鄭漫佳，韓素芳，程詩明，何文澤，樊佳寧，楊海蕓

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300； 2.浙江省林科院，浙江 杭州 310023)

三葉青學(xué)名三葉崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)，別名三葉扁藤、金線吊葫蘆等，為葡萄科崖爬藤屬植物，是我國特有中草藥[1-6]。三葉青自然生長于氣溫在18 ℃左右、海拔300～1300 m的山坡灌叢、山谷、林下巖石縫等濕度較大的地方。三葉青具有抗腫瘤、抗病毒、鎮(zhèn)痛與解熱、保肝護(hù)肝等作用，且毒副作用小，越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[1，7]。由于三葉青對生長環(huán)境極其嚴(yán)苛，加上自然環(huán)境的惡化以及人為的無序采挖，野生三葉青資源瀕臨滅絕[4-6，8]。三葉青種苗需求在逐年增加，通過組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖，對母株破壞少，少量微型莖段作為外植體即可在短期內(nèi)獲得大量整齊一致的種苗。徐剛等[9]采用三葉青帶芽的莖段分化出叢生芽，月增殖率可達(dá)3～5倍；鐘毓倩[10]以莖段腋芽為外植體誘導(dǎo)不定芽。姜維梅等[11]以完整的腋芽為培養(yǎng)材料；吳浩等[6]以不帶腋芽莖段為培養(yǎng)材料，通過誘導(dǎo)愈傷組織，再脫分化產(chǎn)生不定芽，這些研究外植體選擇不同，外植體再生的方式也不盡相同，目前關(guān)于三葉青組織培養(yǎng)繁育技術(shù)體系尚需完善。徐琳煜等[12]研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)光、高溫、低濕等環(huán)境條件使三葉青光合活躍度下降，對其生長產(chǎn)生脅迫；并且三葉青的葉綠素?zé)晒忭憫?yīng)受到光照強(qiáng)度的影響[13]，關(guān)于組培苗的光合特性的研究還尚未見報(bào)道。因此，本研究旨在找到三葉青組培苗的最適培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的最佳濃度配比，在兼顧經(jīng)濟(jì)成本的同時(shí)，建立三葉青組織培養(yǎng)高效快繁技術(shù)體系，以提高三葉青種苗的質(zhì)量與繁殖效率，為大量種苗生產(chǎn)、進(jìn)一步深入的科學(xué)研究等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以浙江省林科院和浙江農(nóng)林大學(xué)溫室內(nèi)生長健壯的3年生三葉青盆栽苗為試材，截取枝條中部的莖段為外植體，每個(gè)莖段帶1～3個(gè)節(jié)，75%酒精表面消毒30 s，0.5% NaClO浸泡8 min，再無菌水沖洗5次，后接種到MS培養(yǎng)基中，獲得無菌無根苗作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

選取生長良好的無菌無根苗，切取側(cè)芽莖段，每段1個(gè)節(jié)，豎直插入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基分別以MS為基本培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)除外)，分別添加不同種類與組合的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，每個(gè)處理15瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件為：光強(qiáng)2400 lx，光周期 16/8 h，溫度(25±2) ℃。

1.2.1 BA與NAA組合對三葉青側(cè)芽繁殖的影響 設(shè)2個(gè)因素，其中BA分別為0、0.01、0.05、0.1、0.5 mg·L-1，NAA分別為0、0.01、0.1 mg·L-1，完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共15個(gè)處理。

1.2.2 不同KT與NAA組合對三葉青側(cè)芽繁殖的影響 設(shè)2個(gè)因素，其中KT分別為0、0.01、0.05、0.1、0.5 mg·L-1，NAA分別為0、0.01 mg·L-1，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，共10個(gè)處理。

1.2.3 不同凝固劑對三葉青無菌苗生長的影響 添加不同濃度的瓊脂粉(4、6、8 g)和水晶洋菜(Gelrite，1、2、3 g)作為凝固劑，單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共6個(gè)處理。

1.2.4 不同基本培養(yǎng)基對三葉青生長的影響 設(shè)置MS、1/2MS、1/3MS、WPM 4種基本培養(yǎng)基，添加BA 0.05 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1(有、無)，完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共8個(gè)處理。

1.2.5 快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線和820 nm光吸收曲線測定 無菌苗在試管內(nèi)生根后(簡稱試管苗)，經(jīng)過7d的馴化后移栽到基質(zhì)為泥炭、珍珠巖和蛭石(1∶1∶1)混合的營養(yǎng)缽中栽培，置于浙江農(nóng)林大學(xué)智能溫室中精細(xì)管理。為了鑒定無菌試管苗移栽后生長能力，無菌苗移栽的同時(shí)也采用傳統(tǒng)的方法直接野外截取莖段扦插繁殖三葉青小苗。組培苗移栽到營養(yǎng)缽中生長90 d的小苗稱為當(dāng)年生組培苗(A)；組培苗移栽至營養(yǎng)缽中生長450 d的稱為翌年生組培苗(B)；營養(yǎng)缽中生長90 d的扦插苗稱為扦插苗(C)；在溫室苗床下遮蔭生長的當(dāng)年生組培苗稱為遮蔭組培苗(D)。詳見表1。

分別選取A、B、C、D苗各6盆，按照任麗麗[14]的方法，利用植物效率分析儀M-PEA(Hansatech，英國)測定快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線(OJIP曲線)和820 nm光吸收曲線，測定前葉片需暗適應(yīng)15 min。OJIP曲線由5000 μmol m-2s-1的紅光誘導(dǎo)，測定時(shí)間為2 s，記錄的初始速率為每秒105個(gè)數(shù)據(jù)。按照Schansker Gert[15]的方法，將OJIP曲線標(biāo)準(zhǔn)化。820 nm光吸收曲線由250 μmol·m-2·s-1的遠(yuǎn)紅光光誘導(dǎo)，記錄時(shí)間為1 s。

表1 試驗(yàn)材料分組情況

1.3 數(shù)據(jù)分析

各處理試管苗生長30 d后，調(diào)查統(tǒng)計(jì)芽增殖系數(shù)、平均芽長、平均根數(shù)、平均根長等。芽增殖系數(shù)=(芽總數(shù)-接種芽數(shù))/每管接種芽數(shù)；平均芽長、根數(shù)、根長為平均每個(gè)外植體新生的芽的長度、主根的長度和總根數(shù)。

采用Excel 2019進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理、計(jì)算，然后采用Origin 8.5做圖。運(yùn)用SPSS 22進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，方差分析采用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 BA與NAA對三葉青試管苗生長的影響

圖1 不同BA濃度側(cè)芽生長情況

由表2可知，單獨(dú)添加BA時(shí)，隨著濃度的增加，側(cè)芽增殖系數(shù)逐漸增大，平均芽長變小，平均根數(shù)減少，根長增加，葉片顏色越來越黃(圖1)，當(dāng)添加BA 0.5 mg·L-1時(shí)側(cè)芽增殖系數(shù)最大，達(dá)8.47。添加NAA后，隨著BA濃度增加，側(cè)芽增殖系數(shù)依然逐漸增加，芽長和根長卻無顯著差異；添加NAA 0.01 mg·L-1時(shí)，根數(shù)逐漸減少，表明組合中低濃度的NAA對根分化與不添加趨勢一致，而NAA 0.1 mg·L-1時(shí)，平均芽長、根數(shù)、根長，隨著BA濃度變化，差異不顯著。因此，BA濃度增高有利于側(cè)芽增殖。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)BA大于1 mg·L-1時(shí)，不定芽分化很多，成簇生狀難以計(jì)數(shù)，且芽玻璃化嚴(yán)重。因此，隨著BA濃度的增加，三葉青芽增殖系數(shù)相應(yīng)增大，且當(dāng)添加BA 0.5 mg·L-1時(shí)，三葉青側(cè)芽增殖顯著高于其它濃度組合。不添加NAA，試管苗也能生根，添加NAA 0～0.01 mg·L-1時(shí)，生根受BA影響；當(dāng)NAA達(dá)0.1 mg·L-1時(shí)，生根情況受NAA影響。

表2 不同BA與NAA組合對三葉青側(cè)芽繁殖的影響

2.2 不同濃度的KT與NAA組合對三葉青試管苗生長的影響

由表3可知，單獨(dú)添加不同濃度的KT時(shí)，隨著濃度的增加，芽增殖系數(shù)、平均根數(shù)、平均根長呈先上升后下降的趨勢，但都低于對照(不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑)，其中添加KT 0.05 mg·L-1時(shí)，與對照無顯著差異；在芽長方面，單獨(dú)添加KT、KT與NAA組合，隨著KT濃度增加，平均芽長均越來越長；KT 0.1 mg·L-1與NAA 0.01 mg·L-1組合時(shí)，芽長達(dá)到最大值，為2.35 cm。另外，在不同濃度的KT與NAA組合培養(yǎng)過程中，KT 0.1 mg·L-1與NAA 0.01 mg·L-1組合時(shí)根長值最大，達(dá)4.24 cm；平均根長也達(dá)到最大值，為4.24 cm；平均根數(shù)在不同濃度KT間無顯著差異。因此，在不添加NAA的情況下，不同濃度的KT顯著影響三葉青的側(cè)芽增殖；在KT與NAA組合生根中，NAA影響起主要作用。

表3 不同KT與NAA組合對三葉青側(cè)芽繁殖的影響

2.3 不同凝固劑對三葉青試管苗生長的影響

由表4可知，添加不濃度的凝固劑瓊脂粉和水晶洋菜對芽增殖系數(shù)和芽長生長有一定的影響，而對于生根影響差異不顯著。添加高濃度的瓊脂粉8 g·L-1，芽增殖系數(shù)和平均芽長均最低，而添加水晶洋菜3 g·L-1時(shí)，芽增殖系數(shù)最大，達(dá)5.68，顯著高于其它處理。3個(gè)濃度的水晶洋菜平均芽長總和為11.31 cm，瓊脂粉的芽長總和為8.19 cm，水晶洋菜各處理都顯著高于瓊脂粉的各個(gè)處理。研究中還發(fā)現(xiàn)，添加瓊脂粉的試管苗生長容易出現(xiàn)玻璃化。

表4 不同濃度凝固劑對三葉青無菌苗生長的影響

2.4 不同基本培養(yǎng)基對三葉青試管苗生長的影響

由表5可知，在不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的條件下，不同基本培養(yǎng)基的芽增殖系數(shù)無顯著差異，平均芽長以1/3 MS和WPM顯著高于MS和1/2 MS，平均根數(shù)與根長以WPM顯著高于其它3個(gè)基本培養(yǎng)基。在添加植物生長調(diào)節(jié)劑的條件下，1/3 MS的芽增殖系數(shù)、平均芽長、平均根長顯著低于其它基本培養(yǎng)基；MS與WPM基本培養(yǎng)基的芽增值系數(shù)、芽長沒有顯著差異；在MS和1/2 MS基本培養(yǎng)基中，添加植物生長調(diào)節(jié)劑的芽增殖系數(shù)和平均芽長都顯著高于不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的處理；而在1/3 MS和WPM培養(yǎng)基中，是否添加植物生長調(diào)節(jié)劑對芽生長和生根數(shù)均沒有顯著差異。綜上所述，MS+BA 0.05 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1更有利于芽生長，同時(shí)根系生長良好。

2.5 三葉青無菌苗大量繁殖與生產(chǎn)能力核算

綜合各試驗(yàn)結(jié)果，以節(jié)約成本、高效生產(chǎn)高質(zhì)量的三葉青組培苗為前提，三葉青組織培養(yǎng)過程中，增殖與生根培養(yǎng)一步完成，在程序上大大減少了繁育時(shí)間。前期以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，同時(shí)添加BA 0.5 mg·L-1與NAA 0.5 mg·L-1組合培養(yǎng)，增殖系數(shù)最大，達(dá)8.47；當(dāng)培養(yǎng)30 d后，轉(zhuǎn)移到無植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中30 d，促進(jìn)側(cè)芽伸長生長；60 d后生長茂盛(圖2)。此時(shí)，每株苗又可以切割3～5個(gè)莖段作為新的外植體，因此理論上月增殖最高可達(dá)11.293倍。以2500瓶組培苗母瓶為例，每瓶苗有10株，每年可增殖：2500×11.293×12=338790株。

表5 不同培養(yǎng)基對三葉青生長的影響

2.6 三葉青組培苗葉綠素?zé)晒馓匦苑治?/h3>

圖2 三葉青試管苗大量繁殖

葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線是熒光隨時(shí)間變化的曲線，熒光是在植物暗適應(yīng)后突然曝光發(fā)出的。典型的葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線有O、J、I、P 4個(gè)點(diǎn)，O—P的變化通過不同參數(shù)反映了光系統(tǒng)Ⅱ的原初光化學(xué)反應(yīng)以及光合作用元件的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)等變化。葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量上升出現(xiàn)K點(diǎn)，說明光系統(tǒng)Ⅱ異常。O點(diǎn)為熒光最小值對應(yīng)的時(shí)刻，K點(diǎn)為300 μs，J點(diǎn)為2 ms，I點(diǎn)為30 ms，P點(diǎn)為熒光最大值對應(yīng)的時(shí)刻[16]。如圖3所示，不同類型三葉青的葉片葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線差異不大。將K、J、I、P進(jìn)行比較，具體為：K點(diǎn)熒光強(qiáng)度大小為翌年生>當(dāng)年生，扦插≈組培，遮蔭>不遮蔭；J點(diǎn)熒光強(qiáng)度大小為翌年生>當(dāng)年生，扦插>組培，遮蔭>不遮蔭；I點(diǎn)熒光強(qiáng)度大小為當(dāng)年生>翌年生，組培>扦插，不遮蔭>遮蔭；P點(diǎn)熒光強(qiáng)度大小差異不明顯。由圖4可知，將熒光數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化以后，以當(dāng)年生(A)為參考，不同類型的三葉青葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線有明顯差異。

A為當(dāng)年生苗；B為翌年生苗；C為扦插苗；D為遮蔭苗；下同。圖3 不同類型三葉青葉片葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線

圖4 不同類型三葉青葉片光系統(tǒng)Ⅱ相對可變熒光強(qiáng)度差值

經(jīng)過葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線的JIP-test分析，WK和Vj分別代表光系統(tǒng)Ⅱ電子供體和受體側(cè)的性能[17]。由圖5可知，在WK方面，當(dāng)年生苗、翌年生苗、遮蔭苗三者間無顯著差異，但均顯著高于扦插苗，扦插苗WK值比當(dāng)年生苗WK值低23.2%。由圖6可知，翌年生苗、扦插苗、遮蔭苗的Vj值都高于當(dāng)年生苗，但三者間的差異未達(dá)到顯著水平，其中遮蔭苗顯著高于當(dāng)年生苗，高出18.1%。

2.7 光系統(tǒng)I(PSI)性能分析

光系統(tǒng)Ⅰ核心元件P700的氧化態(tài)P700+可以吸收820 nm波長的光，因此820 nm光吸收的變化可以反映P700的氧化還原狀態(tài)。由圖7可知，不同類型三葉青葉片820 nm相對光吸收曲線差異較大，820 nm光吸收量表現(xiàn)為A>B>D>C。ΔI/I0反映PSI的最大氧化還原能力[18]，表示PSI的活性。由圖8可知，最大氧化還原能力的強(qiáng)弱表現(xiàn)為C>D>B>A，4種三葉青苗的PSI活性間存在差異。以當(dāng)年生組培苗(A)為對照，450 d組培苗(B)、扦插苗(C)、遮蔭組培苗(D)PSI活性均逐漸增加，表明電子傳遞能力逐漸增強(qiáng)。因此，苗齡和光照會影響光系統(tǒng)性能，馴化出苗需要在90 d以上，最好提前遮蔭處理。

不同小寫字母為差異顯著,下同。圖5 葉綠素可變熒光FK占F0-Fj振幅的比例 圖6 葉綠素可變熒光Fj占FM-F0振幅的比例

圖7 不同類型三葉青葉片PSI 820 nm相對吸收值變化圖8 不同類型三葉青葉片PSI最大氧化還原能力ΔI/I0的差異

3 討論

3.1 低濃度的BA有利于試管苗生長，高濃度的BA有利于側(cè)芽增殖

三葉青是中國特有的珍稀藥用植物，在小兒發(fā)燒和抗腫瘤方面越來越多的應(yīng)用，也吸引了越來越多的學(xué)者們對三葉青的生物學(xué)特性與繁育技術(shù)的研究。組織培養(yǎng)育苗可以在短期內(nèi)獲得大量整齊一致、生長健壯的三葉青無性系種苗，不僅可以為生產(chǎn)提供栽培種苗，還能為進(jìn)一步科學(xué)研究提供理想的科研材料。本研究以盆栽苗莖段為外植體，建立了簡便、高效組織培養(yǎng)繁育技術(shù)體系。鐘毓倩[19]利用莖尖、帶腋芽的莖段和葉片作為外植體，發(fā)現(xiàn)以莖尖為外植體，最佳誘導(dǎo)不定芽和生根培養(yǎng)基各不相同。而本研究中添加0.5 mg·L-1BA與NAA組合表現(xiàn)出較高的芽增殖系數(shù)，同時(shí)也能夠生根，莖伸長生長較好，葉片較大而呈濃綠色，且無菌苗質(zhì)量及生根效果都很好，這樣大大節(jié)約了生產(chǎn)時(shí)間和成本。高濃度BA的植物生長調(diào)節(jié)劑容易誘導(dǎo)愈傷組織并分化苗細(xì)弱、黃化芽苗，而低濃度的BA和NAA組合可能是通過調(diào)節(jié)內(nèi)外源植物生長調(diào)節(jié)劑的平衡，對三葉青組培苗增殖和健壯成長有促進(jìn)效應(yīng)。

3.2 試管苗與扦插苗光合系統(tǒng)特性存在差異

組培苗移栽后生長良好，在遮陰條件下葉片濃綠茂盛。用快速葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)，可以方便、快速和無損傷的分析葉片PSII的功能的變化，包括反應(yīng)中心、電子供體和受體側(cè)的變化[20]，而利用820 nm吸收可以分析PSI活性，以此來鑒定組培苗移栽后的生長能力。本研究中組培苗不同葉片K點(diǎn)出現(xiàn)和熒光強(qiáng)度的差異，表明PSII供體側(cè)放養(yǎng)復(fù)合體損傷或者QA之前受體側(cè)部分被抑制、相當(dāng)于逆境脅迫，表明組培苗的PSII吸收能量強(qiáng)，葉片顏色也表現(xiàn)為組培苗深綠色、扦插苗黃綠色。三葉青為典型的陰生植物且遮陰70%時(shí)植株長勢最佳,隨著光照強(qiáng)度的減弱,三葉青生物量呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢[21-22]。根據(jù)最大氧化還原能力分析，組培苗移栽后苗齡過低也影響光系統(tǒng)的活性，扦插苗光合能力大于組培苗，但是組培苗移栽后光保護(hù)能力和抗逆能力都優(yōu)于扦插苗；當(dāng)移栽1年后光合能力大大增加，另外當(dāng)年生苗遮陰后減少光系統(tǒng)損傷，光合能力與扦插苗無差異。

4 結(jié)論

綜上所述，三葉青通過以帶節(jié)莖段為外植體，在“1/2 MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+水晶洋菜3 g·L-1、pH 5.8”培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽再生，培養(yǎng)4周后根和芽同時(shí)生長良好，大大節(jié)約了培養(yǎng)時(shí)間，簡單高效；遮蔭后的當(dāng)年生組培苗光合能力與翌年生組培苗相近，因此，建議林下栽培來源于組培苗的三葉青種苗，有利于提高生產(chǎn)效率，解決種苗短缺的問題。