康凌云 陳建勝 甘瀚凌 韓露露 馮海霞 刁其玉 邢凱 崔凱

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點實驗室，北京 100081；2. 北京農(nóng)學院，北京 102206；3. 山東省德州市陵城區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，德州 253500）

自由基穩(wěn)衡理論指出，動物機體內(nèi)的自由基處于不斷產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡中，當ROS的產(chǎn)生及其作用超過抗氧化系統(tǒng)對ROS的清除能力時，就會破壞機體氧化還原穩(wěn)態(tài)，引起氧化應激［1］。畜牧生產(chǎn)中，氧化應激導致幼畜成活率下降和腹瀉等動物性疾病，并對畜禽生 產(chǎn)水平和畜產(chǎn)品品質(zhì)造成嚴重影響［2］。日糧中營養(yǎng)物質(zhì)是動物體內(nèi)自由基產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是動物體內(nèi)清除自由基的物質(zhì)來源［3］。日糧變化能夠影響胚胎及出生后幼畜的抗氧化酶活性和代謝調(diào)節(jié)能力。在肉羊生產(chǎn)過程中，飼料成本在養(yǎng)殖成本中占有較高比例，加之我國蛋白飼料資源缺乏，導致在早期發(fā)育過程中存在蛋白供應不足現(xiàn)象，對羔羊的健康生長產(chǎn)生重要影響。因此，探明蛋白質(zhì)水平與機體抗氧化應激的作用機制具有重要意義。氧化應激編程假說（oxidative stress programming hypothesis）指出，氧化應激是影響胎兒早期生長發(fā)育以及后代患代謝疾病的第一因素［1］。He等［4］研究發(fā)現(xiàn)妊娠后期母羊飼糧蛋白質(zhì)水平限制降低了后代羔羊的抗氧化能力，經(jīng)過產(chǎn)后營養(yǎng)水平的恢復，多數(shù)的抗氧化指標及基因表達水平可恢復到正常水平。張帆等［5］研究發(fā)現(xiàn)妊娠后期母羊低營養(yǎng)水平（低精料補充料比例）能夠降低羔羊初生重，但經(jīng)補償生長作用，生長性能也得到恢復，羔羊血清抗氧化能力得到提高。高蛋白日糧能使小鼠胰腺產(chǎn)生ROS，其生成水平隨蛋白質(zhì)的消化吸收而變化，而且氧化負荷導致胰腺抗氧化防御系統(tǒng)能力下降［6］。李東東等［7］研究發(fā)現(xiàn)高蛋白水平的飼糧有助于提高肉雞的抗氧化功能和生產(chǎn)性能。

RNA-seq技術(shù)能夠從整體轉(zhuǎn)錄水平系統(tǒng)研究基因轉(zhuǎn)錄圖譜并揭示復雜生物學通路和性狀調(diào)控網(wǎng)絡機制，并在畜牧學研究中得到廣泛應用［8-10］。前人研究證實，妊娠期母體日糧水平能夠改變胚胎及幼畜抗氧化能力，并對幼畜的代謝和免疫功能產(chǎn)生長期效應。然而，關(guān)于斷母乳幼畜飼糧營養(yǎng)水平對其抗氧化機能研究較少。本試驗選用雙胞胎湖羊羔羊作為研究對象，基于RNA-seq技術(shù)測定肝臟基因表達變化情況，探討蛋白質(zhì)限制與補償對羔羊物質(zhì)代謝及抗氧化功能的影響，為羔羊早期健康培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗在江蘇省泰州市姜堰海倫羊業(yè)有限公司湖羊養(yǎng)殖基地進行，歷時90 d；試驗羊只為湖羊，RNA提取試劑購自ThermoFisher公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗處理 本試驗選取15日齡、體重相近（6.08±0.56 kg）且發(fā)育正常的湖羊公羔32只，分為兩組。對照組飼喂正常蛋白水平的代乳粉（CP為25%）和開食料（CP為21%），記為試驗組NPL（normal protein level，NPL）；另一組飼喂蛋白水平分別為19%的代乳粉和15%的開食料，記為試驗組LPL（low protein level，LPL），每個處理16只羔羊。試驗羊15日齡斷母乳，人工飼喂相應的代乳粉至60日齡，開食料自由采食。61-90 d所有試驗羊均自由采食蛋白水平為21%的開食料。分別在羔羊60日齡和90日齡進行屠宰，采集羔羊肝臟組織用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組學測定分析。

1.2.2 試驗日糧 正常水平代乳粉和開食料的配制參照發(fā)明專利ZL201210365927.6［11］和肉羊飼養(yǎng)標準（中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2004）［12］，低蛋白水平參照岳喜新［8］的試驗結(jié)果進行配制。兩組開食料成分及代乳粉和開食料營養(yǎng)水平見表1。

表1 NPL組和LPL組開食料的成分及代乳粉和開食料營養(yǎng)水平（風干基礎(chǔ)）Table 1 Ingredients and nutrient composition of the milk replacer and starter（dry matter basis）

1.2.3 飼養(yǎng)管理 試驗正式開始之前對整個圈舍進行全面的消毒，按照羊場的正規(guī)程序?qū)υ囼炑蛑贿M行免疫。試驗用羔羊單欄飼喂，每只羊活動空間約為2 m2，每半個月對所有欄位進行消毒1次。15-60日齡試驗羊代乳粉每天的飼喂總量按體重的2.0%進行，飼喂量根據(jù)試驗過程中羔羊的健康狀況進行適當?shù)恼{(diào)整，以保證羔羊的正常生長。30日齡前每天飼 喂3次（07：00、13：00和19：00），31-60日齡每天飼喂兩次（08：00和18：00）。

1.2.4 樣品采集與分析測定

1.2.4.1 肝臟樣品采集 羔羊在60和90日齡時，每組分別隨機選取2只羔羊于清晨8：00進行屠宰。宰前16 h禁水禁食。肝臟組織用生理鹽水沖洗干凈后放到液氮預冷的1.5 mL凍存管中，并迅速置于液氮中速凍，存放到-80℃冰箱中備用。

1.2.4.2 RNA提取及質(zhì)量檢測 分別取60和90日齡2對雙胞胎羔羊肝臟組織約50 mg，利用TRIzol法提取總RNA，用DNA酶（DNase-I）進行處理。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用核酸測定儀測定RNA濃度。文庫構(gòu)建及測序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.2.4.3 原始數(shù)據(jù)分析 測序得到原始圖像文件經(jīng) CASAVA 1.8 軟件進行堿基識別（base calling）和 Bcl2Fastq 分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列（rawdata），結(jié)果以FASTQ文件格式存儲。對Raw data進行過濾，去除接頭和低質(zhì)量的reads，得到高質(zhì)量的 clean reads。使用TopHat v2.0.9完成clean reads和綿羊參考基因組Oarv3.1的比對［13］。

1.2.4.4 差異表達基因鑒定 應用Cufflinks對比對結(jié)果進行基因定量，通過每個基因的FPKM（fragments per kilobase of exon model per million mapped reads）估算基因表達水平［14］。應用DESeq將歸一化得到的FPKM值進行差異基因分析［15］。采用Fold-change（FC，表達差異倍數(shù)）以及P統(tǒng)計學方法對差異基因差異程度進行篩選，滿足|log2FC|>1且Padj<0.05定義為差異表達基因（different expressed genes，DEGs）［16］。

1.2.4.5 差異基因功能分析 利用DAVID（the database for annotation，visualization and integrated discovery）在線分析軟件（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）對差異表達基因進行GO（gene ontology）功能聚類分析［17］和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路分析［18］。

1.2.4.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析 選擇與抗氧化相關(guān)的4個差異表達基因進行qRT-PCR驗證。將轉(zhuǎn)錄組測序用到的RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FastQuant RT Kit購于天根生化科技有限公司）合成cDNA第一鏈，以其為模板，利用SuperReal PreMix Plus Kit（購于天根生化科技有限公司）在Bio-Rad CFX96實時熒光定量儀上進行qRT-PCR。以GAPDH作為內(nèi)參基因，每個基因的定量分析設(shè)置3次生物學重復，3次技術(shù)重復，采用相對定量2-△△Ct法分析。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取與質(zhì)量檢測

瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示，28S rRNA與18S rRNA電泳條帶清晰，OD260/OD280值在1.9-2.1之間，各樣品的RIN值均大于6.8，滿足RNA-seq分析要求。

圖1 肝臟總RNA凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoregram of total RNA in the liver

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控

測序結(jié)果表明，所有樣品Raw reads數(shù)目在41 189 720至60 109 450之間，去除接頭和低質(zhì)量的reads，Clean reads 數(shù)目在40 057 846至58 311 854之間，占raw reads的比例為95.54%-97.50%，所有樣品的錯誤率均為0.02%。參考序列比對結(jié)果見表2。標準試驗條件下，映射到基因組的序列（total mapped reads or fragments）比例≥70%，其中具有多個定位的測序序列（multiple mapped reads or fragments）占總體的百分比≤10%。本試驗條件下，所有樣品Clean reads占參考基因組均值為78.01%±0.76%，Multiple-mapped reads值小于3.18%，均符合試驗要求。測序原始已上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫（編號：SRX2160967）。

表2 所有樣品的測序數(shù)據(jù)評估表Table 2 Data information of all samples collected by RNA-seq

2.3 差異表達基因鑒定

RNA-seq結(jié)果表明，羔羊60日齡時，低蛋白水平組和正常蛋白水平組（LPL60 vs NPL60）差異表達基因有302個，表達上調(diào)基因167個，表達下調(diào)基因135個；61-90日齡，LPL組羔羊采食正常蛋白水平日糧30 d，LPL90組和NPL90組差異表達基因12個，表達上調(diào)基因8個，表達下調(diào)基因4個。本次試驗共鑒定得到23個差異表達基因參與機體抗氧化調(diào)節(jié)過程（圖2，表3）。

表3 參與抗氧化過程的差異表達基因Table 3 Different expressed genes related to antioxidation process

圖2 差異表達基因聚類熱圖Fig.2 Heat map analysis of different expressed genes

2.4 差異表達基因GO分析

GO（gene ontology）是一個標準化的基因功能分類體系，包括基因參與的生物學過程（biological process，BP），細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3個部分。通過GO功能顯著性分析發(fā)現(xiàn)，60日齡差異表達基因顯著富集的主要條目如圖3所示。差異表達基因顯著富集的生物學過程包括血管發(fā)育（GO：0001568），血管形態(tài)形成（GO：0048514），脈管系統(tǒng)發(fā)育（GO：0001944），血管生成（GO：0001525），血管生長因子信號途徑（GO：0038084），細胞組分遷移調(diào)節(jié)（GO：0051270）和細胞遷移（GO：0016477）；差異表達基因顯著富集的分子功能條目包括血管內(nèi)皮生長因子激活受體活性（GO：0005021），生長因子結(jié)合（GO：0019838），谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性（GO：0004364）和跨膜受體蛋白激酶活性（GO：0019199）。其中，與機體抗氧化相關(guān)條目氧化還原酶活性（GO：0016491），谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性（GO：0004364）和氧化還原過程（GO：0055114）顯著下調(diào)（表4）。LPL組羔羊采食正常蛋白水平日糧30 d后，沒有顯著富集的GO條目。

表4 抗氧化相關(guān)基因及GO條目Table 4 GO terms and genes related to antioxidation process

圖3 差異表達基因GO分析Fig.3 GO analysis of different expressed genes

2.5 KEGG代謝通路富集分析

對差異表達基因進行KEGG pathway 代謝通路顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)，60日齡時，差異表達基因參與的生物學途徑主要包括化學致癌途徑，P450介導的外源性物質(zhì)代謝途徑，谷胱甘肽代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑，類固醇生物合成途徑和細胞因子受體相互作用途徑等。LPL組羔羊采食正常蛋白水平日糧30 d后，酪氨酸代謝途徑呈現(xiàn)顯著下調(diào)（表5）。

2.6 熒光定量PCR驗證RNA-Seq結(jié)果

為了進一步驗證RNA-Seq結(jié)果的準確性，選取與抗氧化功能密切相關(guān)的4個不同的基因進行了qRT-PCR定量分析。對qRT-PCR與RNA-Seq結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)兩者的表達趨勢一致，說明RNASeq結(jié)果良好（圖4）。

圖4 RNA-Seq與qRT-PCR結(jié)果比較Fig.4 Comparison of results between RNA-Seq and qRT-PCR

3 討論

選用雙胞胎羔羊作為動物模型，能夠最大程度的減少遺傳背景造成的影響，更清晰的表明試驗因素的作用。本研究選用雙胞胎羔羊作為試驗動物，通過RNA-seq技術(shù)共篩選得到差異表達基因302個；LPL組羔羊采食正常蛋白水平日糧30 d，LPL90組和NPL90組差異表達基因12個。

氧化應激是機體自由基生成增加或清除能力降低導致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，自由基在體內(nèi)積累而引起的氧化損傷過程［19］。前人研究證實，氧化應激能夠降低動物生長性能［20］，肌肉感官品質(zhì)和嫩度降低［2］，引發(fā)人和動物心血管疾病［21-22］。真核生物在代謝過程中，98%的氧通過細胞色素氧化酶系統(tǒng)還原成水并釋放能量，極少量的氧還原成超氧根陰離子（O2ˉ）、羥自由基（OH）和過氧化氫（H2O2）等活性氧［23］。生理狀態(tài)下，細胞內(nèi)的抗氧化物質(zhì)可以及時清除活性氧，使活性氧的清除和生成處于動態(tài)平衡過程中。細胞內(nèi)的抗氧化物質(zhì)包括還原型谷胱甘肽（glutathione）、還原型輔酶II（NADPH）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）［24］。本次試驗共鑒定得到23個差異表達基因參與機體抗氧化調(diào)節(jié)過程。動物血清中的SOD具有清除自由基的能力，是體內(nèi)重要的抗氧化酶［25］，抗氧化系統(tǒng)受損則導致血液中SOD的活性降低［26］。RNA-seq結(jié)果表明，低蛋白水平羔羊肝臟組織SOD1基因的表達水平下調(diào)2.69倍，表明低蛋白日糧引起羔羊抗氧化功能下調(diào)。GO分析表明，低蛋白水平組羔羊參與氧化還原酶活性的基因呈現(xiàn)顯著下調(diào)，破壞氧化還原反應過程。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶是催化谷胱甘肽結(jié)合反應的關(guān)鍵酶，催化具有親電取代基的外源性化合物與內(nèi)源的還原型谷胱甘肽反應，減少對機體造成的損害［27］。谷胱甘肽能夠抑制自由基生成，降低氧化應激，緩解免疫抑制。GO和KEGG分析表明，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性降低，谷胱甘肽代謝途徑減弱，谷氨酸鹽合成谷胱甘肽減少，降低了機體的抗氧化作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，低蛋白日糧引起羔羊細胞因子受體作用通路相關(guān)基因表達水平顯著提高。細胞因子（cytokine）是細胞經(jīng)刺激誘導產(chǎn)生的小分子可溶性蛋白，分為白細胞介素（IL）、干擾素（IFN）、腫瘤壞死因子家族（TNF）、集落刺激因子（CSF）和趨化因子（CF）等，對調(diào)節(jié)機體獲得性免疫、血細胞生成和損傷組織修復等起到重要作用［28］。動物免疫反應包括Th1細胞分泌IFN、IL2、IL12和TNF參與的細胞免疫以及Th2細胞分泌的IL4、IL5、IL6等參加的體液免疫［29］。機體的抗氧化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)密不可分。免疫細胞對氧化應激非常敏感，因為免疫細胞細胞膜含有高濃度、對過氧化反應高度敏感的不飽和脂肪酸，因此免疫細胞受過量自由基刺激后免疫功能下降，進而影響免疫系統(tǒng)功能［30］。

4 結(jié)論

本研究采用RNA-seq技術(shù)鑒定得到蛋白質(zhì)限制和補償水平羔羊肝臟組織差異表達基因，通過GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)差異表達基因中抗氧化相關(guān)基因及其作用通路。日糧蛋白質(zhì)限制引起差異表達基因中參與抗氧化相關(guān)的基因表達顯著下調(diào)，降低了羔羊抗氧化能力，恢復日糧蛋白水平30 d，抗氧化基因表達隨之恢復。