陸珠，李玉，于延申※，王歡，任梓銘，王月

（1.吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130033；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部食藥用菌工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117）

奶油硫磺菌（Laetiporus cremeiporus）又名奶油絢孔菌，隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）非褶菌目（Aphyl lophoral es）多孔菌科（Polyporaceae）硫磺菌屬（Laetiponts）。擔(dān)子果單年生，近似側(cè)生柄到無(wú)柄，菌蓋上表面新鮮時(shí)呈淺橙色到橙紅色，菌孔表面幼嫩新鮮時(shí)呈奶油色到白色，生長(zhǎng)在闊葉樹倒木、樹樁及活樹的基部位置，通常生長(zhǎng)在寒溫帶到溫帶區(qū)域的櫟屬植物上。奶油硫磺菌主要分布在中國(guó)、蒙古、韓國(guó)和日本等國(guó)。在我國(guó)的吉林省、黑龍江省、河南省、遼寧省、內(nèi)蒙古省、山東省、山西省、陜西省、貴州省、四川省、甘肅省和湖北省等省份廣泛分布[1]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)篩選出的最優(yōu)單因素結(jié)果設(shè)計(jì)4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)對(duì)采自吉林省白山市靖宇縣的野生奶油硫磺菌的生物學(xué)特性[2-5]進(jìn)行研究，優(yōu)化菌絲培養(yǎng)條件，進(jìn)而篩選最佳生長(zhǎng)條件，為今后奶油硫磺菌的馴化栽培提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試奶油硫磺菌為吉林省白山市靖宇縣采集的野生子實(shí)體，經(jīng)組織分離、純化獲得，現(xiàn)保存在吉林省食用菌研究院（菌株號(hào)：JLSHJY2019032）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)

1.2.1.1 碳源試驗(yàn) PDA（基礎(chǔ)培養(yǎng)基），以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和可溶性淀粉為碳源，其他成分不變，配制100 mL培養(yǎng)基，倒入3個(gè)平板（3個(gè)重復(fù)），接入直徑為5 mm大小的菌塊，25℃恒溫培養(yǎng)，間隔24 h觀察1次，并用平板劃線法測(cè)量標(biāo)記菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度，連續(xù)測(cè)量直至出現(xiàn)某一平板長(zhǎng)滿菌絲。與此同時(shí)觀察并記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)，繪制折線圖。

1.2.1.2 氮源試驗(yàn) PDA，氮源分別為酵母粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨和麥麩汁，其他成分不變。處理方法同1.2.1.1。

1.2.1.3 pH試驗(yàn) PDA，設(shè)置pH為5、6、7、8、9等5個(gè)梯度。處理方法同1.2.1.1。

1.2.1.4 溫度試驗(yàn) PDA，pH自然，接種后分別放置于15℃、20℃、25℃、30℃和35℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。處理方法同1.2.1.1。

1.2.1.5 輔助營(yíng)養(yǎng)KH2PO4、MgSO4、CaCO3和VB1篩選試驗(yàn) PDA，pH自然，以空白、0.15%KH2PO4、0.1%MgSO4、0.15%KH2PO4+0.1%MgSO4、0.1%CaCO3、0.05%VB1作為供試的微量元素。處理方法同1.2.1.1。

1.2.2 正交試驗(yàn) 從單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果中選出培養(yǎng)效果最佳者，組成4因素3水平的正交試驗(yàn)（表1）。采用PDA培養(yǎng)基，分別添加碳源、氮源和微量元素，改變pH以及溫度，置于不同環(huán)境下培養(yǎng)。處理方法同1.2.1.1。

表1 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 The design scheme of the L9(34)orthogonal test

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)圖片制作和統(tǒng)計(jì)分析的軟件為Graph Pad Prism5和SPSS。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

菌絲在供試的碳源上均能生長(zhǎng)，與菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好、生長(zhǎng)最快的葡萄糖相比均無(wú)顯著性差異。葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和可溶性淀粉均是奶油硫磺菌菌絲生長(zhǎng)可利用的較好碳源。

圖1 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的影響Fig.1 The effect of the different carbon source on the Mycelial growth

2.2 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

菌絲在酵母浸粉、蛋白胨、硫酸銨和麥麩汁為氮源的培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。與菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好、生長(zhǎng)最快的麥麩汁相比，酵母浸粉和蛋白胨無(wú)顯著性差異，硫酸銨差異顯著。

圖2 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的影響Fig.2 The effect of the different nitrogen source on the Mycelial growth

2.3 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

菌絲在供試的pH上均能生長(zhǎng)。與菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好、生長(zhǎng)最快的pH為7相比，pH為6無(wú)顯著性差異，pH為8有差異，但差異不明顯，pH為5差異顯著，pH為9差異極顯著。

圖3 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的影響Fig.3 The effect of the different pH on the Mycelial growth rate

2.4 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

菌絲在供試的溫度上均能生長(zhǎng)，與菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好、生長(zhǎng)最快的30℃相比，25℃差異顯著，15℃、20℃和35℃差異極顯著。

圖4 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的影響Fig.4 The effect of the different temperature on the Mycelial growth

2.5 微量元素對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

菌絲在供試的微量元素上均能生長(zhǎng)，與菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好、生長(zhǎng)最快的0.15%KH2PO4+0.1%MgSO4相比，0.15%KH2PO4、0.1%MgSO4、0.1%CaCO3和0.05%VB1均無(wú)顯著性差異。

圖5 不同微量元素對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的影響Fig.5 The effect of thedifferent microelement onthe Mycelial growth rate

2.6 碳源、氮源、pH和溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

含葡萄糖的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最快為0.327cm/d，菌絲長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)，葡萄糖為最適碳源。含麥麩汁的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最快為0.415 cm/d，菌絲長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)，麥麩汁為最適氮源。pH為7時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快為0.407cm/d，菌絲長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)，為最適pH值。溫度為30℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快為0.343 cm/d，菌絲長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)，為最適培養(yǎng)溫度。

2.7 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

由于考慮到單因素試驗(yàn)不能反映交互作用的影響作用，所以進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗(yàn)，得出科學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)以碳源、氮源、溫度和pH組建4因素3水平的正交試驗(yàn)，各試驗(yàn)菌絲生長(zhǎng)情況見表3。由表3可以看出第3組菌絲生長(zhǎng)速度最快為3.439 cm/d，且菌絲長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)，則最優(yōu)配方為葡萄糖、麥麩汁、pH為8，溫度為30℃。各個(gè)因素的影響程度大小為pH＞溫度＞碳源＞氮源。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與表4實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。

表2 碳、氮、pH、溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響Table 2 The effect of the carbon,nitrogen source,pH and temperature on the mycelial growth

表3 菌絲生長(zhǎng)的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直觀分析Table 3 Results of the visual analysis of the mycelial growth

表4 菌絲生長(zhǎng)的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 4 Results of the F-test of the mycelial growth

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)奶油硫磺菌菌絲生長(zhǎng)所需的碳源、氮源、溫度、pH和微量元素的單因素試驗(yàn)可知單因素實(shí)驗(yàn)中最適碳源為葡萄糖，最適氮源為麥麩汁，最適pH為7，最適溫度為30℃，最適微量元素為0.15%KH2PO4+0.1%MgSO4。正交試驗(yàn)篩選出最優(yōu)配方為3，即葡萄糖、麥麩汁、pH為8、溫度為30℃，各因素影響程度為pH＞溫度＞碳源＞氮源。