四分體中釋放，然后進(jìn)行不對稱的有絲分裂形成雙核小孢子；到第11-12時期絨氈層細(xì)胞急劇降解完成，此時雙核小孢子中的生殖細(xì)胞核經(jīng)歷一次有絲分裂形成三核花粉［87］。CEP1通過參與絨氈層降解，從而影響花粉發(fā)育。免疫組化顯示擬南芥半胱氨酸蛋白酶CEP1基因特異地的在花藥發(fā)育的第5-11時期的絨氈層中表達(dá)。免疫電鏡和western共同證實(shí)，CEP1花粉發(fā)育早期第5階段，無活性的CEP1酶原儲存于液泡中，在絨氈層細(xì)胞的PCD起始之前第6-8時期，在酸性的環(huán)境下，CEP1前體酶自催化去除信號肽和前肽，部分酶原轉(zhuǎn)化成有活性的成熟酶。在絨氈層細(xì)胞PCD過程中第9-11時期CEP1成熟酶從破裂的液泡中釋放，參與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)的降解。在cep1突變體中，絨氈層細(xì)胞壁的降解，絨氈層分泌結(jié)構(gòu)的形成和細(xì)胞核的降解被抑制，不能給花粉發(fā)育提供足夠的營養(yǎng)和組分，導(dǎo)致花粉外壁發(fā)育不正常，大部分花粉敗育。研究發(fā)現(xiàn)，CEP1酶原一方面可自催化轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒煨问剑?3］；另一方面，CEP1酶原成熟還需要βVPE的參與［84］。

5.2 βVPE激活其他蛋白酶共同參與絨氈層PCD 過程

Cheng等［84］利用Proβvpe：GUS檢測βVPE的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)βVPE在擬南芥花藥發(fā)育的5-8時期高水平的表達(dá)，且在絨氈層中特異性表達(dá)。體外激活實(shí)驗(yàn)顯示51 kD的βVPE酶原在pH5.2條件下可自催化轉(zhuǎn)化為27 kD成熟形式，免疫雜交顯示在花藥發(fā)育的βVPE在5-6時期以原酶和少量成熟酶的形式存在，在7-8時期完全轉(zhuǎn)化為成熟酶形式。說明花藥發(fā)育過程中βVPE在酸性條件下自催化形成有活性的成熟蛋白。在花發(fā)育過程中，βVPE酶原激活時間早于CEP1，同時βvpe與cep1突變體的花藥表型類似，表現(xiàn)出液泡裂解的延遲和花粉育性的降低。免疫雜交實(shí)驗(yàn)證明，在βvpe突變體中花藥發(fā)育過程中，CEP1和RD19A的成熟受到嚴(yán)重抑制，RD19C完全不能被催化成成熟酶不能完全轉(zhuǎn)化為成熟酶［84］。說明βVPE作為一個早期被激活的半胱氨酸蛋白酶，處于蛋白酶激活網(wǎng)絡(luò)的上游，催化絨氈層發(fā)育過程中CEP1和其他半胱氨酸蛋白酶的成熟，從而參與絨氈層降解并且影響花粉發(fā)育［84］。

總之，花藥絨氈層PCD對于花粉發(fā)育至關(guān)重要，目前一些與花藥絨氈層PCD發(fā)育相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶被報道，這些半胱氨酸蛋白酶在此過程中發(fā)揮直接或者間接作用，但是這些半胱氨酸蛋白酶在PCD過程中如何被激活；不同蛋白酶之間否存在上下游激活關(guān)系；它們之間的酶學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)需要進(jìn)行深入研究。

6 總結(jié)與展望

半胱氨酸蛋白酶在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，不僅參與種子萌發(fā)，根生長及葉片衰老過程，還參與莖中導(dǎo)管分子及花藥中絨氈層細(xì)胞的細(xì)胞程序性死亡過程。半胱氨酸蛋白酶在這些組織中發(fā)揮蛋白質(zhì)的降解作用，為新細(xì)胞的生長提供營養(yǎng)和組分，保證植物生長發(fā)育順利進(jìn)行。有些半胱氨酸蛋白酶如δVPE在特定組織表達(dá)，影響特定組織的蛋白質(zhì)降解及生長發(fā)育過程。但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，某些半胱氨酸在多個組織中表達(dá)，影響多個組織的發(fā)育進(jìn)程，而且半胱氨酸蛋白酶在不同組織功能不一樣，如SAG12除了參與葉片衰老，還與根發(fā)育相關(guān)［88］。βVPE除了參與種子中儲存蛋白的合成［48］，還與花藥發(fā)育中絨氈層的細(xì)胞PCD有關(guān)［84］。CEP1不僅參與花藥絨氈層PCD過程，也參與莖中導(dǎo)管分子和纖維細(xì)胞的PCD過程，其他半胱氨酸蛋白酶是否在不同的植物組織中參與不同的功能，或者同一蛋白酶在不同組織中是否發(fā)揮著類似功能，還需要進(jìn)一步深入研究。

絕大多數(shù)的半胱氨酸蛋白酶以酶原形式存在，并且在特定的時間和地點(diǎn)被激活而發(fā)揮作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，不同的半胱氨酸蛋白酶激活條件不同，pH值是蛋白酶激活的重要條件，有些蛋白能夠在特定pH值條件下發(fā)生自激活，而有些蛋白酶的激活需要其他蛋白酶的參與，半胱氨酸蛋白酶在植物發(fā)育過程中如何被激活以及蛋白酶與蛋白酶之間的激活調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也值得進(jìn)一步研究。