陶 玲，曹 旸，紀(jì)光燕，晏汐蓓，王秋蘭，羅順珍，紀(jì)光玉，高麗霞，紀(jì)開萍

（景洪宏臻農(nóng)業(yè)科技有限公司，云南 景洪 666100）

黑牛肝菌 [Phlebopus portentosus(Berk.&Broome)Boedijn]，又名暗褐網(wǎng)柄牛肝菌，隸屬于牛肝菌目（Boletales） 小牛肝菌科（Boletinellaceae） 脈柄牛肝菌屬（Phlebopus）。分布于斯里蘭卡、越南、印度尼西亞、泰國(guó)、巴西、墨西哥、澳大利亞、新西蘭等泛熱帶地區(qū)，國(guó)內(nèi)廣西、海南、云南等地也有分布[1-3]。

黑牛肝菌與大多數(shù)牛肝菌的生長(zhǎng)方式不同，其可以脫離宿主樹形成子實(shí)體。目前，黑牛肝菌已被成功馴化，并實(shí)現(xiàn)了日產(chǎn)6 t的工廠化周年栽培[4-5]。

菌絲生長(zhǎng)是食用菌人工栽培的關(guān)鍵階段。在其他的食用菌中，部分維生素及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能夠促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)[6-15]。以往對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的相關(guān)報(bào)道中，主要是對(duì)適宜碳源、氮源、無機(jī)鹽或培養(yǎng)條件進(jìn)行的篩選[16-18]，尚未較全面地對(duì)維生素及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的促進(jìn)作用進(jìn)行研究。研究在黑牛肝菌常用固體瓊脂培養(yǎng)基（M1）中添加不同濃度的維生素及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，并從生長(zhǎng)速度和菌落形態(tài)方面觀察分析其對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響，以期為黑牛肝菌人工栽培技術(shù)的改進(jìn)提供理論實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

試驗(yàn)菌株來源于景洪宏臻農(nóng)業(yè)科技有限公司黑牛肝菌雜交菌株YL1701-2。

1.2 培養(yǎng)基制備

M1培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g煮至軟而不爛，過濾，葡萄糖20 g、酵母膏2 g、硫酸鎂1 g、磷酸二氫鉀1 g、瓊脂20 g，定容至1 000 mL。

在 M1 培養(yǎng)基中分別添加 0.05 g·L-1、0.10 g·L-1、0.50 g·L-13種不同濃度的維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、煙酰胺、維生素C及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、吲哚-3-乙酸（IAA），每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，以不添加維生素及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為對(duì)照。

將上述培養(yǎng)基于121℃，滅菌20 min備用。

1.3 接種與培養(yǎng)

活化后長(zhǎng)滿平板的黑牛肝菌菌絲母種，使用0.4 cm打孔器取菌塊，分別接種于上述培養(yǎng)基，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。培養(yǎng)至5 d、10 d、15 d、20 d時(shí)，以十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度，并于第20天觀察記錄菌落形態(tài)特征。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用DPS分析軟件進(jìn)行LDS差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 VB1對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

VB1對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響情況見表1。

由表1可知，添加VB1含量為0.05 g·L-1時(shí)，黑牛肝菌菌絲的生長(zhǎng)速度和菌落形態(tài)均明顯優(yōu)于其他濃度。隨著使用量增加，生長(zhǎng)速度變緩，色素加重。

表1 VB1對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響統(tǒng)計(jì)Tab.1 Statistics on the influence of VB1on mycelium growth

2.2 VB2對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

VB2對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響情況見表2。

如表2所示，添加0.50 g·L-1的VB2后，黑牛肝菌的菌絲生長(zhǎng)速度優(yōu)于其他處理。從菌落形態(tài)看，不同濃度的VB2均能減少黑牛肝菌菌絲產(chǎn)生色素，長(zhǎng)勢(shì)更好，邊緣更整齊。

表2 VB2對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistics on the influence of VB2on mycelium growth

2.3 VB6對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

VB6對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響情況見表3。

如表3所示，濃度0.50 g·L-1的VB6對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)速度有顯著的促進(jìn)作用，且菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好。不同濃度處理后，菌落均不吐水，但是菌落邊緣偏不齊。

表3 VB6對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響統(tǒng)計(jì)Tab.3 Statistics on the influence of VB6on mycelium growth

2.4 煙酸對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

煙酸對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響統(tǒng)計(jì)見表4。

由表4可知，添加不同濃度的煙酸后，黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)速度在培養(yǎng)10 d后均高于對(duì)照。添加量為0.05 g·L-1時(shí)，菌落形態(tài)最優(yōu)。

表4 煙酸對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響統(tǒng)計(jì)Tab.4 Statistics on the influence of niacin on mycelium growth

2.5 煙酰胺對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

煙酰胺對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響統(tǒng)計(jì)見表5。

由表5可知，培養(yǎng)至20 d時(shí)，添加煙酰胺濃度為0.05 g·L-1時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度顯著高于對(duì)照，在其他處理和測(cè)量時(shí)間點(diǎn)時(shí)，生長(zhǎng)速度均未顯著高于對(duì)照。添加濃度為0.50 g·L-1時(shí)，對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度有明顯抑制作用。各濃度處理在菌落形態(tài)上也未顯示出明顯優(yōu)勢(shì)。

表5 煙酰胺對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響統(tǒng)計(jì)Tab.5 Statistics on the influence of nicotinamide on mycelium growth

2.6 VC對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

VC對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表6。

表6 VC對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響統(tǒng)計(jì)Tab.6 Statistics on the influence of VC on mycelium growth

如表6所示，添加0.50 g·L-1的VC后，對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用，生長(zhǎng)速度和菌絲長(zhǎng)勢(shì)顯著高于其他處理，且菌落色素較少，邊緣整齊。

2.7 6-BA對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

6-BA對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響統(tǒng)計(jì)見表7。

由表7可知，添加0.05g·L-1的6-BA，對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，菌落色素較少，不吐水，且邊緣整齊。但隨濃度的增加，對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度會(huì)產(chǎn)生明顯的抑制作用。

表7 6-BA對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響統(tǒng)計(jì)Tab.7 Statistics on the influence of 6-BA on mycelium growth

2.8 IAA對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

IAA對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響統(tǒng)計(jì)見表8。

由表8可知，IAA對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，而且濃度越高抑制作用越強(qiáng)，濃度為0.50 g·L-1時(shí)菌絲不能生長(zhǎng)。

表8 IAA對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響統(tǒng)計(jì)Tab.8 Statistics on the influenceof IAA on mycelium growth

2.9 最佳濃度維生素及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度影響的比較

各種添加劑最佳濃度對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響的比較情況見表9。

由表9可知，在M1培養(yǎng)基中分別添加適宜濃度的6種維生素和2種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑后，除IAA外，其他物質(zhì)對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)速度、吐水、菌絲長(zhǎng)勢(shì)、邊緣整齊度等均有一定的促進(jìn)作用，培養(yǎng)20 d后添加適宜濃度的VB1和VC后黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于其余維生素和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，IAA則對(duì)菌絲生長(zhǎng)有抑制作用。

表9 各種添加劑最佳濃度對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響的比較Tab.9 Effects of additives at optimal concentration on myceium growth

3 討論與結(jié)論

研究結(jié)果顯示，除IAA外的添加劑均可促進(jìn)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲長(zhǎng)勢(shì)、菌落顏色、吐水情況、菌落邊緣整齊度。其中，添加0.05 g·L-1的VB1和0.50 g·L-1的VC后，菌絲生長(zhǎng)速度和菌落形態(tài)明顯優(yōu)于其他維生素和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。所有試驗(yàn)濃度的IAA均對(duì)菌絲生長(zhǎng)有抑制作用。

在張冰冰等[20]的報(bào)道中，曾指出VB1在和不同氮源結(jié)合使用時(shí)，對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響差異顯著，與酵母膏、牛肉膏、氯化銨結(jié)合時(shí)會(huì)抑制菌絲生長(zhǎng)，與硝酸銨結(jié)合時(shí)顯著促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)；并認(rèn)為可能是因?yàn)榫z在無VB1的添加或添加量較少時(shí)，菌絲已完全利用前3種氮源。

但本研究中，在使用相同濃度酵母膏作為氮源的前提下，添加 0.05 g·L-1和 0.10 g·L-1的 VB1均對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生了不同程度的促進(jìn)作用。經(jīng)過對(duì)比試驗(yàn)方法后，發(fā)現(xiàn)張冰冰等[20]的研究中，采用25℃暗箱培養(yǎng)14 d后測(cè)量菌落直徑，而本研究采用牛肝菌菌絲常用的30℃暗箱培養(yǎng)，并在5 d、10 d、15 d、20 d時(shí)測(cè)量菌落直徑，計(jì)算生長(zhǎng)速度。因此，不同培養(yǎng)溫度和時(shí)間可能是造成試驗(yàn)結(jié)果存在差異的主要原因。

據(jù)報(bào)道，研究中所涉及的維生素，對(duì)其他食用菌的菌絲生長(zhǎng)也有一定促進(jìn)作用，如VB1是美味牛肝菌（Boletus edulis Bull.：Fr.）菌絲生長(zhǎng)最適培養(yǎng)基[7]；VB1、VB2、VB6、VC對(duì)菌絲生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用[21]；煙酸、葉酸、VB1和 VB2對(duì)斑玉蕈 （Hypsizigus marmoreus） 菌絲生長(zhǎng)均有一定的促進(jìn)作用；VB1、VB2、煙酸對(duì)平菇（Pleurotus ostreatus） 生長(zhǎng)發(fā)育有顯著影響，且3種維生素同時(shí)添加時(shí)，平菇菌落長(zhǎng)勢(shì)最佳[22]。維生素是生物體內(nèi)多種代謝關(guān)鍵酶及輔酶的重要成分，參與蛋白質(zhì)、多糖及脂類的代謝，這也可能是維生素對(duì)食用菌菌絲生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用的原因[22]。

另一方面，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)其他食用菌菌絲生長(zhǎng)也會(huì)產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用。如2 mg·L-1～20 mg·L-1的 6-BA、KT、GA3、IBA 和 5 mg·L-1～20 mg·L-1的NAA對(duì)大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata） 菌絲生長(zhǎng)均有極顯著的促進(jìn)作用[15]，2，4-D-丁酯（≤10 mg·L-1）和IAA（≤2 mg·L-1）對(duì)羊肚菌（Morchella esculenta）菌絲生長(zhǎng)也有不同程度的促進(jìn)作用[16]等。試驗(yàn)中6-BA對(duì)黑牛肝菌母種菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但I(xiàn)AA卻顯示抑制作用，可能是由于黑牛肝菌本身會(huì)產(chǎn)生一定量的IAA，再加上外源添加后，IAA過量而產(chǎn)生抑制作用[23]。

通過研究添加維生素及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響，維生素對(duì)菌絲生長(zhǎng)有很大促進(jìn)作用，母種培養(yǎng)時(shí)菌絲長(zhǎng)勢(shì)、生長(zhǎng)速度等得到改善。