游玲 周榮清 譚壹 王濤 喬宗偉 趙東

（1. 宜賓學院 固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，宜賓 644000；2. 五糧液股份有限公司，宜賓 644000；3. 四川大學輕工科學與工程學院，成都 610065）

Kazachstania屬酵母最早由Zubkova［1］1971年提出，其細胞呈圓形或橢圓形，多邊出芽，可形成假菌絲，菌落光滑白色到棕褐色，包括20個種，模式種為K. viticola，Vaughan Martini等［2］于2011年將Kazachstania屬擴展到32種，包括5個分支［3］，K. exiga、K. turicensis、K. bulderi、K. barnettii及K.humilis共同構成該屬的一個重要分支［4］。已有研究表明，Kazachstania屬酵母廣泛分布于酸面團［5-6］、泡 菜［7-8］、青貯飼料［9］等植物乳酸發(fā)酵過程，同化乳酸，并水解葡萄糖醛糖苷作為異型發(fā)酵乳酸菌的代謝底物，促進其利用果糖產乙酸［10］，K. turicensis還可通過調節(jié)腸道皮膚軸改善特應性皮炎［11］，呈現(xiàn)特殊益生作用，具有潛在商業(yè)應用前景。

濃香型白酒糟醅的乳酸含量通常在10-20 g/kg之 間，最 高 可 達100 g/kg以 上［12］，可 能 選擇富集Kazachstania等耐乳酸酵母，但2017年之前未見Kazachstania屬酵母參與濃香型白酒發(fā)酵的相關報道［13］，2018年，王鵬等［14］采用基于ITS序列的高通量測序技術發(fā)現(xiàn)江蘇某濃香型白酒糟醅中的優(yōu)勢酵母主要是Saccharomyces、Candida、Saccharomycopsis及Pichia，其 中 并 未 包 括Kazachstania屬酵母，但2019年，楊建剛等［15］應用單鏈構象多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)K. exigua是瀘州老窖旺盛發(fā)酵階段中的4種優(yōu)勢酵母種之一，張霞等［16］在五糧液發(fā)酵糟醅中也陸續(xù)分離到多株K. humilis酵母菌株。但迄今為止，關于Kazachstania屬酵母在濃香型白酒發(fā)酵糟醅中的分布及產乙醇、風味物質情況仍不清楚。

因此，本研究針對五糧液糟醅中的Kazachstania屬酵母研究其分布及主要發(fā)酵功能，不僅對解析濃香型白酒發(fā)酵機制具有重要意義，也有助于解析該酵母在泡菜、青貯飼料等乳酸發(fā)酵過程中的作用機理，進而開發(fā)新的調控策略，改善傳統(tǒng)發(fā)酵產品風味。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 理化分析所用試劑來自成都科龍試劑廠，色譜標樣來自sigma試劑公司，酵母DNA提取采用E.Z.N.A Yeast DNA試劑盒（OMEGA，US），糟醅DNA提取采用Fast DNATM Spin Kit for Soil試劑盒（MP Bio，USA）。

1.1.2 培養(yǎng)基 采用WL培養(yǎng)基（青島海博）及乳酸YPD培養(yǎng)基（L-YPD，青島海博的YPD培養(yǎng)基每升添加5 mL乳酸）分離酵母，采用乳酸YPD培養(yǎng)基對糟醅中的酵母菌進行平板涂布計數(shù)。

1.2 方法

1.2.1 取樣 五糧液生產車間內，選取窖齡8年且正常生產的3口窖池，采用文獻［16］的取樣及DNA提取方法，分別取發(fā)酵0、4、12、18、24、30、40、60和68 d的上、下層糟醅樣品分別混勻，用于酵母平板計數(shù)、菌株分離及DNA提取。

1.2.2 Kazachstania屬酵母豐度檢測 15 g樣品、2 g直徑為1 mm的無菌玻璃珠、15 mL緩沖液在50 mL離心管中劇烈混合15 min，2 000 r/min離心5 min，然后轉移上清液到另一個50 mL離心管中，無菌水洗滌并沉淀，重復兩次，合并3次上清液，14 000 r/min離心10 min。采用Fast DNATM Spin Kit for Soil試劑盒根據使用說明提取沉淀總DNA，采用引物NL1（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）和NL4（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）擴增D1/D2特征序列，將通過瓊脂糖凝膠電泳檢查合格的PCR產物送美吉測序公司（上海）測序。將獲得的所有OTU與酵母模式菌株的相應序列進行比對，計算與Kazachstania屬酵母分類單位相同的OTU序列數(shù)量占總OTU數(shù)量的比例，得到Kazachstania屬酵母在酵母群體中的豐度。

1.2.3 酵母計數(shù)及菌株分離鑒定 酵母計數(shù)：樣品經無菌水連續(xù)稀釋后，涂布于添加0.1 g/L氨芐青霉素的乳酸YPD培養(yǎng)基及WL培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h，選擇具有30-100個菌落的L-YPD平板計數(shù)，所得數(shù)量乘以Kazachstania屬酵母豐度即為Kazachstania屬酵母數(shù)量，以此繪制其在發(fā)酵過程中的生長曲線。

菌株鑒定：分別挑取WL及L-YPD培養(yǎng)基上的酵母單菌落，經3次純化后接種至L-YPD瓊脂培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h，挑取新鮮菌落至1.5 mL EP管，按照E.Z.N.A Yeast DNA試劑盒說明書提取菌株DNA，使用引物NL1和NL4擴增其26S rDNA特征序列，將通過瓊脂糖凝膠電泳檢查合格的PCR產物送派森諾公司（上海）測序，所得序列提交至GenBank進行BLASTN（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）比對，將與模式菌株26S rDNA序列相似性大于99%的菌株鑒定為該種。

1.2.4 固態(tài)發(fā)酵實驗 發(fā)酵糟醅制備：以多次煮沸清洗并滅菌的糠殼基質作為固態(tài)載體，吸附4倍重量的五糧粉（按生產工藝配比，即28%高粱+18% 糯米+22%大米+16%小麥+8%玉米），調節(jié)水分含量到55%，滅菌后接種0.5%根霉，再滿瓶分裝到已滅菌的250 mL組培瓶中，每瓶裝入糟醅重量為150±12 g。

發(fā)酵：酵母菌株在乳酸YPD培養(yǎng)基中28℃活化培養(yǎng)16-24 h至OD560nm在0.5-0.6之間，再接種10 mL酵母培養(yǎng)液至發(fā)酵糟醅中，25℃發(fā)酵20 d，發(fā)酵結束時檢測糟醅中乙醇及風味物質含量，每個處理設3個重復，結果取其平均值。

1.2.5 糟醅成分分析 取100 g糟醅，加入200 mL蒸餾水，常壓蒸餾，收集餾出液至100 mL，參考文獻［17］，采用氣相色譜法（安捷倫公司，7890A，配FID檢測器）通過LZP930毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.50 μm）測定糟醅餾出液中的乙醇及主要風味物質含量。

部分菌株采用頂空固相萃取法檢測其固態(tài)發(fā)酵產非極性風味物質的相對含量：準確稱取1.5 g糟醅及1 g氯化鈉于20 mL頂空瓶中，再加入4 mL超純水和25 μL 4-辛醇（內標）混勻，采用SUPELCO 57328萃取頭70-80℃萃取10-15 min，平衡1 min。GC-MS條件：進樣口和檢測器溫度均為250℃，載氣為He，流速1.5 mL/min，起始溫度40℃，保持3 min，然后以3℃/min的速率升溫至230℃，保持15 min。電子轟擊能量為70 eV，離子源溫度為230℃，四級桿溫度150℃。檢測結果以通過內標校正后的峰面積體現(xiàn)。

采用直接滴定法測定糟醅中還原糖含量［18］，采用酸堿滴定法測定糟醅酸度［19］，采用常溫烘干法測定糟醅水分［20］。

1.2.6 數(shù)據處理 采用mega 6.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育圖，采用SPSS19.0軟件進行顯著性分析，采用simca-p軟件進行主成分分析。

2 結果

2.1 Kazachstania屬酵母在糟醅中的分布特征

在濃香型白酒糟醅中共檢測到屬于K. exigua的52個OTU及屬于K. humilis的7個OTU，這兩個種在發(fā)酵過程中的豐度變化如圖1所示，可以看出，在濃香型白酒4-18 d的主發(fā)酵期內，K. exigua在上下層糟醅酵母群體中的豐度一直維持在50%以上，是絕對優(yōu)勢種；K. humilis在上層糟醅中的豐度明顯高于下層糟醅，這可能是由于上層糟醅中的溶氧更為充足，推測K. humilis對缺氧環(huán)境的耐受性相對較差。

圖1 Kazachstania屬酵母在濃香型白酒發(fā)酵糟醅中的豐度變化Fig. 1 Relative abundance of Kazachstania yeast during the fermentation of strong flavor Baijiu

圖2 展示了糟醅發(fā)酵過程中Kazachstania屬酵母數(shù)量變化趨勢，可以看出，發(fā)酵4 d時，K. exigua酵母的數(shù)量就已超過啟動發(fā)酵所需的最低酵母數(shù)量（1×105CFU/g）［21］，在4-18 d的主發(fā)酵期內，其數(shù)量維持在5×105CFU/g以上，高峰期時其數(shù)量在2×106CFU/g以上，是完成濃香型白酒主發(fā)酵的主要酵母，而K. humilis酵母僅在8-18 d期間的上層糟醅中數(shù)量超過1×105CFU/g，表明其在濃香型白酒主發(fā)酵過程中起輔助作用。并且，這兩種酵母的數(shù)量在24 d后均迅速降至1×105CFU/g以下，表明Kazachstania屬酵母主要在0-24 d內影響乙醇及風味物質的生成。

圖2 Kazachstania屬酵母在濃香型白酒發(fā)酵糟醅中的數(shù)量變化Fig. 2 Number of Kazachstania yeast during the fermentation of strong flavor Baijiu

2.2 Kazachstania屬酵母菌株的分離鑒定

從WL及乳酸YPD培養(yǎng)基上共分離到306株菌落大小、顏色、質地、氣味及細胞形態(tài)等方面不完全相同的酵母菌株，其中93株的26S rDNA序列與Kazachstania屬酵母模式菌株對應序列相似性大于99%，包括63株未在高通量測序中檢測到的K. turicensis酵母菌株及30株K. humilis酵母（圖3）。未能分離到在高通量測序中檢測到的K. exigua酵母，但高通量測序結果顯示，豐度最高、與K. exigua標準菌株（GenBank 序列號MK394139.1）相似度達到100%、長度為272 bp的代表OTU有248 bp與鑒定為K. turicensis的純培養(yǎng)酵母菌株的26S rDNA序列部分序列完全一樣，二者很可能屬于同種酵母，因此，綜合高通量測序及純培養(yǎng)研究結果，推測濃香型白酒糟醅中的優(yōu)勢酵母可能是K. turicensis酵母。

圖3 Kazachstania屬酵母純培養(yǎng)菌株基于26S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of Kazachstania isolates based on 26S rDNA sequence

并且，濃香型白酒糟醅中的Kazachstania屬酵母純培養(yǎng)菌株呈現(xiàn)出豐富的形態(tài)多樣性及26S rDNA序列多樣性，63株K. turicensis酵母菌株中的19株26S rDNA序列完全一樣，44株26S rDNA序列存在0.5%以內的差異，30株K. humilis酵母菌株包括3種各不相同的26S rDNA序列，1株（LA4-7）與K. humilis CBS：5658（KY106507.1）的相似度最高，但也僅有98.69%，有待進一步確認其分類地位。

2.3 Kazachstania屬酵母對糟醅理化性質的影響

分別接種63株K. turicensis酵母及30株K. humilis酵母純培養(yǎng)菌株到模擬糟醅中研究其固態(tài)發(fā)酵特征，從表1可以看出，K. turicensis、K. humilis、S. cerevisiae對糟醅主要理化指標的影響存在種一級的顯著差異。從對還原糖的利用來看，接種K. humilis的糟醅在發(fā)酵結束后水分顯著高于其他兩個種屬，殘?zhí)呛匡@著低于其他兩個種屬，表明糟醅內的代謝特別是分解代謝更加旺盛，K. humilis酵母對糟醅中還原糖的利用更加充分，但其發(fā)酵過程CO2損失導致的失重并不比其他兩個種屬高，表明其旺盛的分解代謝不一定與產乙醇有關，而接種該酵母的糟醅酸度也顯著低于其他兩個種屬，表明其代謝與中間代謝產物有機酸的生成關系也較小，推測該酵母可能產生較多的其他發(fā)酵副產物。

表1 Kazachstania屬酵母菌株對糟醅主要理化指標的影響Table 1 Effects of Kazachstania yeast strains on physicochemical indexes of fermented grains

酵母對糖的利用也存在菌株水平的差異。以K. turicensis酵母為例，63株K. turicensis酵母中的27株對糖的利用率大于80%，有4株酵母菌對糖的利用率高達90%，其余39株酵母菌對糖的利用率在65%-80%，總體上盡管60%的K. turicensis酵母菌株糖利用率不高，但仍有1株K. turicensis酵母菌株可使發(fā)酵后糟醅殘?zhí)呛拷抵?.7%，水分64.7%，發(fā)酵失重達27.6 g，遠高于其他K. turicensis酵母菌株，體現(xiàn)出旺盛代謝特征，此類K. turicensis酵母菌株可能是提高糟醅原料利用率的主力。

從對糟醅酸度的影響來看，與K. humilis 相比，K. turicensis在發(fā)酵過程中產生更多有機酸，這些有機酸一方面可增加糟醅酸度抑制發(fā)酵；另一方面產生的有機酸也是重要風味物質以及合成酯類物質的前體。

2.4 Kazachstania屬酵母菌株產乙醇特征

從圖4可以看出，Kazachstania屬酵母固態(tài)發(fā)酵產乙醇能力存在菌株水平上的明顯差異，K. turicensis酵母菌株固態(tài)發(fā)酵糧食的平均乙醇產量為4.94 mL/100 g，其中73%的菌株產乙醇量在3-7 mL/100 g，38%的菌株產乙醇量在5-7 mL/100 g，最高產量為8.95 mL/100 g；30株菌K. humilis酵母菌株的平均乙醇產量為5.67 mL/100 g，高于K. turicensis，其中33%的K. humilis菌株產乙醇量在5-7 mL/100 g之間，4株菌的乙醇產量超過9 mL/100 g，1株菌的乙醇產量高達11.11 mL/100 g。總體上，考慮到濃香型白酒糟醅中的乙醇生成量一般在5-6 mL/100 g［22］，Kazachstania屬酵母足以滿足濃香型白酒發(fā)酵產乙醇的要求，分離到的多株固態(tài)發(fā)酵高產乙醇菌株具有廣泛的應用價值。

圖4 Kazachstania屬酵母菌株固態(tài)發(fā)酵產乙醇情況Fig. 4 Ethanol production of Kazachstania strains in solid state fermentation

2.5 Kazachstania屬酵母產風味物質特征

從表2可以看出，Kazachstania屬酵母產風味物質總量遠高于對照S. cerevisiae，K. turicensis酵母主要產異戊醇、乙酸異戊酯、糠醇、β-苯乙醇等風味物質，63株K. turicensis酵母均可產乙酸異戊酯及β-苯乙醇，且賦予糟醅特殊的花果香氣的多株K. turicensis酵母菌株均高產乙酸異戊酯、β-苯乙醇等風味物質，1株K. turicensis酵母產β-苯乙醇量高達1 397 mg/kg，高于已有報道的所有酵母菌株，可能具有特殊應用價值。僅有3株K. turicensis酵母產乙酸乙酯，1株菌的乙酸乙酯產量達10.3 g/kg，6株產乳酸乙酯，但產量不超過2.24 mg/kg。

表2 Kazachstania屬酵母在固態(tài)糟醅中的部分風味物質Table 2 Some flavor compounds of Kazachstania yeast in solid fermented grains

K. humilis菌株在固態(tài)發(fā)酵糟醅中產風味物質情況與K. turicensis酵母類似，但其異戊醇、糠醇、質-苯乙醇產量顯著高于K. turicensis酵母，30株K. humilis酵母菌株的β-苯乙醇平均產量為558.3 mg/kg，比K. turicensis酵母高66.7%，而平均乙酸產量僅相當于K. turicensis酵母的1/3左右，表明該酵母可在不增加糟醅酸度的同時，提高糟醅中呈花果香風味特征的物質的含量。

進一步地，采用氣質聯(lián)用色譜（GC-MS）通過頂空固相萃取法（SPME）分析26株K. turicensis酵母、30株K. humilis酵母菌株及3株S. cerevisiae酵母菌株發(fā)酵后的糟醅，發(fā)現(xiàn)Kazachstania屬酵母可產47種弱極性風味物質，但從圖5（1株K. humilis酵母菌株距離所有菌株均較遠，未包括在圖中）可以看出，基于47種風味物質含量差異的主成分分析無法區(qū)分K. turicensis及K. humilis酵母，表明K. turicensis及K. humilis酵母產風味物質存在菌株水平的差異，但K. turicensis及K. humilis酵母明顯區(qū)別于僅能產18種風味物質，且產量也較低的S. cerevisiae酵母。

圖5 基于3種酵母產47種風味物質含量差異的主成分分析圖Fig. 5 Principal component analysis based on the content difference of 47 flavor compounds produced by three yeast species

從風味物質種類來看，K. turicensis及K. humilis所產風味物質主要有異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、苯甲醛、苯酚、己酸乙酯、苯乙醛、2-甲氧基酚、β-苯乙醇、甘菊藍、丁二酸雙乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、-亞乙基苯乙醛、癸酸乙酯、石竹烯、十二酸乙酯、石竹烯、十四酸乙酯、9-十六碳烯酸、十六酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、十八酸乙酯、9，12-十八二烯酸丙酯、8-十六炔等26種，所有菌株均可產較多的藍-苯乙醇及多株高級脂肪酸乙酯，賦予白酒花果香風味特征［23］。1株K. turicensis菌株及1株K. humilis菌株產2-甲氧基-4-乙烯基酚，2株K. turicensis菌株產角鯊烯，可賦予白酒特殊風味及保健價值［24-25］，具有很好的應用價值。

從風味物質產量來看，K. turicensis酵母的揮發(fā)性產物中，平均相對含量大于1%的風味物質包括β-苯乙醇（30.54%）、丁二酸二乙酯（2.45%）、辛酸乙酯（1.25%）、乙酸苯乙酯（1.04%）、十四酸乙酯（3.05%）、十六酸乙酯（23.70%）、亞油酸乙酯（8.03%）、油酸乙酯（15.86%）。K. humilis酵母揮發(fā)性產物中平均相對含量大于1%的風味物質包括β-苯乙醇（31.03%）、丁二酸二乙酯（1.83%）、乙酸苯乙酯（1.99%）、十四酸乙酯（2.09%）、9-十六碳烯酸乙酯（2.10%）、十六酸乙酯（22.92%）、亞油酸乙酯（8.49%）及油酸乙酯（14.52%）。

從表3可以看出，K. humilis酵母產風味物質的總量（平均總峰面積）高于K. turicensis、S. cerevisiae，但除K. humilis酵母β-苯乙醇產量顯著高于K. turicensis，C10以上高級脂肪酸乙酯產量顯著低于K. turicensis外，統(tǒng)計分析表明三者產醛類物質、萜烯及酯類物質或風味物質總量均沒有顯著差異。

表3 Kazachstania屬酵母菌株固態(tài)糟醅產主要風味物質情況Table 3 Flavor substances produced by Kazachstania yeast strains in solid state fermented grains

另外，在氣相色譜中檢測到的大量乙酸異戊酯在GC-MS中檢測到的相對含量卻很低，這主要是二者使用的色譜柱極性不同，對樣品中組分的選擇性存在較大差異，并且，頂空固相微萃?。⊿PME）所用萃取頭對不同成分的選擇吸附也會造成部分組分歧視。

3 討論

從酵母區(qū)系研究方法來看，本研究發(fā)現(xiàn)K. turicensis及K. humilis是濃香型白酒糟醅中的優(yōu)勢酵母，但已有研究中，基于ITS序列的高通量測序未檢測到Kazachstania屬，而是主要檢測到Saccharomyces、Candida、Saccharomycopsis、Pichia等酵母，可能是由于ITS序列局限性，使部分Kazachstania屬序列被誤識別為Saccharomyces或Candida。因此，我們認為，針對乳酸等特殊環(huán)境中的酵母區(qū)系研究，基于26S rDNA部分序列的高通量測序法可很好地排除絲狀真菌序列的干擾，結合基于ITS序列的高通量測序方法，并輔以純培養(yǎng)菌株的分離鑒定，可更準確地反應發(fā)酵體系中的酵母區(qū)系構成。

K. turicensis、K. humilis在旺盛發(fā)酵期的濃香型白酒糟醅的酵母群體中具有如此高的豐度，這意味著在這一乙醇發(fā)酵、乳酸發(fā)酵共存的固態(tài)發(fā)酵體系中，其作為乳酸發(fā)酵微環(huán)境的標志性酵母種屬，可能通過產乙醇、風味物質對濃香型白酒發(fā)酵起著決定性的影響，且Kazachstania屬內酵母菌株的代謝差異主要是在菌株水平，而不是在種一級水平，但β-苯乙醇、C10以上脂肪酸乙酯、乙酸等代謝產物仍在種一級水平體現(xiàn)出顯著差異，表明與這些物質相關的代謝途徑相對較為穩(wěn)定，不易因菌株變異而受到影響，因此本研究篩選到的一些高產β-苯乙醇或C10以上脂肪酸乙酯的菌株也可能具有較為穩(wěn)定的生產特性，可用于改善白酒風味。另外，在濃香型白酒這樣的自然混菌發(fā)酵體系中，Kazachstania屬還可通過與其他混菌發(fā)酵微生物的相互作用影響濃香型白酒發(fā)酵，如張霞等［16］的研究發(fā)現(xiàn)K. humilis可抑制L. acetotolerans產乳酸，L. acetotolerans可促進K. humilis 產乙醇，表明該屬酵母可通過與乳酸菌之間的相互作用來影響濃香型白酒發(fā)酵進程，但乳酸發(fā)酵環(huán)境中，Kazachstania屬酵母特別是K. turicensis與乳酸菌或其他微生物之間還存在哪些共代謝關系？這些共代謝對發(fā)酵產品風味品質有什么影響？還有待進一步研究。

4 結論

本研究采用基于26S rDNA序列的高通量測序法及培養(yǎng)法確證了Kazachstania屬酵母是濃香型白酒糟醅微環(huán)境的標志性酵母屬之一，主要包括K. turicensis及K. humilis兩個優(yōu)勢種，其中K. turicensis是完成濃香型白酒主發(fā)酵的主要酵母，且K. turicensis及K. humilis對濃香型白酒產量及風味具有菌株水平的重要影響。