曹寶全，朱 洪

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科一病區(qū)，云南 昆明 650000）

肝癌（liver cancer）屬于消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，且每年約有60 萬(wàn)患者死于肝癌[1]。從宏觀(guān)上看，肝癌可分為原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌，其中原發(fā)性肝癌的比例為75%～90%[2]。雖然肝部分切除和肝移植治療早期肝癌是有效的[3]，但由于在疾病早期，患者的癥狀不易引起重視，導(dǎo)致大多數(shù)患者在就診時(shí)已處于肝癌的中晚期，其5 年生存率通常低于30%[4]。因此，尋找肝癌潛在生物標(biāo)志物，對(duì)提高其診斷、治療和預(yù)后具有重要意義。目前，鑒于現(xiàn)有第二代基因診斷技術(shù)的貢獻(xiàn)，通過(guò)微陣列技術(shù)分析肝癌的基因表現(xiàn)譜后，發(fā)現(xiàn)很多基因與肝癌的發(fā)展密切相關(guān)[5]。因此，將基因芯片技術(shù)與生物信息學(xué)方法相結(jié)合，可以篩選出在肝癌發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的基因。本研究利用GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中不同肝癌樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，研究肝癌與正常肝組織中差異表達(dá)的基因，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 肝癌基因數(shù)據(jù)集GSE121248 的表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)自于GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)[6]，其中有37 個(gè)肝臟正常組織樣本和70 個(gè)肝癌組織樣本。

1.2 基因篩選 利用R 軟件分析下載的數(shù)據(jù)，設(shè)定|logFC|=1，adj.P=0.05，研究在肝癌組織和正常肝組織中差異表現(xiàn)的基因。

1.3 富集分析 差異基因的功能注釋由DAVID（https://david.ncifcrf.gov/，6.8 版）[7]數(shù)據(jù)庫(kù)分析，包括生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能，然后對(duì)這些基因進(jìn)行通路富集分析（keoto enclopedia of genes，KEGG），F(xiàn)DR＜0.05 被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的建立及篩選關(guān)鍵基因?qū)⒑Y選出的差異基因上傳到String（https://string-db.org/11.0 版本）中[8]，并從該數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇“Multiplee proteins”，生物種類(lèi)設(shè)定為“Homo Sapines”，minimum required interaction score 設(shè)定為“highest confidence（0.9）”進(jìn)行分析。將得到的數(shù)據(jù)文件輸入到cytoocape（版本3.7.2）軟件中進(jìn)行可視化。然后，利用軟件中APP:cytohubba 的DMNC 和Degree 算法分別進(jìn)行分析，得到關(guān)鍵基因。兩種算法得到的前10 個(gè)基因取交集后得到的共同基因被認(rèn)為是關(guān)鍵基因。

1.5 生存分析 利用數(shù)據(jù)庫(kù)GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/，基因表達(dá)譜分析)[9]中肝癌患者的臨床資料，繪制K-M 曲線(xiàn)，P＜0.05 被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因篩選結(jié)果 通過(guò)肝癌數(shù)據(jù)集GSE121248 獲得了531 個(gè)差異表達(dá)基因，共有152 個(gè)高表達(dá)mRNAs 和379 個(gè)低表達(dá)mRNAs，見(jiàn)圖1。

圖1 篩選的差異mRNAs 火山圖

2.2 GO 和KEGG 富集分析 DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，531 差異基因的生物學(xué)功能主要富集在炎癥反應(yīng)、氧化過(guò)程和免疫反應(yīng)中；細(xì)胞成分主要集中在細(xì)胞外區(qū)域，分子功能主要集中在氧化還原酶活性、蛋白質(zhì)同源二聚活性、鐵離子結(jié)合和血紅蛋白結(jié)合；富集的主要途徑是化學(xué)致癌性、代謝和抗生素生物合成，見(jiàn)圖2。

圖2 GO 和KEGG 富集分析

2.3 PPI 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵基因篩選 共得到10 種差異基因，分別為T(mén)TK、KIF4A、NUSAP1、MELK、PTTG1、NEK1、NEK1、NEK2、NEK2、PMPK2、KIKG2、CEA2、CEF2、CDK1、CCNB1、CDC20、CCNA2、BUB1B、DLP5、KIF1A、TPX2、KIF20A。在網(wǎng)站上（http://bioinformaticas.psb.gnt.be/webtools/Venn/）制作韋恩圖后，共同的差異基因只有KIF20A，見(jiàn)圖3。

圖3 關(guān)鍵基因篩選

2.4 生存分析 為了進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)鍵基因KIF20A 是否與肝癌的預(yù)后密切相關(guān)，利用Gepia 數(shù)據(jù)庫(kù)繪制了肝癌的生存分析曲線(xiàn)，及其在肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示KIF20A 的表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后相關(guān)，且低表達(dá)與高生存率呈正相關(guān)（P＜0.05）。根據(jù)表達(dá)的箱式圖分析結(jié)果，其在肝癌組織的表達(dá)量遠(yuǎn)高于肝臟的正常組織（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果

3 討論

KIF20A（驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員20A）是驅(qū)動(dòng)蛋白-6 亞家族成員[10]，其表達(dá)水平與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。據(jù)報(bào)道[12，13]，KIF20A 可促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，通過(guò)激活JAK/STAT3 通路促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。KIF20A 也是不同類(lèi)型乳腺癌的治療靶標(biāo)和預(yù)后生物標(biāo)志物[14]，是治療卵巢癌的藥物靶點(diǎn)[15]；同時(shí)，其可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，促進(jìn)胃癌的增殖[16]。本研究旨在探討KIF20A 對(duì)肝癌患者預(yù)后的影響，為肝癌靶向基因治療提供理論依據(jù)。

本研究分析了GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)的肝癌數(shù)據(jù)集GSE12248 的70 個(gè)肝癌組織樣本和37 個(gè)正常肝組織樣本中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，得到了531 個(gè)差異的mRNAs，其中發(fā)揮上調(diào)作用的有152 個(gè)，下調(diào)作用的有379 個(gè)。GO 富集分析表明，這些差異表達(dá)基因主要通過(guò)代謝途徑和化學(xué)致癌作用影響細(xì)胞外氧化還原酶活性、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、血紅素結(jié)合和鐵結(jié)合。同時(shí)，為了進(jìn)一步篩選出在肝癌發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的mRNAs，將這531 個(gè)差異基因上傳到String 數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建由531 個(gè)點(diǎn)和935 條邊組成的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，然后將結(jié)果輸入到Cytoscape中進(jìn)行可視化，前10 個(gè)關(guān)鍵基因分別通過(guò)DMNC和Degree 算法得到。經(jīng)過(guò)取交集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有KIF20A 是肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因。為了進(jìn)一步探討KIF20A 與肝癌預(yù)后的關(guān)系，本研究利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中肝癌患者的臨床資料，繪制了其在肝癌組織和正常肝組織中表達(dá)的箱式圖和K-M 生存曲線(xiàn)，結(jié)果表明KIF20A 在肝癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)（P＜0.05），提示KIF20A 的表達(dá)量越低，肝癌患者的預(yù)后越好，生存時(shí)間越長(zhǎng)。本研究還存在一些不足：①本研究的結(jié)果沒(méi)有得到進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證；②雖然本研究中使用的肝癌數(shù)據(jù)集樣本量不小，但只有一個(gè)數(shù)據(jù)集，尚需要更多的樣本研究結(jié)果來(lái)進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)果；③肝癌的發(fā)生和發(fā)展通常是由多種因素影響，本研究未進(jìn)行單因素分析和多因素分析，只從基因表達(dá)的水平上對(duì)肝癌的發(fā)展做研究。

總之，KIF20A 是該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心基因，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，其高表達(dá)與患者生存率低有關(guān)，是判斷肝癌預(yù)后的可靠生物標(biāo)志物，可作為肝癌患者藥物治療的靶點(diǎn)。