張廷煥 張利娟 陳四清 郭宗義

（1. 重慶市畜牧科學院，重慶 402460；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部養(yǎng)豬科學重點實驗室，重慶 402460）

microRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性的短片段非編碼 RNAs，調(diào)控體內(nèi)多數(shù)基因，廣泛參與生物體的生長發(fā)育，比如細胞增殖、凋亡和分化，系統(tǒng)的免疫，疾病的發(fā)生、發(fā)展等［1］。miRNAs基因首先被RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄成的初級miRNAs（primiRNAs），在細胞核內(nèi)由Drosha酶加工成60 bp且具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miRNAs（pre-miRNA），然后由細胞質(zhì)的Dicer酶進一步切割成18-25 bp的成熟miRNAs［2-3］。miRNAs主要是通過其2-8位保守的堿基序列（即種子序列）與mRNA的3′UTR區(qū)特異性位點互補配對抑制轉(zhuǎn)錄，從而引起靶基因的剪切、脫腺苷化或降解［4］。近年來，越來越多的報道表明miRNA的序列突變后，miRNAs二級結(jié)構(gòu)以及表達水平一般都會發(fā)生顯著改變［5-7］。特別是，種子序列中的任一堿基的改變，如單核苷酸多態(tài)性（SNPs），都會顯著影響該miRNA的功能［8-9］。

其中，miR-378是一個與脂肪生成［10-11］、肌肉生長［12-13］和成骨分化［14］等密切相關的表觀遺傳調(diào)控因子。大量研究證明，miR-378在脂肪、肌肉組織中高表達，且對脂肪、肌肉的生成過程起著重要的作用［11，15］。在脂肪細胞中，miR-378的生成會受到一些與脂肪分化相關因子的調(diào)控，比如TNF-a、IL-6、Leptin，來影響脂肪分化過程［16］；同時在前體脂肪細胞中過表達miR-378能夠增加C/EBP-α和C/EBP-β基因的轉(zhuǎn)錄和表達，進而促進脂質(zhì)的生成；miR-378還能靶向調(diào)控MAPK1基因，促進前體脂肪細胞的分化［11］；敲除miR-378的小鼠會出現(xiàn)體重降低，皮下白色脂肪體積減少等現(xiàn)象［10］；對于棕色脂肪而言，miR-378靶定磷酸二酯酶Pde1b來控制增加脂肪產(chǎn)熱，從而起到緩解肥胖的效果［17］。此外，在成肌細胞中miR-378能靶向抑制MyoR的表達［12］，而MyoR是生肌分化因子（MyoD）的拮抗劑［18］，相當于miR-378間接增加了MyoD的表達量，從而促進肌細胞分化；miR-378還可控制內(nèi)源性靶基因BMP2和MAPK1的表達，以此調(diào)控肌生成過程［19］；miR-378能與Igf1R結(jié)合來影響新生兒心臟的重塑以及心肌細胞的存活［20］。

豬 miR-378 是由 2 號染色體和 12 號染色體上兩個不同 miR-378 基因位點轉(zhuǎn)錄而成［21］。本實驗利用群體遺傳分析了miR-378位點在不同豬種中的選擇信號；PCR測序獲得miR-378-3p種子序列第5位的突變在各個豬種中的基因頻率；利用RNAfold軟件預測了該突變對其二級結(jié)構(gòu)的改變；在前體脂肪細胞中驗證了該突變對其促脂功能的影響；同時對該位點不同基因型與豬背膘厚、眼肌面積等屠宰性狀進行了關聯(lián)分析。旨為明確 miR-378 種子序列多態(tài)性對其生物學功能的改變，以及對豬胴體性狀的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

榮昌豬以及其雜交群體來自榮昌豬國家級保種場、小鼠的前體脂肪細胞（3T3-L1）購自北京協(xié)和細胞資源中心。DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、Q5超保真DNA聚合酶均購自NEB公司；蛋白酶K、GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒來自Promega公司；PCR 產(chǎn)物回收試劑盒Omega公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；瓊脂糖、DNA marker購自TaKaRa公司；miRNA類似物由銳博公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組測序數(shù)據(jù) 提取6頭榮昌母豬血液中基因組DNA，所選個體近3代內(nèi)無直接和間接血緣關系，利用Illumina HiSeq 2000平臺進行測序。同時從EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ebi.ac.uk/）下載了不同地域豬種的重測序數(shù)據(jù)，包括亞洲野豬、4個歐洲家豬、11個中國家豬。

1.2.2 單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析 利用BWA軟件將榮昌豬和亞洲野豬重測序數(shù)據(jù)比對到豬參考基因組，運用SAMtools工具獲得單核苷酸多態(tài)性位點（single nucleotide polymorphisms，SNP），計算每個個體在每個基因組位置的基因型可能性，并估計等位基因頻率。篩選出高質(zhì)量SNP用于后續(xù)分析，判斷標準為：SNP測序覆蓋度≥4且≤1 000，均方根比對質(zhì)量≥20，相鄰SNP的距離≥5 bp，每組樣本的缺失率<50%。

1.2.3 群體遺傳選擇分析 應用滑行窗口法（100 kb窗口+10 kb步伐）計算100 kb內(nèi)SNP位點等位基因數(shù)進行選擇信號分析。對榮昌豬和亞洲野豬的平均雜合度（Hp）、遺傳分化系數(shù)（Fst）以及選擇統(tǒng)計量（Tajima’s D，即基因組中的選擇指標）進行量化。為了檢測具有顯著受選擇的基因組區(qū)域，運用Z值轉(zhuǎn)換對Hp和Fst值進行標準化，同時在榮昌豬中具有Z（Hp）值低于-2且Z（FST）高于2的窗口可作為強選擇信號的區(qū)域。

1.2.4 miR-378二級結(jié)構(gòu)及其自由能預測 利用RNAfold在 線 軟 件（http：//rna.tbi.univie.ac.at//cgibin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）對miR-378野生型和突變型的二級結(jié)構(gòu)及其自由能進行預測。

1.2.5 油紅O染色定量 合成了3種不同microRNA類似物，分別為野生型組miR-378W，突變型組miR-378M和對照組Control，其中Control為無義序列，每組設置3個重復孔。將這3種microRNA類似物分別轉(zhuǎn)染到3T3-L1細胞，當細胞在6或12孔板中分化培養(yǎng)到第8天，用PBS（含10%福爾馬林）在室溫下固定1 h，再用蒸餾水沖洗孔板3次。用含0.5%油紅O染色1 h，之后用異丙醇或PBS清洗，即可在顯微鏡下觀察。之后，用異丙醇溶解脂滴，在酶標儀上檢測550 nm吸光度值，其中脂肪分化程度和油滴大小與吸光度成正相關。

1.2.6 定量RT-PCR 將上述1.2.5中的3種miRNA類似物分別轉(zhuǎn)染到3T3-L1細胞，每組設置3個重復孔，當細胞在6或12孔板中分化培養(yǎng)到第8天，裂解細胞釋放mRNA，隨后利用反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR檢測與脂質(zhì)生成和分解相關基因mRNA表達情況，10 μL反應體系：GoTaq@qPCR Master Mix（2×）5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.2 μL，CXR 0.1 μL，cDNA 1μL，ddH2O 3.5 μL。反應程序：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)，采用2-△△Ct方法計算基因表達量。RT-PCR所用引物如表1。

表1 RT-PCR引物Table 1 RT-PCR primers

1.2.7 miR-378基因的擴增以及基因型判定 在Ensembl豬 基 因 組 數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index）中獲取位于十二號染色體miR-378附近的基因序列。采用Primer3軟件在線（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）設計擴增引物（表2）。用 Q5超保真DNA聚合酶配置50 μL PCR反應體 系：5×reaction buffer 10 μL；MgCl2（15 mmol）1.5 μL；dNTPs（10 mmol/L）1.0 μL；forward primers（10 μmol/L）2.5 μL；rorward primers（10 μmol/L）2.5 μL；Template DNA（50 ng/μL）2.0 μL；Q5 highfidelity DNA polymerase 0.5 μL；加水至 50 μL。采用凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。隨后采用ABI公司 3730 基因序列分析儀以下游引物進行反向測序。將測序峰圖文件比對到基因組參考序列中，根據(jù)峰圖結(jié)果判斷該位置基因型，如果為G堿基單峰則基因型為GG型；如果為A/G雙峰同時出現(xiàn)則基因型為AG型；如果為A堿基單峰基因型為AA型。

表2 miR-378擴增引物Table 2 Amplification primer of miR-378

1.2.8 miR-378種子序列多態(tài)性與表型的相關性分析 挑選同一批次、相同飼養(yǎng)條件、相近的屠宰體重（100 kg左右）的榮昌豬雜交群體進行屠宰性能測定，收集基因分型群體的生長、胴體性狀指標并與基因型和個體編號一一對應，建立如下的固定效應模型，采用 SAS 統(tǒng)計分析軟件包的常規(guī)線形模型過程（PRO-GLM）進行重復數(shù)不等資料的方差分析和多重比較。

其中，Yijk：個體胴體肉質(zhì)性狀的觀測值；μ：胴體及肉質(zhì)性狀的群體均值；bi：第i個品種（種群）效應（i的不同數(shù)值代表不同的豬種或雜交組合）；hj：第j個場效應值（j的不同數(shù)值代表不同的采樣豬場）；gk：第k個基因型效應（k=1、2、3，分別對應 AA、AG、GG 基因型）；eijk：隨機殘差效應。

1.2.9 統(tǒng)計分析 使用Excel 2013進行試驗數(shù)據(jù)整理，用SPSS l9軟件中的Student′s t-test進行差異顯著分析，使用Publisher 2013作圖。

2 結(jié)果

2.1 miR-378位點突變遺傳效應分析

豬12染色體上miR-378位位點的坐標為38 396 700-38 396 767，存在于TBX2和BCAC3之間的基因間區(qū)。將榮昌豬和亞洲野豬重測序數(shù)據(jù)與豬參考基因組對比，找到了大量的SNP位點，以每100 kb窗口內(nèi)的SNP為統(tǒng)計單元進行群體遺傳選擇分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與亞洲野豬相比，榮昌豬miRNA-378所在區(qū)域的Tajima′s D值更偏離零（約-6），表明這個區(qū)域存在大量的低頻等位基因位點，同時它在榮昌豬中的Z（Hp）值小于-2（約-4.5）且Z（FST）值大于2（約2.5），說明在榮昌豬的馴化過程中，miRNA-378位于一個受到強烈選擇的基因組區(qū)域中（圖1）。

圖1 miR-378位點在榮昌豬和亞洲野豬中的群體遺傳選擇分析Fig.1 Population genetic selection analysis of miR-378 locus in Rongchang pig and Asian wild boar

與參考基因組序列對比發(fā)現(xiàn)，在榮昌豬miRNA-378-3p的功能核心區(qū)——種子序列中，第5位堿基出現(xiàn)一個由A到G的單堿基突變（A>G）。這個突變導致miRNA-378前體的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，其莖結(jié)構(gòu)上的凸環(huán)顯著變小；自由能由原來的-23.00 kcal/mol變?yōu)?26.90 kcal/mol，下降17.2%（圖2）。這很有可能直接影響成熟miRNA-378的生成以及靶基因的識別，從而直接改變其功能上的表現(xiàn)。

圖2 miR-378野生型（miR-378W）和突變型（miR-378M）二級結(jié)構(gòu)以及自由能分析Fig.2 Secondary structure and free energy analysis of miR-378 wild type（miR-378W）and mutated type（miR-378 M）

通過統(tǒng)計不同豬種重測序數(shù)據(jù)在該突變位點的基因頻率發(fā)現(xiàn)，在亞洲野豬中A和G的基因頻率接近0.5；在長白豬和杜洛克豬種中等位基因A的頻率接近1；而在中國12個地方豬種和2個國外豬種（約克夏豬和皮特蘭豬）中該位點等位基因的比例不盡相同，其中香豬G等位基因的頻率最高，內(nèi)江豬A等位基因的頻率最高，這可能與人工選擇的強度大小有關（圖3）。

圖3 miR-378種子序列第5位堿基（A/G）在不同豬種中的等位基因頻率Fig.3 Allele frequency of the fifth base（A/G）of miR-378 seed sequence in different pig breeds

2.2 miR-378突變對脂肪細胞分化以及脂質(zhì)相關基因表達的影響

miRNA-378已經(jīng)被報道在脂肪沉積等過程中起重要作用。為了驗證種子序列的突變是否改變了miRNA-378的功能，我們將野生型（miR-378W）和突變型（miR-378M）類似物轉(zhuǎn)染至3T3-L1前脂肪細胞中，檢測各組脂質(zhì)沉積情況。在誘導分化第8天，兩種miRNA表達水平具有極顯著增加，與Control相比，miR-378W提高了~15倍且miR-378M 提高了~21倍（圖4-A）。油紅O染色發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，miR-378W組的脂滴累積明顯增加，而miR-378M組脂滴累積并不明顯（圖4-B）。通過酶標儀檢測550 nm吸光度值，對脂滴含量進行定量分析也發(fā)現(xiàn)，miR-378W組的脂滴含量極顯著高于Control組和miR-378M組，miR-378M組與Control組的脂滴含量差異不顯著（圖4-C）。這說明miR-378能促進脂質(zhì)沉積，然而其種子序列突變后缺失了促脂生成的功能。

圖4 miR-378W和miR-378M對脂肪細胞脂質(zhì)生成的影響Fig.4 Effects of miR-378W and miR-378 M on the lipid production of adipocytes

隨后在脂肪細胞分化過程中，通過對脂肪生成相關基因進行表達量分析發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，脂肪生成相關基因PPAR-γ、PGC-1α和PGC-1β在miR-378W組表達量顯著升高，而在miR-378M組除了PPAR-γ，其他基因的表達量沒有變化（圖5-A）；而在miR-378W組，脂肪分解相關基因HSL、ATGL和CGI-58的表達水平有顯著下降，而miR-378M組卻沒有變化（圖5-B）。這表明miR-378種子序列的突變的確改變了對某些脂質(zhì)相關基因的調(diào)控作用。

圖5 miR-378W和miR-378M對脂質(zhì)相關基因表達的影響Fig.5 Effects of miR-378W and miR-378 M on the expression of lipid related genes

2.3 miRNA-378種子序列多態(tài)性與表型的相關性分析

miR-378成熟體序列以及其種子序列在10個物種間（豬、人、大鼠、小鼠、牛和羊等）具有高度保守（圖6），同時由2.2可知，種子序列的突變改變了miR-378促進脂質(zhì)生成的功能以及對相應基因的調(diào)控作用，因此miR-378極有可能是具有重要功能的經(jīng)濟性狀調(diào)控位點。

圖6 miR-378在10個物種間的堿基序列比對Fig.6 Base sequence alignment of miR-378 among 10 species

為此，我們在107頭榮昌豬雜交群體中利用PCR擴增測序發(fā)現(xiàn)了該突變位點存在3種基因型（AA、GG和AG）（圖7），其中AA型32頭、GG型24頭、AG型51頭。隨后將這些豬的屠宰測定數(shù)據(jù)與該位點基因型進行性狀關聯(lián)分析，結(jié)果表明在最小二乘均值方面，最后肋骨處背膘厚性狀表現(xiàn)出GG>AG>AA的趨勢，并達到顯著水平（P<0.05），3個基因型個體最小二乘均值分別為（2.77±0.20）cm、（2.66±0.13）cm 和（2.63±0.16）cm。GG基因型個體的最后肋骨處眼肌面積顯著低于AA基因型個體。A等位基因在降低最后肋骨處背膘厚，增大眼肌面積，提高胴體瘦肉率方面的加性效應分別為0.07 cm、1.22 cm2和 0.32%，顯性效應分別為-0.04 cm、0.445 cm2和0.07%（表3）。

表3 miR-378種子序列3種基因型在群體中的個體數(shù)及與屠宰性狀之間的關聯(lián)分析Table 3 Number of individuals for three genotypes of miR-378 seed sequence in the population and their association with slaughter traits

圖7 榮昌豬雜交群體中miR-378種子序列多態(tài)性測序峰圖Fig.7 Polymorphism of miR-378 seed sequence in Rongchang pig cross population

3 討論

人工選擇是影響家畜群體基因平衡的重要因素［22］，而榮昌豬12號染色體miR-378位點具有極強的人工選擇信號；同時榮昌豬miR-378-3p種子序列第5位發(fā)生了突變（A>G）；但是這個突變位點在不同豬種中受到的人工選擇卻大不相同，在自然狀態(tài)下，亞洲野豬A和G的基因型頻率是相同的，然而在受到強烈人工選擇的長白豬和杜洛克豬種中G基因型消失了，在其他家豬中也出現(xiàn)了G基因頻率不同程度的下降，這說明人工選擇更趨向于保留A基因型，且人工選擇強度越大A基因頻率越高。除此之外，我們還在外種豬（皮特蘭豬和約克夏豬）中也發(fā)現(xiàn)了G基因型，這與Chai等［15］認為G基因型只存在于中國地方豬種的結(jié)論相矛盾。

miRNA的突變通常會改變其pri-miRNAs或premiRNAs的二級結(jié)構(gòu)，從而影響剪切效率，最后導致成熟miRNA表達量的變化。在人MLL-AF4急性淋巴細胞性白血病中，Kotani等［6］發(fā)現(xiàn)pre-miR-128b序列中出現(xiàn)一個A>G變異，該突變降低primiR-128b的加工效率，導致成熟體miR-128b的表達量顯著下調(diào)；Sun等［7］發(fā)現(xiàn)莖環(huán)結(jié)構(gòu)上的C>T突變改變了pre-miR-15b的二級結(jié)構(gòu)和自由能，影響了pre-miR-15b的生物加工過程；Duan等［9］發(fā)現(xiàn)miR-125a種子序列第八位G>T的突變影響了與剪切酶的結(jié)合，最終導致成熟體表達量發(fā)生改變。而本研究也發(fā)現(xiàn)miR-378-3p種子序列第5位A>G的突變使得其莖環(huán)結(jié)構(gòu)變小以及自由能下降，這會導致pri-miR-378二級結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，有利于提高Drosha酶對pri-miR-378的剪切效率，促進pri-miR-378到pre-miR-378的加工過程。

種子序列是動物miRNA識別并結(jié)合靶基因的關鍵功能元件，種子序列的突變會直接導致miRNA功能的改變。大量研究證明，miR-378在脂肪組織中具有較高的表達水平，能夠在脂肪細胞中調(diào)控C/EBP-α和C/EBP-β基因的轉(zhuǎn)錄和表達，進而促進脂肪細胞分化、脂質(zhì)的增加［11］。的確，我們通過microRNA 類似物的轉(zhuǎn)染實驗發(fā)現(xiàn)了miR-378具有促脂肪生成的作用，但種子序列A>G的突變導致了miR-378缺失了相應的功能，這與先前的報道一致［15］。同時脂肪細胞在脂質(zhì)沉積過程中，不僅受到脂肪分化相關基因的影響，而且也會受脂肪分解代謝相關基因的影響。PGC-1α和PGC-1β對脂肪細胞分化、線粒體合成以及能量代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用［23-24］；PPAR-γ能調(diào)控脂肪分化相關的信號轉(zhuǎn)導，降低脂肪分解速度［25］。而ATGL和HSL是重要的脂肪分解酶，二者可共同作用通過催化甘油三酯水解形成游離脂肪酸，調(diào)節(jié)脂肪分解代謝過程［26-27］；而CGI-58 是 ATGL 的激活劑［28］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-378W可以通過上調(diào)與脂肪分化相關基因（PGC-1α、PGC-1β、PPAR-γ）的表達和下調(diào)與脂肪分解相關基因（ATGL、HSL、CGI-5）的表達兩種途徑來影響脂質(zhì)生成。但很遺憾，我們并沒有在這些與脂肪生成、分解直接相關基因的3′ UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)miR-378的結(jié)合位點，這可能是通過一些其他通路（如C/EBP-α等）間接調(diào)控這些基因。然而除了PPAR-γ以外，miR-378M并未影響其他基因的表達，說明種子序列突變改變了miR-378在脂肪細胞中的基因調(diào)控方式，最終影響細胞分化和脂質(zhì)沉積的功能。

背膘厚和眼肌面積遺傳力高，二者是豬遺傳育種和性能鑒定中的重要參數(shù)［29］。近年來，豬的主要選育方向是減小背膘厚度，增加眼肌面積，提高胴體瘦肉率。我們通過比較豬miRNA-378 種子序列多態(tài)性與屠宰性能測定數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，與突變GG型相比，野生純合子AA型和雜合子AG型的背膘厚有顯著的減小，這與miR-378敲除的小鼠皮下脂肪體積減少的現(xiàn)象相一致；而AA型的眼肌面積比GG型有顯著的增加；再加之前面闡述的人工選擇強度越大A基因頻率越高的特點，這些發(fā)現(xiàn)都與選育目標十分吻合。除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)在細胞水平驗證得出的脂肪沉積能力野生型（AA）大于突變型（GG）的結(jié)論與豬背膘厚GG>AG>AA的趨勢相悖，而miRNA-378對于脂肪組織（背膘）和肌肉組織（眼肌）的大小有著相反的作用結(jié)果，這可能與miR-378調(diào)控細胞的增殖和凋亡的功能相關。組織大小是由細胞在發(fā)育過程中的數(shù)量決定的，主要表現(xiàn)在增殖和凋亡兩方面［30］，miRNA-378在不同細胞中扮演者不同的作用，如miRNA-378可靶向BRAF抑制大腸癌細胞增殖和誘導凋亡［31］；能降低SDAD1表達來抑制結(jié)腸癌細胞的增殖［32］；下調(diào)KLF9促進骨肉瘤細胞增殖［33］；抑制骨髓增生異常綜合征細胞生長和促進凋亡［34］等。然而在脂肪細胞中miRNA-378能促進細胞凋亡［35］，所以AA型雖然能促進脂肪增加，但減少了細胞數(shù)量降低背膘厚度；在肌細胞中miRNA-378能抑制細胞凋亡［36］，故AA型能增加細胞數(shù)量，提升眼肌面積。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)了豬miR-378位點具有極強的人工選擇信號，其種子序列的多態(tài)性不僅改變了miR-378的功能，而且與豬的背膘厚度和眼肌面積指標顯著相關，該位點可作為豬遺傳分子標記用于豬的育種實踐中。