黃景曉 尚俊康 陳慧敏 沈嘉旻 黎圓圓 喻玉立 倪進(jìn)東 林伯坤

（廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 東莞市環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東莞 523808）

隨著經(jīng)濟(jì)全球化的深入和食品洲際運(yùn)輸?shù)脑黾樱吃葱约膊〉牧餍幸殉蔀橐粋€(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題［1］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的估計(jì)，這些食源性病原體每年可能導(dǎo)致6億人患病，42萬人死亡，以及低收入和中等收入國(guó)家生產(chǎn)力和醫(yī)療成本的損失約1 100億美元［2-4］。其中沙門氏菌是社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)最重的食源性致病菌，在2017年引致全球約1 430萬宗傷寒或副傷寒個(gè)案及53.5萬宗非傷寒沙門氏 菌［5-6］。沙門氏菌的污染可發(fā)生在食物鏈的任何一個(gè)環(huán)節(jié)，包括收獲、生產(chǎn)、加工、保存和其他從農(nóng)場(chǎng)到消費(fèi)者的過程［7］。沙門氏菌可隱藏在灌溉水和土壤中污染果蔬和農(nóng)作物［8-9］，也能以生物膜的形式覆蓋在機(jī)器設(shè)備和保存用具的表面［10-11］。為了控制這種細(xì)菌感染，抗生素的使用逐年增加，這加速了抗生素在環(huán)境中的殘留和耐藥菌的出現(xiàn)［12-14］。如果不采取有效措施解決抗菌素耐藥性問題，到2050年，將可能導(dǎo)致全球每年約1 000萬人死亡和60-100萬億美元的生產(chǎn)力損失［15］。

噬菌體作為天然的細(xì)菌“殺手”，不受細(xì)菌耐藥性的制約，能特異性識(shí)別并殺滅病原菌，不會(huì)破壞腸道菌群平衡和傷害人體健康［16］。同時(shí)，噬菌體具有分布廣泛、自我繁殖能力強(qiáng)、殺滅能力強(qiáng)、不影響食物的感官性狀等優(yōu)點(diǎn)，使得噬菌體生物防治成為處理食品生產(chǎn)鏈中的病原菌污染的理想方法［17］。目前，噬菌體的應(yīng)用已獲得美國(guó)農(nóng)業(yè)部食品及藥物管理局（FDA）和食品安全與美國(guó)農(nóng)業(yè)部（USDA）的批準(zhǔn)，作為食品原料和加工產(chǎn)品的抗生素代替物，以保障食品安全和消費(fèi)者健康［18-20］。烈性噬菌體分離鑒定是各種噬菌體劑研究的必要前提，同時(shí)針對(duì)其生物性狀進(jìn)行研究是優(yōu)化噬菌體劑的生產(chǎn)條件和在不同環(huán)境中開發(fā)應(yīng)用噬菌體的關(guān)鍵。本研究以腸炎沙門氏菌為宿主菌，從環(huán)境樣品中分離出一種具有良好的裂解能力的噬菌體PSM6，并通過裂解譜、最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長(zhǎng)曲線、溫度及pH穩(wěn)定性、形態(tài)學(xué)、基因組核酸類型分析和基因組測(cè)序分析，展開其生物學(xué)特性研究，為后續(xù)噬菌體抗菌劑的生產(chǎn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株和樣品采集：腸炎沙門氏菌（GIM 1.1105）購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心，裂解譜分析所用沙門氏菌來自深圳市疾病預(yù)防控制中心常規(guī)食品監(jiān)測(cè)分離，河水樣采自東莞市東江河段。

主要試劑及培養(yǎng)基：SM 緩沖液（NaCl 5.8 g/L，MgSO4·7H2O 2.0 g，1 mol/L pH為7.5的Tris-HCl 50 mL/L，2%明膠 5 mL/L）、LB液體培養(yǎng)基、2倍LB液體培養(yǎng)基、半固體LB培養(yǎng)基（添加瓊脂粉含量0.75%）、固體LB培養(yǎng)基（瓊脂含量1.5%）、pH3-13的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱）、麥?zhǔn)媳壬堋雀耸删w基因組DNA提取試劑盒（柱型）NEB DNase I和Mung-Bean Nuclease、索來寶RNase A和SYBR Green Ⅰ。

主要儀器：臺(tái)式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊）、上海一恒恒溫金屬浴、湘儀H1850R、三孔電熱恒溫水槽（上海精宏）、恒溫HY-5回旋式震蕩器（金壇市城東新瑞儀器廠）、超凈工作臺(tái)（蘇州智凈）、瓊脂糖水平電泳槽、FluorChem R 多功能成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Protein Simple）、NANODROP 2000c（美國(guó)Thermo公司）；超純水儀（Millipore公司）；FEITalosF200X透射電鏡（美國(guó)FEI）。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離純化 宿主菌復(fù)蘇：將凍存的腸炎沙門氏菌菌液三區(qū)劃線，接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱約12 h，取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，得到新鮮菌液。

樣品處理：使用經(jīng)高壓蒸汽滅菌后的塑料瓶采集污水樣品。以8 000 r/min后離心水樣15 min，取上清液用0.22 μm過濾注射器過濾。取濾液5 mL于20 mL LB液體培養(yǎng)基中，再加入500 μL菌液和2 mL SM緩沖液，混勻后220 r/min搖床培養(yǎng)12 h獲得富集液。富集液重復(fù)離心過濾取噬菌體濾液，按上述步驟再處理2次。

噬菌體的分離純化：分離步驟主要根據(jù)參考文獻(xiàn)略加修改［21-22］，噬菌體的分離純化采用雙層平板法分離噬菌體。用SM緩沖液對(duì)最后一次富集后的噬菌體濾液進(jìn)行10倍稀釋。取100 μL不同倍數(shù)的稀釋液與100 μL菌液于滅菌好的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，混合后靜置反應(yīng)15-20 min，吸入到45℃保溫的10 mL LB半固體普通培養(yǎng)基混合均勻，迅速倒入準(zhǔn)備好的普通固體平板上。將雙層平板置于37℃培養(yǎng)箱中，8 h后觀察有無噬菌斑。在15 h內(nèi)，挑取雙層平板上1個(gè)透亮、圓潤(rùn)的噬菌斑，置于含100 μL菌液和8 mL SM緩沖液的8 mL 2倍LB液體培養(yǎng)基的試管中，傾斜搖床12 h。搖床完畢后，重復(fù)上述方法，進(jìn)行3-5次純化，直到平板上所出現(xiàn)的噬菌斑的大小形態(tài)均勻一致為止。最后一次純化，保存噬菌體濾液并計(jì)算噬菌體效價(jià)備用。取滿板噬菌斑板的上層培養(yǎng)基于用15 mL SM緩沖液的15 mL 2倍LB液體培養(yǎng)基，過夜搖床擴(kuò)增培養(yǎng)保存。

噬菌體效價(jià)（PFU/mL）＝噬菌斑個(gè)數(shù)×稀釋倍數(shù)×10

1.2.2 噬菌體裂解譜的測(cè)定 將所存的沙門氏菌分別培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，取200 μL菌液于1.5 mL的離心管，用高壓滅菌好的棉拭子吸走所有菌液，涂抹于提前倒好的下層培養(yǎng)基，取3 μL噬菌體濾液滴于雙層平板上，正置30 min后，倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，觀察觀察有無裂解斑。

1.2.3 噬菌體的電鏡觀察 取10 μL擴(kuò)增培養(yǎng)后的噬菌體濾液滴于銅網(wǎng)上，自然沉淀 10 min，用濾紙從側(cè)面吸干多余的液體加1滴 2%磷鎢酸到銅網(wǎng)上，染色10 min，待銅網(wǎng)干燥后用透射式電鏡觀察，采用ImageJ軟件分析其大小。

1.2.4 最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定 使用麥?zhǔn)媳壬芊ê屯坎计桨宸ù_認(rèn)菌液濃度，將菌液和噬菌體濾液以不同數(shù)量倍數(shù)混合于1.5 mL的EP管，用LB液體培養(yǎng)基將總體系補(bǔ)足1 mL，37℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)3 h，以雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)，重復(fù)3次，即可得出最佳感染復(fù)數(shù)。

1.2.5 噬菌體的熱穩(wěn)定性 取1 000 μL噬菌體濾液（約108PFU/mL）于1.5 mL EP管中，分別于 40、50、60、70、80℃的水浴中作用2 h，每隔20 min取樣，并立即將樣品置于冰上冷卻，經(jīng)過10倍梯度稀釋后測(cè)定噬菌體的效價(jià)、分析噬菌體的存活情況、使用GraphPad Prism 8處理數(shù)據(jù)。

1.2.6 噬菌體的pH穩(wěn)定性 取100 μL噬菌體濾液（約108PFU/mL）于1.5 mL EP管中，分別加入900 μL不同pH值（即pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13）的Tris-HCl緩沖液中，37℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)2 h后，取100 μL進(jìn)行10倍梯度稀釋，用雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)，重復(fù)3次。通過計(jì)算效價(jià)，分析噬菌體的pH穩(wěn)定性。

1.2.7 一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 取1 mL對(duì)數(shù)期腸炎沙門氏菌菌液（約108CFU/mL），按照最佳感染復(fù)數(shù)加入噬菌體，常溫孵育15 min后，8 000 r/min離心2 min，棄上清，用LB液體培養(yǎng)基洗兩次去除游離噬菌體，細(xì)菌沉淀加入37℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基混勻，迅速置于37℃ 180 r/min的搖床振蕩培養(yǎng)，并開始計(jì)時(shí)。每20 min取樣，梯度稀釋后用雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)，重復(fù)3次。使用GraphPad Prism 8繪制一步生長(zhǎng)曲線，算出噬菌體的潛伏期和爆發(fā)量。爆發(fā)量計(jì)算公式：爆發(fā)量＝爆發(fā)末期噬菌體效價(jià)/感染初期宿主菌濃度。

1.2.8 噬菌體核酸的提取和核酸類型的判斷 噬菌體核酸的提取按照艾比根λ噬菌體基因組DNA提取試劑盒說明書，略有所修改。取14 mL的新鮮噬菌體培養(yǎng)液加入140 μL氯仿，4 000 r/min離心10 min，取上清12 mL。再以10 000 r/min離心并用0.22 μm過濾器的注射器過濾，取10 mL/管。分別加入50 μL RnaseA和DNase I，37℃ 180 r/min的搖床1 h，加入預(yù)冷的噬菌體沉淀液2 mL，顛倒混勻，4℃過夜?jié)饪s。之后按照說明書步驟進(jìn)行，所得核酸濃度和純度用NANODROP 2000c測(cè)定，濃度不夠的樣品需要重新進(jìn)行噬菌體的富集和濃縮。將提取的核酸取適量按產(chǎn)品說明書進(jìn)行核酸酶（DNase I、Mung-Bean Nuclease、RNase A）消化處理，制備0.8%的瓊脂糖凝膠，電泳（90 V、40 min）以驗(yàn)證其核酸類型，使用SYBR Green Ⅰ染料代替EB進(jìn)行核酸電泳并在紫外照射下觀察核酸和染料的結(jié)合色。使用多功能成像分析系統(tǒng)進(jìn)行曝光。

1.2.9 噬菌體基因組測(cè)定與分析 核酸提取后，由安諾優(yōu)達(dá)公司負(fù)責(zé)進(jìn)行基因組測(cè)定。采用Velvet組裝軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝；采用augustus軟件對(duì)組裝序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)；采用gapfilling進(jìn)行軟件補(bǔ)洞和sanger測(cè)序補(bǔ)洞；采用eggnog-mapper對(duì)編碼基因進(jìn)行COG和GO注釋；通過CGView Server繪制PSM6基因組圖譜；采用MCscanX軟件進(jìn)行近緣噬菌體基因組共線性分析并通過mauve軟件比對(duì)分析PSM6和其同源性最高的噬菌體；采用Blast和Interpro程序?qū)幋a基因做進(jìn)一步的功能預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離純化

通過對(duì)河水中的噬菌體進(jìn)行濃縮分離純化，雙層平板培養(yǎng)6-12 h可觀察到噬菌斑慢慢出現(xiàn)，然后變大變清晰，最終在腸炎沙門氏菌菌苔上出現(xiàn)透亮、大小均勻的噬菌斑，噬菌斑大小約1.5 mm-2.0 mm（圖1）。通過效價(jià)測(cè)定得到，所純化保存的噬菌體濾液濃度均大于1012PFU/mL。擴(kuò)增培養(yǎng)后的噬菌體穩(wěn)定性良好，放置4℃保存半年仍可以活化成功。

圖1 PSM6的噬菌斑Fig.1 Plaque of phage PSM6

2.2 噬菌體裂解譜的測(cè)定

通過點(diǎn)樣法測(cè)定噬菌體PSM6的裂解范圍，結(jié)果如表1所示，PSM6除了腸炎沙門氏菌之外，還可裂解鼠傷寒、徹斯特、倫敦、科瓦利斯、德爾卑等多種血清型沙門氏菌，表明該噬菌體的裂解譜較寬。同時(shí)，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PSM6可裂解大腸桿菌ATCC25922、DH5α、BL21，且對(duì)宋內(nèi)志賀氏菌CMCC（B）51592有較弱的裂解活性。

表1 噬菌體PSM6的裂解范圍Table 1 Host range of phages PSM6

2.3 噬菌體的電鏡觀察

經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后，可在透射電鏡下清晰地觀察到噬菌體PSM6由正二十面體的頭部、含有短的末端纖維的細(xì)長(zhǎng)尾部構(gòu)成，詳見圖 2，可見頭部直徑約為 72 nm，尾部長(zhǎng)度約為 122 nm，因此PSM6屬于有尾噬菌體目（Caudovirales）。

圖2 電鏡下PSM6的形態(tài)Fig.2 Morphology characterization of phage PSM6 under transmission electron microscopy

2.4 最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定

將噬菌體和宿主菌按照不同比例搖床培養(yǎng)3 h后，測(cè)定噬菌體效價(jià)。結(jié)果表明當(dāng)感染復(fù)數(shù)MOI=0.01時(shí)，產(chǎn)生的子代噬菌體量最多，詳見表 2，因此最佳感染復(fù)數(shù)為0.01。

表2 噬菌體PSM6的最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 2 Optimal multiplicity of infection（MOI）of phages PSM6

2.5 噬菌體的熱穩(wěn)定性

噬菌體在不同溫度的效價(jià)變化和存活情況不同，具體結(jié)果如圖3。在 40℃作用2 h，噬菌體PSM6維持原有活性，效價(jià)基本不變。在60℃作用2 h后，效價(jià)仍有107.4PFU/mL，存活率約25%；隨著溫度的升高，PSM6效價(jià)下降的速度越快。在80℃作用2 h，PSM6的效價(jià)最低，下降到106.2PFU/mL?？傮w上分析，PSM6的熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。

圖3 噬菌體PSM6的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermal stability of phages PSM6

2.6 噬菌體的pH穩(wěn)定性

PSM6在pH為5-10的范圍內(nèi)效價(jià)穩(wěn)定，活性較高，存活率大于80%；pH4時(shí)，效價(jià)下降明顯，存活率約11.3%；在pH2、3、11、12、13的極端環(huán)境中，噬菌體效價(jià)降低到低于檢出限（即存活率低于0.1%）（圖4）。

圖4 噬菌體PSM6的pH穩(wěn)定性Fig. 4 pH stability of phages PSM6

2.7 一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

根據(jù)PSM6的一步生長(zhǎng)曲線顯示（圖5）。噬菌體效價(jià)在0-20 min時(shí)，變化不大，這一時(shí)期為潛伏期；而后在20-80 min時(shí)，急劇增加，可推斷出這一時(shí)期為爆發(fā)期，爆發(fā)時(shí)間為60 min，爆發(fā)量為56 PFU/cell；之后曲線趨于平穩(wěn)，PSM6進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖5 噬菌體PSM6的一步生長(zhǎng)曲線Fig.5 The One-step growth curve of the phage PSM6

2.8 噬菌體的核酸類型

PSM6的核酸可被DNase I消化，而不能被Mung-Bean Nuclease消化和RNase A消化，此外結(jié)合了SYBR Green Ⅰ染料的核酸在紫外下顯示綠色，因而可判斷PSM6的核酸是雙鏈DNA（圖6）。

圖6 噬菌體PSM6的核酸類型判斷Fig.6 Nucleic acid type of phage PSM6

2.9 噬菌體基因組測(cè)定與分析

最終測(cè)得噬菌體PSM6的基因組大小為90 730 bp，G+C含量為39.57%，基因組圖譜如圖7。PSM6的基因組與沙門氏菌噬菌體vB_SPuM_SP116、大腸桿菌噬菌體vB_EcoM_AYO145A、志賀氏菌噬菌體Z31等6株腸桿菌科細(xì)菌噬菌體的基因組相似性較高，如表3，達(dá)92.55%-94.62%。采用MCscanX軟件對(duì)這6株噬菌體基因組進(jìn)行共線性分析（圖8），發(fā)現(xiàn)6個(gè)噬菌體基因組之間存在良好的基因組共線性關(guān)系。為了更細(xì)微的了解PSM6與其它噬菌體之間的基因組結(jié)構(gòu)差異，將PSM6與同源性最高的vB_SPuM_SP116噬菌體的基因組進(jìn)行比較分析（圖9），結(jié)果表明兩個(gè)基因組之間存在如插入和缺失等變異，相同顏色的矩形塊表示序列的共線區(qū)域，而部分區(qū)域長(zhǎng)度和位置存在差異。幾乎所有PSM6的基因均與來自肌尾噬菌體科（myoviridae）的噬菌體基因最為相似，結(jié)合電鏡觀察，因此判定噬菌體PSM6應(yīng)屬于肌尾噬菌體科。

圖9 PSM6和vB_SPuM_SP116的比較分析Fig.9 Comparative analysis of PSM6 and vB_SPuM_SP116

表3 噬菌體PSM6基因組和其近緣噬菌體的比較Table 3 Comparative analysis of PSM6 and its closely related phage

圖7 SM6的基因組圖譜Fig.7 Genomic organization of phage PSM6

圖8 PSM6和其近緣噬菌體的共線性比較分析Fig.8 Collinearity analysis of PSM6 and its closely related phage

預(yù)測(cè)PSM6基因組編碼133個(gè)蛋白，其中47個(gè)蛋白的功能預(yù)測(cè)見表4，主要屬于結(jié)構(gòu)蛋白、核酸復(fù)制調(diào)控蛋白、核酸組裝和細(xì)菌裂解蛋白。其余蛋白的功能未能預(yù)測(cè)，均為hypothetical protein?；蚪M中未發(fā)現(xiàn)抗生素耐藥基因及毒力因子基因，說明噬菌體PSM6是一種適合安全應(yīng)用的噬菌體。存在與裂解細(xì)菌相關(guān)的holin-lysin系統(tǒng)，包括2個(gè)裂解酶（lysin，也稱內(nèi)溶素，編號(hào)GENE17和GENE108）、2個(gè)穿孔素（holin，編號(hào)GENE10和GENE47）和2個(gè)破壞細(xì)菌外膜的裂解輔助蛋白spanins（o-spanin，編號(hào)GENE113和i-spanin，編號(hào)GENE111）。其中裂解酶GENE17與大腸桿菌噬菌體vB_EcoM_Shy、沙門氏菌噬菌體vB_SPuM_SP116和志賀氏菌噬菌體Z31等的裂解酶（GenBank accession number分別 是QNR52107、YP_009146288和QHB48992）有達(dá)94.2%-95.4%的序列相似性。裂解酶GENE108則與大腸桿菌噬菌體pinkbiff和skuden的推測(cè)裂解酶（GenBank accession number分別是QHR70074和QHR67794）分別有98.9%和97.8%的序列相似性。穿孔素GENE10與沙門氏菌噬菌體Mushroom的穿孔 素（GenBank accession number = YP_009600453）有95.7%的序列相似性。穿孔素GENE47與腸桿菌科細(xì)菌噬菌體vB_EcoM_IME338、沙門氏菌噬菌體BPS15Q2的穿孔素（GenBank accession number分別是AWD91365和YP_009324630）分別有高達(dá)100%和99.2%的序列相似性。但是目前這些相似性較高的裂解酶、穿孔素和spanins均未得到研究，其特性未清楚。

表4 噬菌體PSM6編碼蛋白功能預(yù)測(cè)Table 4 Prediction of PSM6 protein-coding regions

3 討論

噬菌體是自然界中物種最豐富和最具生物多樣性的生物實(shí)體，超過包括細(xì)菌在內(nèi)的其他物種的總和，約1031種，然而現(xiàn)公開分離鑒定信息的噬菌體僅10 000種左右［23］。同時(shí)，并非所有的噬菌體都能符合生物抗菌劑的標(biāo)準(zhǔn)，比如溫和噬菌體、不能感染目標(biāo)細(xì)菌的噬菌體、不能承受食品加工過程中的物理化學(xué)條件等［24］。因此，烈性噬菌體的分離鑒定及其生物特性研究和基因組分析，對(duì)挖掘噬菌體這一抗菌資源庫(kù)和了解其后續(xù)的開發(fā)應(yīng)用條件具有不可代替的作用。

分離出烈性噬菌體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于含有噬菌體環(huán)境樣品的采集、富集和及時(shí)純化。添加SM緩沖液和增加富集次數(shù)可以提高分離成功率［21］。同時(shí)，待噬菌體出斑，及時(shí)挑斑以確保噬菌體活性最強(qiáng)，雙層平板上培養(yǎng)時(shí)間過久的噬菌體可能失活。

腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌是人類感染病例中最常見的血清型［23］。近年來，多重耐藥的沙門氏菌［25］和其他非常見沙門氏菌血清型的食物中毒事件頻頻發(fā)生［26-27］，如多重耐藥鼠傷寒沙門氏菌DT104菌株在全球迅速進(jìn)化和傳播［28］。動(dòng)物類食品的污染是引發(fā)食物中毒的最常見原因［29-30］。長(zhǎng)春的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，93.75%的從豬肉或雞肉中分離出的沙門氏菌對(duì)一種或多種抗生素耐藥［31］。全球報(bào)告的沙門氏菌血清型約超過2 500種，其中確定以雞為傳播媒介的約2 000種血清型［32］。噬菌體的特異性對(duì)于種間而言意味著不干擾正常菌群，然而在種內(nèi)特異性過強(qiáng)則代表其裂解譜過窄，也許不能作為所需宿主的生物防治劑［33］。通常，低宿主密度的環(huán)境樣品所分離出的噬菌體裂解譜比高宿主密度的樣品中所分離的更寬［34-35］。為了得到應(yīng)用范圍更廣的噬菌體，本研究以腸炎沙門氏菌為宿主，從低宿主密度的河水中進(jìn)行采樣分離。同時(shí)，采用點(diǎn)樣法研究噬菌體對(duì)從禽畜肉類分離出的沙門氏菌的裂解能力，結(jié)果表明PSM6可裂解腸炎、鼠傷寒、徹斯特、倫敦、科瓦利斯、德爾卑等多種血清型沙門氏菌，裂解譜較寬，具備成為抗生素代替物的潛力。

噬菌體的活性易受多種理化條件的影響，摸索和評(píng)估其在體外的適應(yīng)條件是后期生物防治應(yīng)用的基礎(chǔ)［36-37］。PSM6的pH效價(jià)穩(wěn)定范圍與現(xiàn)已分離的大部分噬菌體相似［38-39］。目前報(bào)道的大多數(shù)噬菌體不耐高溫，如在60℃處理100 min存活基本不超過1%［40-42］。而PSM6在60℃處理120 min后，存活超過25%，這意味著PSM6更耐高溫，熱穩(wěn)定性更強(qiáng)。同時(shí)，PSM6在沙門氏菌噬菌體中，屬于潛伏期短，爆發(fā)量大和最佳感染復(fù)數(shù)小的部分噬菌體［43-45］，這表明PSM6的繁殖活性理想，可在短時(shí)間內(nèi)殺滅更多的沙門氏菌。

根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)（ICTV）的最新分類和命名及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［46-48］，現(xiàn)大多數(shù)已分離噬菌體都是有尾的，且核酸大都為雙鏈DNA（dsDNA），且目前發(fā)現(xiàn)的基因組類型為單鏈DNA的噬菌體只有微小噬菌體科（Microviridae）和絲桿狀噬菌體科（Inoviridae）?；陔婄R的形態(tài)分析，PSM6屬于有尾噬菌體，因此PSM6的核酸類型最有可能是dsDNA。Mung-Bean Nuclease是一種常用于消化單鏈DNA或RNA的核酸酶，但過量使用亦可降解雙鏈DNA、RNA或者DNA-RNA雜交體。為了避免Mung-Bean Nuclease的使用過量，本研究使用了SYBR GreenⅠ染料進(jìn)行核酸電泳，通過這種染料在紫外透射下與DNA單雙鏈的結(jié)合顏色不同，減少了判斷失誤的可能性。

烈性噬菌體通過產(chǎn)生裂解酶溶解細(xì)菌細(xì)胞壁而入侵宿主細(xì)胞。通過測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，PSM6具有裂解酶，而不含整合酶、轉(zhuǎn)座酶、抗生素抗性基因和毒力因子等相關(guān)基因，這支持了PSM6屬于可安全應(yīng)用的烈性噬菌體范圍。目前發(fā)現(xiàn)的噬菌體多數(shù)是通過穿孔素-裂解酶（holin-lysin）系統(tǒng)來裂解細(xì)菌，穿孔素參與宿主細(xì)胞裂解的觸發(fā)過程，穿孔素和裂解酶兩者協(xié)同作用于細(xì)胞壁并裂解細(xì)菌［49］。在這些噬菌體基因組中，穿孔素基因通常位于裂解酶基因的上游，其編碼蛋白含有跨膜區(qū)［50］。通過基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，噬菌體PSM6基因組中存在各兩個(gè)裂解酶和穿孔素基因，其中穿孔素GENE10正位于裂解酶GENE17基因的臨近上游。Interpro在線程序分析發(fā)現(xiàn)穿孔素GENE10也擁有跨膜區(qū)。但也有一些噬菌體的穿孔素基因不在裂解酶基因上游［51］，PSM6的另外一個(gè)穿孔素GENE47的基因就并不臨近裂解酶基因。目前除了噬菌體本身，噬菌體產(chǎn)生的裂解酶也正趨于成為噬菌體應(yīng)用于細(xì)菌感染治療的一種有價(jià)值的形式［52］。但目前有關(guān)噬菌體裂解酶及其作用機(jī)制和結(jié)構(gòu)的研究還不夠豐富，比如與本研究噬菌體PSM6裂解酶序列相似性較高的這些裂解酶就還未得到特定研究。因此，未來需要加強(qiáng)這方面的深入研究。

隨著沙門氏菌感染病例頻發(fā)和細(xì)菌耐藥問題的日益加重，噬菌體作為一種新型抗菌劑受到了越來越廣泛的關(guān)注［17］。烈性噬菌體在致病菌的生物防治中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如自然界中廣泛存在、可自我繁殖、環(huán)境友好等［37，53］。本研究從環(huán)境樣品中分離出一株具有較寬裂解譜的沙門氏菌噬菌體，它擁有潛伏期短、爆發(fā)量大、pH和溫度穩(wěn)定性佳的優(yōu)點(diǎn)，基因組中也沒有發(fā)現(xiàn)毒力因子相關(guān)基因和抗生素抗性基因，因此具有較好的應(yīng)用于生物防治沙門氏菌的潛力。

4 結(jié)論

本研究分離并鑒定了一株新的肌尾噬菌體科沙門氏菌裂性噬菌體PSM6，可裂解鼠傷寒、徹斯特、倫敦、科瓦利斯、德爾卑等多種血清型沙門氏菌、部分大腸桿菌和宋內(nèi)志賀氏菌，繁殖活性強(qiáng)，pH穩(wěn)定良好，較耐高溫。PSM6基因組含有裂解細(xì)菌的holin-lysin系統(tǒng)，未發(fā)現(xiàn)毒力因子相關(guān)基因和抗生素抗性基因。