白新峰 賈愛榮 劉雪 張綿松 崔婷婷 劉德亭 劉昌衡

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)生物研究所，濟(jì)南 250103；2.山東海城生態(tài)科技集團(tuán)有限公司，濱州 251909）

海參作為一種優(yōu)質(zhì)的天然營養(yǎng)保健食品，近年來需求不斷增加，國內(nèi)海參總產(chǎn)量超過1.7×105t，產(chǎn)值超過600億元［1］。海參主要以微生物、大型藻類碎片、有機(jī)碎屑等為食［2］。在集約化人工養(yǎng)殖過程中通常會添加人工餌料以促進(jìn)海參生長。大型藻類可作為水產(chǎn)養(yǎng)殖動物餌料的主要成分，其中，鼠尾藻是最優(yōu)質(zhì)的海參餌料，但其產(chǎn)量和價(jià)格限制其廣泛應(yīng)用。褐藻門的海帶、馬尾藻和羊棲菜，以及紅藻門的石花菜、麒麟菜等同樣是常見的大型藻類，這些藻類中含有豐富的褐藻膠和卡拉膠等藻類多糖成分。藻類多糖是藻類的重要組分，它們是由各類寡糖組成的高分子聚合物［3-4］，藻類多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、促進(jìn)動物生長發(fā)育、抗菌抗炎等多種生物學(xué)活性［5-7］。在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，藻類多糖作為飼料添加劑使用。研究表明添加滸苔多糖可以顯著提高對蝦的生長性能、提高免疫、改善腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)［8］。飼喂海藻酸鈉，可以提高鮑魚的免疫活性、增強(qiáng)對病原菌的抗性［9］。但是藻類多糖結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不容易被海參等動物消化吸收，限制了藻類的高效利用。同時(shí)，藻類多糖具有較高的黏性，大量藻類多糖殘留于養(yǎng)殖水體會導(dǎo)致水體環(huán)境污染。因此，通過微生物降解藻類多糖成分，促進(jìn)海參等動物對藻類成分的消化吸收，提高藻類的應(yīng)用范圍和效率，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

微生物是藻類多糖的主要分解者，研究人員已經(jīng)從藻類體表、藻類生存環(huán)境以及動物消化道等生境中分離到大量的可以降解藻類多糖的微生物和酶類。這些藻類多糖降解菌主要來自噬瓊膠菌屬、單胞菌屬、棒狀桿菌屬、假交替單胞菌屬、芽孢桿菌屬、單胞菌屬、假單胞菌屬和弧菌屬等［10-12］。從養(yǎng)殖生境特別是動物腸道體內(nèi)篩選的本土微生物，更容易適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境，可在腸道中形成長期定殖，同時(shí)對養(yǎng)殖環(huán)境和動物更加安全，因而是養(yǎng)殖領(lǐng)域有益微生物篩選的首選［13］。

本研究通過采用養(yǎng)殖過程中藻粉誘導(dǎo)的方式在海參體內(nèi)富集海藻多糖降解微生物，分別以褐藻膠和卡拉膠為唯一碳源，經(jīng)過富集和純化，從海參腸道內(nèi)容物中篩選具有褐藻膠和卡拉膠降解活性的微生物，并對其進(jìn)行鑒定，為促進(jìn)藻類在海參養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 仿刺參（Apostichopus japonicus）采集于山東濱州地區(qū)養(yǎng)殖場。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）褐藻膠降解菌富集培養(yǎng)基：褐藻膠3 g-7 g，NaCl 15 g，MgSO4·7H2O 1 g，K2HPO42 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，（NH4）2SO42 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。（2）卡拉膠富集培養(yǎng)基：卡拉膠3-7 g，NaCl 15 g，MgSO4·7H2O 1 g，K2HPO42 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，（NH4）2SO42 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。（3）褐藻膠降解菌初篩培養(yǎng)基：褐藻膠5 g，其他成分同褐藻膠降解菌富集培養(yǎng)基。（4）卡拉膠降解菌初篩培養(yǎng)基：卡拉膠5 g，其他成分同卡拉膠降解菌富集培養(yǎng)基。（5）發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 15 g，褐藻膠或卡拉膠5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。（6）蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶活性驗(yàn)證培養(yǎng)基及LB培養(yǎng)基配方參照李鳳輝的方法［14］。

1.1.3 試劑 本研究所用到的所有生化試劑均為國產(chǎn)分析純試劑?？侱NA提取試劑盒（OMEGA 土壤DNA提取試劑盒）。血瓊脂平板（青島日水生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌種篩選

1.2.1.1 海參體內(nèi)海藻多糖降解菌的富集 向商業(yè)化海參飼料中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為4%的海帶粉和石花菜粉制成多糖降解菌誘導(dǎo)飼料。用該飼料喂養(yǎng)海參10 d，每日下午喂食一次，喂食量為海參體重的 1.5%，次日中午清理剩余殘?jiān)Q水 1/2，通過飼喂誘導(dǎo)飼料達(dá)到富集海參體內(nèi)海藻多糖降解菌的目的。

1.2.1.2 海參腸道內(nèi)容物中海藻多糖降解菌的富集 飼喂結(jié)束后，無菌條件下解剖海參，獲得海參腸道內(nèi)容物。分別取0.5 g海參腸道內(nèi)容物加入到50 mL褐藻膠降解菌富集培養(yǎng)基和卡拉膠降解菌富集培養(yǎng)基中，28℃條件下200 r/min震蕩培養(yǎng)3 d。取上清液轉(zhuǎn)接到新的相應(yīng)富集培養(yǎng)基中，連續(xù)富集培養(yǎng)3次，逐漸提高培養(yǎng)基中褐藻膠和卡拉膠的濃度。

1.2.1.3 海藻多糖降解菌初篩 將最終富集液梯度稀釋至10-3-10-5倍，取100 μL稀釋液分別涂布于相應(yīng)初篩培養(yǎng)基中，28℃條件下靜置培養(yǎng)5 d，挑取具有明顯降解圈的菌株，采用LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行劃線分離純化，最終得到純菌種。

1.2.1.4 海藻多糖降解菌的復(fù)篩 活化菌種，按照5%（V/V）接種量接種到相應(yīng)發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)24 h，5 000×g離心10 min收集上清液，采用DNS法測定上清液對應(yīng)海藻多糖降解能力。反應(yīng)體系：1 mL上清液，1 mL 0.5%的海藻酸鈉或卡拉膠，2 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液，40℃條件下反應(yīng)30 min。反應(yīng)完成后加入2 mL DNS 溶液終止反應(yīng)，煮沸10 min，冰水冷卻后5 000×g離心10 min，取上清液測定540 nm處吸光度值。酶活力（U/mL）定義：1 mL發(fā)酵液每分鐘催化產(chǎn)生1 μg還原糖所需的酶量，定義為1個酶活力單位。

1.2.1.5 菌株生長及酶活力特性測定 菌株生長特性檢測 采用LB液體培養(yǎng)基活化菌種，接種3%（V/V）的菌液200 mL相應(yīng)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃條件下200 r/min 震蕩培養(yǎng)。從0 h開始每隔3 h取樣，測定600 nm吸光度值，繪制生長菌株曲線。在菌體生長特性檢測過程中，同時(shí)取樣檢測發(fā)酵液的褐藻膠和卡拉膠降解酶活力，繪制發(fā)酵液酶活力變化曲線。

1.2.1.6 菌株降解餌料主要有機(jī)物能力 采用LB液體培養(yǎng)基活化菌種，接種4 μL菌液到相應(yīng)固體平板，28℃靜置培養(yǎng)3 d。蛋白酶直接觀察透明圈，淀粉酶培養(yǎng)基采用盧戈氏碘液染色，CMC培養(yǎng)基采用剛果紅染色。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 菌株形態(tài)觀察 在LB固體平板劃線觀察菌落形態(tài)，采用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體，通過光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)。

1.2.2.2 菌株的部分生理生化特征檢測 參照《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)手冊》。

1.2.2.3 菌株16S rDNA序列鑒定 使用土壤細(xì)菌DNA提取試劑盒提取集體發(fā)酵液總DNA，采用細(xì)菌測序通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1 492 R：TACGGYTACCTTG- TTACGACTT）。反應(yīng)體系：H2O 25 μL，Mix Buffer 22 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，總體積50 μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，33循環(huán)（95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min），循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測純度。將獲得的特異性DNA產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司采用ABI 3730XL全自動DNA測序儀進(jìn)行DNA序列測定。測序結(jié)果在Ezbiocloud網(wǎng)站（https：//www.ezbiocloud.net/）與模式菌株進(jìn)行16S rDNA基因序列比對，以確定菌株種屬。采用MEGA 7軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.3 菌株安全性檢測

1.2.3.1 溶血活性檢測 采用血瓊脂平板法檢測菌株溶血活性。取4 μL菌液點(diǎn)種到血瓊脂平板上，28℃靜置培養(yǎng)3 d，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈，若出現(xiàn)透明圈，則具有溶血活性。

1.2.3.2 菌株應(yīng)激海參實(shí)驗(yàn) 液體培養(yǎng)并離心收集菌體，使用無菌海水制成菌懸液，最終菌體濃度為1×108CFU。取個體重量為100 g左右健康海參30頭，隨機(jī)平均分為3組，實(shí)驗(yàn)組每頭海參體內(nèi)采用注射器注射0.5 mL菌液，對照組采用無菌海水替代菌液。3組海參分別放入0.8 m2海參培養(yǎng)槽，相同條件下養(yǎng)殖10 d，記錄海參的健康狀況及死亡率。

2 結(jié)果

2.1 菌株篩選

本研究通過添加海帶和石花菜粉喂養(yǎng)海參，對海參體內(nèi)褐藻膠和卡拉膠降解菌進(jìn)行富集，采用海藻酸鈉和卡拉膠作為唯一碳源，進(jìn)行以上兩種多糖降解菌的篩選，最終分別篩選到9株褐藻膠降解菌和7株卡拉膠降解菌。分別以兩種多糖降解活性為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩，選取活性最高的褐藻膠降解菌HZ-1和卡拉膠降解菌KL-6進(jìn)行后續(xù)研究（圖1-A，1-B）。

圖1 菌株部分生物學(xué)表型Fig.1 Some biological phenotypes of the strains

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)及生理生化特征 褐藻膠降解菌HZ-1和卡拉膠降解菌KL-6在LB固體平板表面形成圓形菌落，菌落呈淡黃色或黃褐色，菌落不透明，易挑起（圖1-C，1-D）。液體培養(yǎng)條件下菌體形態(tài)均為桿狀，其中HZ-1為較小的短桿菌，KL-6體型較大（圖1-E，1-F），革蘭氏染色結(jié)果均為陽性，通過芽孢染色均可檢測到芽孢存在。兩菌株適宜生長的pH范圍均為5-8左右。在耐鹽性方面，兩菌株可在NaCl濃度為7%（W/V）條件下生長，菌株HZ-1具有更強(qiáng)的耐鹽性，可以在NaCl濃度為10%（W/V）的條件下生長，但生長活性較弱，菌株KL-6無法在10%（W/V）的NaCl中生長。菌株HZ-1和KL-6均可以葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖為唯一碳源進(jìn)行生長，KL-6還可以利用阿拉伯糖進(jìn)行生長。其他生理生化指標(biāo)見表1。

表1 菌株HZ-1和KL-6的部分生理生化特征Table1 Some physiological and biochemical characteristics of strains HZ-1 and KL-6

2.2.2 16S rDNA測序分析 結(jié)果表明HZ-1與 Bacillus altitudinis相似性最高達(dá)99.3%，KL-6與Bacillus megaterium相似性最高達(dá)99.93%。結(jié)合兩菌株的形態(tài)特征和生理生化結(jié)果，兩菌株鑒定為芽孢桿菌，分別命名為Bacillus sp. HZ-1和Bacillus sp. KL-6，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 2所示。

圖2 菌株HZ-1和KL-6的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strains HZ-1 and KL-6

2.3 菌株生長及產(chǎn)酶特性

菌株HZ-1和KL-6均可在發(fā)酵培養(yǎng)基中快速生長（圖3）。菌株HZ-1在18 h生物量接近最高值，OD值達(dá)到1.95，發(fā)酵液酶活力在24 h達(dá)到最高值，為43.2 U/mL。菌株KL-6在21 h生物量接近最高值，OD值達(dá)到2.75，發(fā)酵液酶活力在24 h達(dá)到最高值，為1.45 U/mL。進(jìn)入穩(wěn)定期后發(fā)酵液酶活力逐漸降低，推測可能由于菌體老化和營養(yǎng)物質(zhì)濃度降低有關(guān)，菌株KL-6酶活力降低速率要低于HZ-1。

圖3 菌株HZ-1（A）和KL-6（B）的生長和產(chǎn)酶特征曲線Fig. 3 Growth and enzyme production characteristic curves of strains HZ-1（A）and KL-6（B）

2.4 菌體降解其他有機(jī)物活性

微生物對餌料成分的降解可以促進(jìn)動物對餌料的吸收利用，除褐藻膠和卡拉膠外，本研究檢測了兩菌株對海參餌料中其他主要有機(jī)物的降解能力。結(jié)果表明HZ-1具有降解淀粉、纖維素和蛋白質(zhì)成分的能力，其透明圈直徑和菌落直徑的比值R/r分別為1.59、2.08和1.60。KL-6具有降解淀粉和蛋白質(zhì)的能力，其R/r值分別為2.31和2.29（圖4-A、4-B和 4-C）。

2.5 菌株安全性評估

菌株HZ-1具有溶血活性，KL-6無溶血活性（圖4-D）。兩菌株均為芽孢桿菌，菌株具有溶血活性可能并不會對動物具有致病性。為進(jìn)一步研究菌株是否影響海參的健康，采用菌體應(yīng)激的方法檢測菌體對海參健康的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組和實(shí)驗(yàn)組海參均健康存活，沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，表明兩菌株對海參健康無顯著影響。

圖4 菌株部分生物學(xué)活性檢測Fig. 4 Detection of some biological activities of the strain

3 討論

褐藻、紅藻等大型藻類是重要的海洋生物質(zhì)資源，也是海洋動物的重要食物來源。多糖是藻類的重要活性成分，但是海藻多糖結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性導(dǎo)致其不易被動物消化吸收。海藻寡糖作為海藻多糖的降解產(chǎn)物同樣具有良好的生物學(xué)活性［15-16］。研究表明，低分子量的海藻酸鈉寡糖對羅非魚的生長性能、免疫力和抗病性都有促進(jìn)作用［17］。同時(shí)，小分子寡糖易被消化吸收，利用效率高，因此具有更廣泛的應(yīng)用前景。

篩選具有發(fā)酵海藻、降解藻類多糖能力的微生物和酶類，從而提高藻類的應(yīng)用范圍和效率是近年來的研究熱點(diǎn)［18］。研究人員已從藻類體表、水體、海泥多處環(huán)境篩選到大量的具有褐藻膠和卡拉膠降解功能的菌株和降解酶［19-21］。本研究篩選出的褐藻膠降解菌HZ-1和卡拉膠降解菌KL-6，均為芽孢桿菌。芽孢桿菌作為一種重要的益生菌，具有安全性好、生長迅速、產(chǎn)酶種類多樣、酶活力高的特點(diǎn)。研究表明，通過Bacillus amyloliquefaciens WB1發(fā)酵含有海帶成分的海參飼料，降解褐藻膠成分，可以顯著提高海參生長性能、非特異性免疫活性和對弧菌感染的抵抗能力［22］。菌株HZ-1和KL-6具有較高的海藻多糖降解活力，同時(shí)具有淀粉酶、蛋白酶活力，KL-6還具有纖維素酶活力，因而兩株菌具有發(fā)酵海藻飼料的應(yīng)用潛力。

芽孢桿菌是水生動物腸道菌群的重要組成部分［23］。腸道菌群作為動物降解食物的重要參與者，在水生動物降解藻類多糖過程中起到關(guān)鍵作用。李昌明等［24］對海參腸道菌群進(jìn)行純化培養(yǎng)，并對菌株進(jìn)行褐藻膠降解能力檢驗(yàn)，高活性菌株主要為弧菌屬和芽孢桿菌屬。本研究篩選的兩株菌體來源自海參腸道內(nèi)容物，因而其對海參和養(yǎng)殖環(huán)境安全性更高，研究結(jié)果也表明菌株HZ-1雖有一定溶血活性，但對海參健康無影響。同時(shí)，作為內(nèi)源性菌株，兩株菌體更容易在腸道定殖。因此，兩菌株可以直接作為菌劑投放于養(yǎng)殖水體，使其在海參腸道定殖，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高海參腸道菌群酶系活力，增加海參對藻類及其他食物的利用率。

4 結(jié)論

通過藻粉誘導(dǎo)富集，從海參腸道內(nèi)容物中篩選到高活性的褐藻膠降解菌HZ-1和卡拉膠降解菌KL-6，經(jīng)生理生化檢測和16S rDNA 測序鑒定兩菌株均為芽孢桿菌。

兩菌株生長迅速，其生物量在20 h左右即可達(dá)到最高值。在24 h時(shí)HZ-1酶活力達(dá)到43.2 U/mL，KL-6卡拉膠酶活力為1.45 U/mL。

兩菌株生長的pH范圍均為5-8左右。兩菌株可在NaCl濃度為7%（W/V）條件下生長，菌株HZ-1具有更強(qiáng)的耐鹽性，它可以在NaCl濃度為10%（W/V）的條件下生長。兩菌株可以利用葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖作為唯一碳源，KL-6還可以利用阿拉伯糖進(jìn)行生長。

兩菌株均具有較高的蛋白酶和淀粉酶活性，HZ-1還具有纖維素酶活力。HZ-1具有一定溶血活性，但是兩菌株對海參健康無明顯影響。