王瀟，胡國靜，隋新月，劉卉

（1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院婦科，山東 濟南 250014）

近年來，我國不孕癥的發(fā)生率呈逐年上升趨勢，已成為嚴重影響女性身心健康、家庭和諧的疾病之一。導致不孕癥最為常見的原因是排卵障礙，約占所有原因的25%~50%[1]。排卵障礙性不孕癥（Ovulatory Disorder Infertility,ODI）是指由于女性生殖系統(tǒng)受到一些因素的影響導致排卵障礙，不能夠正常排卵，從而影響卵子與精子結合導致的不孕，常見的致病因素主要有下丘腦-垂體-卵巢軸（HPO軸）功能異常、卵巢病變、一些全身性疾病和心理因素等[2]。目前臨床治療以藥物為主，西醫(yī)使用以克羅米芬（CC）為代表的藥物進行促排卵治療，此類藥物可增加排卵率，但受孕率相對較低，且常產(chǎn)生流產(chǎn)、多胎妊娠和卵巢過度刺激綜合征等問題[3,4]。因此找到一種促排卵效果好且副作用小的藥物具有重要意義。

羅勒（Basil）是唇形目唇形科羅勒屬植物，又名香菜、九層塔等，味辛、甘，性溫，歸胃、肺、脾、大腸經(jīng)，為藥食兩用芳香植物，是一種常見易得的藥材[5]。經(jīng)臨床觀察，羅勒促排卵的效果顯著[6]，但其分子機制尚未明確。網(wǎng)絡藥理學作為一門新學科，其整體性、系統(tǒng)性和注重藥物間相互作用的特點與中醫(yī)藥學的辨證論治和整體觀念相吻合，能從生物學系統(tǒng)層面揭示藥物與靶點的調控網(wǎng)絡作用，是研究傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代藥理學之間相互關系的橋梁[7-9]。研究旨在通過網(wǎng)絡藥理學探尋羅勒治療排卵障礙性不孕癥的有效成分及作用靶點，并分析其生物過程及信號通路，進而闡述其作用機制，為進一步的實驗研究及臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 羅勒化學成分及靶點獲取

基于中醫(yī)藥研究綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID）及相關文獻[10]獲取羅勒的化學成分，將文獻中成分在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）中根據(jù)類藥性（DL）≥0.18及口服生物利用度（OB）≥30%篩選，使用有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem）獲得上述成分的SDF結構，導入生物活性小分子靶向預測平臺（Swiss Target Prediction）獲得藥物靶點。

1.2 ODI疾病靶點獲取

以“Ovulatory Disorder Infertility”為關鍵詞，使用在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）及人類基因綜合數(shù)據(jù)庫（GeneCards）分別進行檢索，去重后，獲得ODI疾病相關靶點。

1.3 羅勒治療ODI的網(wǎng)絡構建

將藥物靶點與疾病靶點利用Venny 2.1取交集，得到羅勒與ODI的共同靶點，并繪制韋恩圖。通過Cytoscape 3.7.2軟件構建“羅勒-有效成分-ODI-靶點”相互作用網(wǎng)絡圖，并使用軟件中Network Analyzer功能進行分析，根據(jù)節(jié)點自由度（Degree）將有效成分排序。

1.4 構建蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡

將韋恩圖中得到的藥物-疾病共同靶點輸入蛋白互作平臺（STRING）中進行網(wǎng)絡構建，設置最低相互作用閾值為0.4，蛋白種類為“Homo sapiens”，獲取羅勒治療ODI靶點的互作關系，將得到的TSV格式文件導入Cytoscape 3.7.2軟件進行再現(xiàn)美化與拓撲異構分析，選擇Degree值≥25進行篩選，獲得羅勒治療ODI的核心靶點。

1.5 富集分析

將藥物-疾病共同靶點上傳至功能富集分析數(shù)據(jù)庫（DAVID），物種及背景設置為“Homo sapiens”，進行靶點基因的基因本體論（GO）與京都基因和基因組百科全書（KEGG）功能富集分析，并將結果以圖的形式呈現(xiàn)。

1.6 分子對接驗證

使用PubChem數(shù)據(jù)庫下載有效成分結構，使用AutodockTools 1.5.6對配體小分子加氫、加電荷、檢測配體的root、進行可旋轉鍵的搜尋與定義并保存為pdbqt文件。RCSB Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫下載核心靶點蛋白的三維結構，使用AutodockTools1.5.6軟件添加氫原子、計算Gasteiger電荷、合并非極性氫后將其定義為受體并保存成pdbqt文件。確定Vina分子對接的坐標和盒子大小，最后運用Autodock vina 1.1.2對有效成分與核心靶點蛋白進行半柔性對接。

2 結果

2.1 成分及靶點篩選

通過TCMID數(shù)據(jù)庫共檢索得到羅勒含有的15個化合物，分別是(+)-car-3-ene-2,5-dione、2-呋喃羧酸（2-Furancarboxylic Acid）、茴香腦（Anethole）、雙環(huán)水芹烯（Bicyclosesquiphellandrene）、carene-3、D-n-甲基椰油堿（D-n-methyl coclaurine）、桉樹腦（Eucalyptol）、桉樹蠟（Eucalyptus wax）、丁子香酚（Eugenol）、丁子香酮（Eugenone）、異櫟素（Isoquercitrin）、肉桂酸甲酯（Methylcinnamate）、對甲氧基肉桂酸（P-Methoxycinnamic Acid）、對甲氧基肉桂醛（P-methoxycinnamaldehyde）和黃樟素（Safrole）；文獻中獲得羅勒化合物37個，其中符合TCMSP數(shù)據(jù)庫的化合物2個，分別為槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Keampferol）。通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫篩選出374個藥物靶點。

2.2 潛在作用靶點預測

將ODI分別在OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫進行檢索，篩選去重后獲得疾病靶點977個。將藥物靶點與疾病靶點輸入Venny 2.1，繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點53個，分別為PGR、AR、SERPINA6、SHBG、CYP17A1、CYP19A1、PTGES、ESR1、ESR2、MCL1、FAAH、HSD11B2、PTGS1、NOS2、AHR、F3、PTGS2、PPARA、SLC6A4、DRD2、DRD4、ADRB2、DRD5、OPRM1、TBXA2R、HTR2A、JUN、VEGFA、SRD5A1、KDR、TTR、MPI、PTPN22、MAPK10、MPO、CCND1、PDE3A、CYP11B1、MMP2、MMP14、CDK4、NOX4、TNF、IL2、MMP9、MMP1、NR4A1、HSD11B1、CASP3、HTT、NOS1、ALB和SLC16A7，見圖1。

2.3 “羅勒-有效成分-ODI-靶點”相互作用的網(wǎng)絡構建與分析

將整理好的羅勒化學成分與藥物-疾病共同靶點數(shù)據(jù)上傳至Cytoscape3.7.2軟件，構建“羅勒-有效成分-ODI-靶點”可視化網(wǎng)絡圖，見圖2。圖中藍色三角形代表羅勒中的15種有效成分（2種化學成分靶點與疾病靶點無交集，予刪除），綠色六邊形代表53個共同靶點。Degree值表示預測出該成分與作用靶點的關聯(lián)個數(shù)，Degree值越大說明該成分越重要，以Degree值從大到小排名依次是(+)-car-3-ene-2,5-dione、D-n-甲基椰油堿（D-n-methyl coclaurine）、丁子香酮（Eugenone）、丁子香酚（Eugenol）、對甲氧基肉桂酸（P-Methoxycinnamic Acid）、carene-3、肉桂酸甲酯（Methylcinnamate）、槲皮素（Quercetin）、雙環(huán)水芹烯（Bicyclosesquiphellandrene）、異櫟素（Isoquercitrin）、茴香腦（Anethole）、黃樟素（Safrole）、對甲氧基肉桂醛（Pmethoxycinnamaldehyde）、桉樹蠟（Eucalyptus wax）和桉樹腦（Eucalyptol）。

2.4 PPI網(wǎng)絡構建

將疾病-藥物共同靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，獲取TSV格式文件導入Cytoscape3.7.2軟件繪制關鍵靶蛋白PPI網(wǎng)絡圖，見圖3。圓圈越大、顏色越深代表關聯(lián)度越大，在此網(wǎng)絡中，度值大于25的靶點為ALB（Degree=36）、TNF（Degree=32）、VEGFA（Degree=30）、PTGS2（Degree=30）和JUN（Degree=27）。

圖3 PPI網(wǎng)絡圖Fig.3 The PPI network analysis

2.5 富集分析

GO富集結果顯示，交集基因共富集至158條生物學過程（Biological Process,BP）中，主要包括對缺氧的反應、對藥物的反應、ERK1和ERK2級聯(lián)的正調控、氧化還原過程、血壓負調節(jié)、糖皮質激素生物合成過程、對脂多糖的反應、乳腺肺泡發(fā)育、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、內皮細胞增殖的正調控等；23條細胞組分表達過程（Cellular Component,CC）中，主要包括膜筏、內質網(wǎng)膜和質膜的組成部分等；46條與分子功能相關的過程（Molecular Function,MF）中，主要包括類固醇結合、血紅素結合、RNA聚合酶II轉錄因子活性和配體激活的序列特異性DNA結合等。根據(jù)P值，將顯著性排名靠前的條目進行可視化，見圖4。KEGG通路分析主要涉及39條通路，根據(jù)P值，將顯著性排名前20的條目進行可視化，見圖5。KEGG顯示，羅勒治療ODI的作用機制主要涉及激素調節(jié)、炎癥反應等，相關通路包括TNF信號通路、雌激素信號通路、卵巢類固醇生成、GnRH信號通路和PI3K-Akt信號通路等，這提示羅勒通過多通路來治療ODI。

圖4 GO富集分析圖Fig.4 The GO enrichment analysis

圖5 KEGG富集分析前20條通路Fig.5 The first 20 pathways of KEGG enrichment analysis

2.6 分子對接驗證結果

通過將PPI網(wǎng)絡圖中度值前5的靶點ALB、TNF、VEGFA、PTGS2和JUN與15個有效成分進行分子對接，整理得到分子對接打分結果，見表1。結合自由能可以評估受體和配體之間的親和性，一般認為結合能小于0時，配體和受體可以自由結合，且結合自由能越低，二者親和力越強。結果顯示，羅勒有效成分均與網(wǎng)絡關鍵靶點具有較好結合活性，驗證了本研究數(shù)據(jù)的可靠性，運用PyMOL軟件對靶點基因結合活性最強有效成分對接結果進行可視化，見圖6。

圖6 槲皮素與PTGS2的分子對接構象圖Fig.6 The molecular docking conformation diagram of quercetin and PTGS2

表1 有效成分與關鍵靶點分子對接結合自由能表Table 1 Table of molecules docking and binding free energy between the effective components and core targets

3 討論

中醫(yī)藥治療不孕癥歷史悠久，早在《素問·骨空論》中就提出“督脈者……此生病……其女子不孕”。不孕癥是指未避孕、有正常性生活、夫婦同居一年而未受孕者。未避孕而從未妊娠者稱為原發(fā)性不孕癥，古稱全不產(chǎn)；曾有過妊娠而后未避孕連續(xù)一年未妊娠者稱為繼發(fā)性不孕癥，古稱斷續(xù)[11]。祖國醫(yī)學在治療不孕癥方面有著療效好、副作用小的優(yōu)勢。目前我國臨床以中藥復方促排卵居多，對于單味中藥促排卵的研究較少。金維新等[12]使用羅勒膠囊（治療組）治療女性排卵功能障礙性不孕癥，妊娠率高于克羅米芬組（對照組），且流產(chǎn)率更低。本文旨在通過網(wǎng)絡藥理學進一步揭示羅勒在分子層面的促排卵作用，為臨床應用及新藥開發(fā)提供研究基礎。

羅勒治療排卵障礙性不孕癥的最主要有效化合物為槲皮素、異櫟素和茴香腦。槲皮素為具有多種生物活性的黃酮醇類化合物，影響卵泡發(fā)育及排卵過程，通過降低HPO軸中ER、ER和PR的表達，進而調節(jié)血清中卵泡刺激素和黃體生成素分泌水平[13]。異櫟素是一種常見的食用植物雌激素，已知能抑制缺氧誘導因子-1，在人體內與雌二醇的作用相當[14]。茴香腦可調節(jié)卵母細胞和胚胎中氧化還原平衡和改善線粒體功能，促進卵母細胞發(fā)育，從而促進排卵[15]。

羅勒主要通過TNF（腫瘤壞死因子）、PTGS2（前列腺素內過氧化物合酶2）、PGR（孕酮受體）、VEGFA（血管內皮生長因子A）、ESR1（雌激素受體1）和CYP19A1（細胞色素P450 19A1）等靶點作用于排卵障礙性不孕癥。除抗腫瘤外，TNF還可以誘導顆粒細胞和早期卵泡凋亡，破壞血管內皮，影響卵巢供血、激素分泌和卵泡發(fā)育[16]。促性腺激素激增觸發(fā)排卵，促性腺激素激增可誘導排卵前卵泡顆粒細胞中兩個關鍵基因的表達，即PGR和PTGS2，它們分別激活兩個獨立的通路，這兩個通路對成功排卵都是必不可少的，并且PGR發(fā)揮了一個額外的重要作用，可通過減少促性腺激素激增誘導的PTGS2表達來減輕排卵性炎癥[17]。卵泡發(fā)育依賴于卵巢血管的生成，VEGFA是重要的調控血管內皮生長的因子，由其介導的血管生成對于卵巢卵泡的周期性生長和發(fā)育具有重要影響[18,19]。ESR1被認為是卵泡發(fā)育和成熟過程中的一個關鍵基因，ESR1能夠編碼一種雌激素受體，通過結合雌激素配體發(fā)揮生物學效應[20]。CYP19A1是芳香化酶P450（P450arom）的編碼基因，P450arom在卵泡募集的過程中起著關鍵作用，可使雄烯二酮轉化為雌二醇，并且刺激自身受體及黃體生成素受體的合成，也是卵巢內部局部調節(jié)機制中的重要因素之一[21]。由此可知羅勒主要通過調節(jié)與排卵相關的激素和減輕排卵性炎癥，起到促排卵作用。

根據(jù)GO富集分析提示羅勒治療排卵障礙性不孕癥主要涉及對缺氧的反應、氧化還原過程、對藥物的反應、內皮細胞增殖的正調控、對脂多糖的反應等生物過程。KEGG富集通路分析顯示，關鍵靶點主要富集在激素調節(jié)、炎癥反應等通路，包括TNF、雌激素、卵巢類固醇生成、GnRH和PI3K-Akt信號通路等。雌激素信號通路發(fā)揮其作用通過激活細胞質中的激酶，或者雌激素與雌激素受體結合后調節(jié)細胞核中的基因轉錄[22]，羅勒可通過調控雌激素信號通路調節(jié)雌激素的分泌來影響排卵的發(fā)生發(fā)展過程。促性腺激素釋放激素（GnRH）是生殖過程中最重要的激素之一，由下丘腦合成并以脈沖方式釋放，誘導促性腺激素—促黃體素和卵泡刺激素的合成和分泌。PI3K-AKT信號通路與卵巢顆粒細胞凋亡有關，多囊卵巢綜合征（PCOS）是排卵障礙不孕癥的主要類型之一，多囊患者子宮內膜常存在P13K-Akt信號通路的過度活化[23,24]。

綜上所述，羅勒治療排卵障礙不孕癥是通過多成分多靶點多通路發(fā)揮作用的，通過調節(jié)關鍵靶點TNF、PTGS2、PGR、VEGFA、ESR1和CYP19A1的表達以及多種生物過程，最終作用于炎癥反應及激素調節(jié)等相關通路，從而達到對排卵障礙性不孕癥的治療目的。本研究因數(shù)據(jù)有限，有一定局限性，但仍希望為排卵障礙性不孕癥的治療提供新思路。