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        糖酵解調(diào)控雞體外PGCLC形成的功能研究

        2021-08-11 02:45:58張晨左其生鄒藝琛趙娟娟張亞妮李碧春
        生物技術(shù)通報(bào) 2021年6期
        關(guān)鍵詞:途徑研究

        張晨 左其生 鄒藝琛 趙娟娟 張亞妮 李碧春

        (揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,揚(yáng)州 225009)

        原始生殖細(xì)胞(primordial germ cell,PGC)的形成需要多種因素的參與,從遺傳的角度來(lái)說(shuō),基因表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)、表觀遺傳修飾等都對(duì)PGC的形成具有調(diào)控作用。不僅如此,Brinster等[1]提出PGC (小鼠)具有特別的能量代謝方式——偏愛丙酮酸氧化而不能氧化葡萄糖。因此代謝變化也可能參與PGC的形成。

        相比遺傳和表觀遺傳因素的調(diào)控,代謝方式的變化對(duì)表型變化的影響更為直接和明顯。研究發(fā)現(xiàn)能量代謝方式在不同細(xì)胞中并不相同,大多的癌細(xì)胞中[2]能量代謝方式主要以糖酵解途徑為主,氧化磷酸化途徑不參與癌癥發(fā)生過程;而正常細(xì)胞通常以線粒體氧化磷酸化產(chǎn)能,而不依賴糖酵解途徑[3]。在PGC細(xì)胞中也同樣表現(xiàn)為氧化磷酸化為主的能量代謝模式[4];在精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cell,SSC)中,為了維持其自我更新能力,細(xì)胞通常利用糖酵解途徑進(jìn)行產(chǎn)能[5]。這種現(xiàn)象提示我們能量代謝模式的改變可能影響細(xì)胞的命運(yùn)決定。重編程過程印證了這一猜想,體細(xì)胞的氧化磷酸化代謝轉(zhuǎn)變?yōu)閕PS的糖酵解依賴代謝模式是多能性獲得的基礎(chǔ)[6]。因此代謝組的重組可能是引起細(xì)胞分化的原因。然而代謝途徑的變化在PGC形成中的調(diào)控研究尚不明確。

        甲萘醌VK3可通過單電子還原反應(yīng),產(chǎn)生半醌基團(tuán);或通過雙電子還原得到氫醌。通過醌的氧化還原循環(huán)可產(chǎn)生活性氧簇等,增加氧化還原反應(yīng)[7]。研究表明,VK3可作為丙酮酸激酶PKM2的專一性抑制劑,而不抑制PKL和PKM1,有效抑制糖酵解途徑[8]。然而對(duì)VK3功能的研究主要集中在對(duì)癌癥的抑制效果上[9-10],在細(xì)胞分化中的調(diào)控作用還未有研究。相反,研究表明[11-12]DASA58可靶向激活PKM2,PKM2是參與糖酵解過程的糖酵解酶,可催化合成丙酮酸和ATP,因此DASA58被認(rèn)為是糖酵解途徑的激活劑,在癌癥發(fā)生和免疫過程的研究中較為常見,其在細(xì)胞分化中的功能還不得而知。

        為了研究PGC形成機(jī)制,本研究前期建立了BMP4體外誘導(dǎo)模型[13],BMP4能夠通過BMP4信號(hào)促進(jìn)體外雞胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESC)向原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞(primordial germ cell,PGCLC)的分化,而BMP4信號(hào)抑制糖酵解途徑關(guān)鍵激活劑 GSK的功能[14],因此推測(cè)糖酵解可能參與PGC的形成。本研究對(duì)體外誘導(dǎo)過程中糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè);在添加糖酵解激活劑和抑制劑后,qRT-PCR檢測(cè)了相關(guān)基因的表達(dá)及類胚體/PGC-like的形成,以期為深入研究代謝系統(tǒng)在PGC形成中的調(diào)控機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        細(xì)胞及主要試劑 新鮮受精蛋來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所試驗(yàn)禽場(chǎng)如皋黃雞。ESCs由實(shí)驗(yàn)室分離所得。高糖DMEM、Knockout培養(yǎng)基、胎牛血清、雞血清、丙酮酸鈉購(gòu)自Gibco公司(美國(guó));β-巰基乙醇、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、bFGF、hSCF購(gòu)自Sigma(美國(guó));mLIF 購(gòu)自millipore(德國(guó));BMP4購(gòu)自ProSpec(以色列)、VK3購(gòu)自Macklin(中國(guó))、DASA58購(gòu)自MCE(美國(guó))。

        青鏈霉素購(gòu)自(北京)索萊寶科技有限公司;TRNzol Universal 總 RNA 提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;DDX4購(gòu)自Abcam。

        ESC因子培養(yǎng)基:Knockout DMEM+10%胎牛血清+0.1 mmol/L β-巰基乙醇+1 mmol/L丙酮酸鈉+2 mmol/L的L-谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+1 000 IU/mL LIF+10 ng/mL bFGF+5 ng/mL SCF+1×青鏈霉素+2%雞血清。

        BMP4誘導(dǎo)培養(yǎng)基:高糖DMEM+1×非必需氨基酸+0.1 mmol/L β-巰基乙醇+1×青鏈霉素+1 mmol/L丙酮酸鈉+ 10 ng/mL LIF+40 ng/mL BMP4+50 ng/mL EGF。

        1.2 方法

        1.2.1 ESC細(xì)胞誘導(dǎo) 收集0 d的種蛋,藥匙法獲得雞胚胚盤,ESC因子培養(yǎng)基吹散成細(xì)胞懸液,經(jīng)400目濾布過濾后收集細(xì)胞,接種至60 mm培養(yǎng)皿,差速培養(yǎng)12 h,收集上清,接種至24孔板,體外擴(kuò)增、傳代、備用[15-16]。將傳至第2代的ESCs以2×105個(gè)/孔接種于24孔板中,更換培養(yǎng)基為BMP4誘導(dǎo)培養(yǎng)基,接種至24孔板中,培養(yǎng)6 d,每隔2 d添加200 μL培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分組為:BMP4組,BMP4+VK3組,BMP4+DASA58組。

        1.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 在細(xì)胞誘導(dǎo)的第6天觀察細(xì)胞形態(tài),分別記錄20×10和40×10倍鏡下的細(xì)胞形態(tài)變化并進(jìn)行拍照。利用Image J對(duì)20×10倍鏡下的類胚體數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

        1.2.3 RNA提取 將收集的細(xì)胞置于1.5 mL無(wú)酶管中,加入1 mL Trizol進(jìn)行裂解,用移液器吹勻細(xì)胞,在室溫靜置5 min。加入200 mL氯仿,蓋緊蓋子后,劇烈振蕩15 s,室溫靜置2 min。冷凍離心機(jī)中4℃ 12 000×g離心15 min。小心打開管蓋,緩慢吸取400 μL上清,加入等體積異丙醇,輕輕混勻,在室溫靜置10 min。冷凍離心機(jī)中4℃ 12 000×g離心10 min,棄去上清。加入1 mL 75%的乙醇,輕輕混勻,此時(shí)可見白色RNA沉淀。冷凍離心機(jī)中4℃ 7 500×g離心5 min,棄去上清。晾干RNA,加入20 μL無(wú)酶水溶解。置于60℃促溶10 min,獲 得RNA。

        1.2.4 qRT-PCR 分別收集誘導(dǎo)2 d、4 d和6 d的細(xì)胞,Trizol裂解后提取RNA。利用天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,參照天根實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑說(shuō)明書進(jìn)行定量檢測(cè)目的基因的表達(dá)。引物序列參照表1。

        表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

        1.2.5 流式細(xì)胞分析 收集誘導(dǎo)至6 d細(xì)胞,PBS清洗后,加入10%FBS的PBS 37℃封閉2 h,PBS清洗3次后,用一抗進(jìn)行孵育,37℃孵育2 h或4℃過夜。PBS清洗3次后,用對(duì)應(yīng)的二抗進(jìn)行孵育,37℃孵育2 h。PBS清洗3次后,上機(jī)檢測(cè)。

        1.2.6 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)并處理數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)組間差異用單因素方差分析,采用LSD法進(jìn)行多重比較,試驗(yàn)數(shù)據(jù)以P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。結(jié)果以平均值形式表示。

        2 結(jié)果

        2.1 雞PGC-like細(xì)胞形成中糖酵解相關(guān)基因低 表達(dá)

        在體外雞ESC誘導(dǎo)形成PGC-like的不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)糖酵解過程相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),qRTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,誘導(dǎo)第6天時(shí),糖酵解相關(guān)基因Pgk1的表達(dá)顯著降低(P<0.05),Hk1、Pkm2、Ldha、Glut1、Pfkp和Aldoc的表達(dá)極顯著降低(P<0.01)(圖1)。以上結(jié)果說(shuō)明在PGC-like形成過程中糖酵解過程被抑制。

        圖1 PGC-like形成中糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)Fig. 1 Expression of glycolysis-related genes in the formation of PGC-like

        2.2 糖酵解激活劑/抑制劑調(diào)控糖酵解過程

        為研究糖酵解過程在PGC-like形成中發(fā)揮的作用,本研究將糖酵解抑制劑VK3和糖酵解激活劑DASA58加入PGC-like誘導(dǎo)體系中,分別在不同誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示在誘導(dǎo)第2天時(shí),添加VK3后,糖酵解相關(guān)基因Hk1、Pkm2、Glut1、Pfkp、Aldoc表達(dá)極顯著降低(P<0.01),而添加DASA58后,Ldha和Pfkp表達(dá)顯著升高(P<0.05),Hk1和Pgk1表達(dá)極顯著升高(P<0.01)。而在誘導(dǎo)第4天時(shí),添加VK3后,Hk1、Pkm2、Ldha、Glut1、Pfkp、Aldoc和Pgk1表達(dá)極顯著降低(P<0.01)。誘導(dǎo)第6天時(shí),添加DASA58后,Glut1、Pfkp和Pgk1表達(dá)極顯著升高(P<0.01)(圖2)。以上結(jié)果說(shuō)明糖酵解抑制劑VK3和激活劑DASA58可調(diào)控糖酵解過程。

        圖2 體外誘導(dǎo)過程中糖酵解抑制劑/激活劑對(duì)糖酵解相關(guān)基因的影響Fig. 2 Effects of glycolysis inhibitors/activators on glycolysis-related genes during the induction in vitro

        2.3 糖酵解途徑抑制類胚體形成

        本研究在BMP4誘導(dǎo)體系中添加VK3和DASA58,并在第6天觀察其對(duì)類胚體形成的影響。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示BMP4誘導(dǎo)后,出現(xiàn)帶有囊腔形態(tài)的典型類胚體特征細(xì)胞,且細(xì)胞發(fā)生聚團(tuán)生長(zhǎng)的現(xiàn)象;在此基礎(chǔ)上,添加VK3后,帶有囊腔形態(tài)的類胚體數(shù)量增加并大量聚團(tuán)(P<0.01);而添加DASA58后,無(wú)典型的類胚體樣細(xì)胞形成(圖3)。以上結(jié)果說(shuō)明抑制糖酵解途徑促進(jìn)類胚體的形成。

        圖3 體外誘導(dǎo)過程中糖酵解抑制劑/激活劑對(duì)類胚體形成的影響Fig.3 Effect of glycolysis inhibitor/activator on embryoid body formation during the induction in vitro

        2.4 糖酵解途徑抑制PGC-like形成

        研究表明PGC-like形成經(jīng)歷類胚體過程,類胚體中能表達(dá)PGC標(biāo)記基因的細(xì)胞可稱為PGC-like。本研究前期已證明DDX4能夠作為標(biāo)記PGC的特異蛋白進(jìn)行流式分析。因此,在BMP4誘導(dǎo)過程中添加VK3和DASA58后第6天收集細(xì)胞,流式分析檢測(cè)PGC-like的陽(yáng)性比例,結(jié)果顯示當(dāng)添加VK3后,PGC-like的陽(yáng)性數(shù)量顯著升高(P<0.05),而添加DASA58后,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)(圖4)。以上結(jié)果說(shuō)明糖酵解途徑抑制體外PGC-like 的形成。

        圖4 體外誘導(dǎo)過程中糖酵解抑制劑/激活劑對(duì)PGC-like形成的影響Fig. 4 Effect of glycolysis inhibitor/activator on PGC-like formation during the induction in vitro

        3 討論

        糖酵解關(guān)鍵酶的表達(dá)影響糖酵解效率參與生物學(xué)過程,常見的糖酵解關(guān)鍵酶包括HK1/2、5-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、6-磷酸果糖-1/2-激酶(PFK1/2)、GLUT-1和LDH-A等,這些關(guān)鍵酶的上調(diào)往往造成較高的糖酵解率,在癌癥和重編程過程中較為常見[17-19]。糖酵解關(guān)鍵酶(如Pglym78/pgam2)功能的喪失對(duì)成肌細(xì)胞融合能力(果蠅和斑馬魚胚胎)也會(huì)有所影響。本研究發(fā)現(xiàn)與心臟發(fā)育過程中糖酵解系統(tǒng)的正面調(diào)控作用不同[20],在體外雞PGC-like形成中糖酵解基因的mRNA表達(dá)普遍下降,可能由于在干細(xì)胞中糖酵解系統(tǒng)具有不同的表達(dá)模式。結(jié)合Zhou等[21]發(fā)現(xiàn)的ES細(xì)胞的能量生產(chǎn)具有二價(jià)特征,會(huì)根據(jù)需要從糖酵解轉(zhuǎn)換為線粒體呼吸。本研究推測(cè)體外ESC向PGC-like誘導(dǎo)分化過程中,以糖酵解為主要能量代謝途徑的模式逐漸瓦解,細(xì)胞轉(zhuǎn)化為線粒體呼吸。這一推測(cè)還需要進(jìn)一步對(duì)線粒體呼吸相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

        研究報(bào)道,甲萘醌VK3通過激活氧化還原反應(yīng)抑制糖酵解過程[22-31]。本研究發(fā)現(xiàn)添加VK3后,有效抑制糖酵解相關(guān)基因的表達(dá),暗示其可能對(duì)氧化磷酸化過程起激活作用。而DASA58作為PKM2的激活劑,在本研究中未出現(xiàn)顯著激活PKM2的結(jié)果,可能是檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)過晚或是40 μmol/L的工作濃度難以滿足激活PKM2的需要。同時(shí),本研究還觀察到添加DASA58后,Glut1、Pfkp、Pgk1的表達(dá)有所上升,說(shuō)明DASA58的加入確實(shí)影響糖酵解系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài),對(duì)糖酵解途徑具有一定的激活作用。

        能量代謝確實(shí)影響細(xì)胞的命運(yùn)決定。ESC細(xì)胞往往以糖酵解途徑為主要代謝方式,因此培養(yǎng)液中高濃度的葡萄糖有利于ESC的增殖,而葡萄糖濃度的變化則會(huì)影響ESC的分化[32-34]。研究表明AMP激活的蛋白激酶(AMPK)激活劑AICAR能啟動(dòng)ATP產(chǎn)生的分解代謝途徑,抑制小鼠類胚體的形成[35]。本研究發(fā)現(xiàn)體外雞PGC-like形成中糖酵解相關(guān)基因表達(dá)降低;抑制糖酵解過程促進(jìn)類胚體形成,激活糖酵解后類胚體形成減少。類胚體是PGClike形成的必經(jīng)階段,糖酵解途徑對(duì)類胚體形成的調(diào)控暗示其對(duì)PGC-like的形成也有相似的調(diào)控模式。本研究通過流式分析也證明了這一點(diǎn)。這種能量代謝的調(diào)控模式與小鼠體內(nèi)PGC形成過程氧化磷酸化升高、糖酵解降低的模式不謀而合。說(shuō)明糖酵解過程不是體內(nèi)外PGC形成所必需的,相反,氧化磷酸化可能在體內(nèi)外PGC形成中起主導(dǎo)作用。然而PGC形成過程涉及多種調(diào)控因素,其中能量代謝的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)行深入挖掘。

        4 結(jié)論

        本研究發(fā)現(xiàn)ESC向PGC-like誘導(dǎo)過程抑制了糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)。在添加VK3后糖酵解基因表達(dá)降低,促進(jìn)類胚體/PGC-like的形成;而添加DASA58后,Glut1、Pfkp、Pgk1的表達(dá)升高,抑制類胚體/PGC-like的形成。本研究可為后續(xù)研究體內(nèi)外PGC形成中能量代謝調(diào)控模式提供參考和理論。

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