鐘璐嘉，蔣文燦,2*，李 鑫，曾曉慧，蔣 鑫，霞 雨

(1.四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都 611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

Ⅵ型分泌系統(type Ⅵ secretion system,T6SS)是一種多組分蛋白輸出裝置，通過將效應蛋白分泌到外環(huán)境或直接注入鄰近細菌或真核細胞中發(fā)揮其功能，對于細菌的生存競爭具有重要意義[1-3]。T6SS主要存在于革蘭陰性菌中，近幾年關于其報道常見于大腸埃希菌屬(Escherichia)、沙門桿菌屬(Salmonella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、伯氏菌屬(Burkholderia)和弧菌屬(Vibrio)等。其中一些細菌可編碼不止一個T6SS基因簇，如副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)[4]和肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)[5]染色體上攜帶有2個T6SS，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)具有3個T6SS基因簇[6]。同種細菌編碼的不同T6SS，其功能有所差異。例如，泰國伯克霍爾德菌(Burkholderiathailandensis)T6SS-4參與金屬離子的攝取[7]，T6SS-5介導與宿主細胞的相互作用[8]。大量研究表明，細菌T6SS具有多種生物學功能，通過介導對細菌或真核細胞的作用，能夠影響致病菌對宿主的致病能力，提高細菌對環(huán)境的適應性[9]?，F對細菌Ⅵ型分泌系統的組成結構和相關功能的最新研究進展進行綜述。

1 T6SS的結構

T6SS至少由13個核心元件Tss(type Ⅵ secretion system)組裝而成，是一種類似于噬菌體尾部的多蛋白可收縮裝置,如圖1所示[10-12]。核心結構主要包含兩部分，即一個跨膜復合物和一個穿刺結構。在某些細菌中還存在附屬結構，參與T6SS的組裝。

圖1 細菌Ⅵ分泌系統的收縮結構[12]

1.1 核心結構

1.1.1跨膜復合物 TssJ，TssL和TssM組成的膜核心復合物TssJLM被解析為一個直徑約有220埃，長度約為320埃的火箭形五聚體，橫跨外膜和內膜，用于將整個裝置錨定在細菌細胞膜上。由TssJ和部分TssM組成的頂端附著在細菌外膜，內膜附近柔性區(qū)域由TssL和TssM的一部分組成。TssM是該綜合體的主要部分，10個TssM亞基構成雙層通道，每層有5個TssM柱[13]。膜核心復合物的TssJLM具有五倍旋轉對稱性[14]，并且每個不對稱單元由2個TssM亞基和3個TssJ亞基組成。這樣的結構增強了一個不對稱單元中2個相鄰TssJ-TssM對之間的穩(wěn)定性。并且形成的TssJs界面對T6SS 膜復合物的穩(wěn)定性、鞘層的形成以及T6SS介導的抗菌活性至關重要[13]。除此之外，TssJLM是基板?？康奈恢?，可提供通道，允許刺突和尾管通過，并在尾管移位時保持攻擊細胞的完整性[15]。

1.1.2穿刺結構 T6SS的穿刺結構主要包括收縮鞘、內管、刺突和基板等4個部分。異源二聚體TssB和TssC(VipA和VipB)聚合組成收縮鞘結構，包圍由多個溶血素共調蛋白(Hcp/TssD)六聚體堆疊形成的內管[16-17]。在Hcp管頂部是纈-甘氨酸重復蛋白G(VgrG/TssI)三聚體組成的刺突，頂端覆有脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-精氨酸(PAAR)重復蛋白單體[18-19]。TssBC鞘的快速收縮為排出的Hcp-VgrG-PAAR結構提供足夠的能量和伸展，促使Hcp-VgrG-PAAR結構穿過基板和膜復合體，離開分泌細胞，刺入受體細胞。收縮后，收縮的鞘被ATP酶TssH(ClpV)特異性地解聚，而效應因子則在靶細胞內以某種方式釋放[20-21]。形成的管鞘結構組裝在TssEFGK子單元組成的基板上[22]。基板由TssEFGK 楔塊圍繞中心VgrG-PAAR單元形成[23]。TssK通過與TssFG和TssLM的跨膜結構域相互作用，作為連接基板和膜復合物的連接器[24]。TssA在不同的T6SS系統中有不同的位置,目前已有研究報道，其參與管鞘結構的引發(fā)和聚合或作為基板組分起作用[25-26]。T6SS核心組分中，Hcp、VgrG和PAAR蛋白能與效應蛋白非共價結合充當載體，有的還可以包含具有效應功能的結構域[27-29]。最近已經描述了存在于腸桿菌科成員中的具有許多不同C末端效應結構域的專門Hcp效應子家族[30]。這些“特殊”效應蛋白與Hcp、VgrG或PAAR蛋白的效應結構域共價融合，組成結構的一部分，隨著Hcp、VgrG或PAAR蛋白的轉位被一同遞送到靶細胞中。

1.2 附屬結構除了上述核心組件外，T6SS中還存在附屬結構。在腸聚集性大腸桿菌(EAEC)中，TagL肽聚糖結合蛋白N末端跨膜區(qū)，能與膜復合物TssL跨膜螺旋結合，幫助膜復合物錨定在內膜上[31]。TssA相關家族蛋白TagA，在鞘組裝后期，能結合鞘遠端與TssA相互作用，以停止和穩(wěn)定伸展的TssBC鞘；缺失TagA將引起異常的鞘聚合，導致鞘變形彎曲并最終破裂，T6SS活性降低[32]。因此，這些附屬結構，有助于T6SS裝配效率的提高、結構的穩(wěn)定及功能的發(fā)生。

2 T6SS的功能

T6SS能夠運輸多種不同類型的效應蛋白，決定了T6SS功能的多樣性。T6SS分泌的效應蛋白可以通過作用于細胞壁[33]、細胞膜[34]和核酸[6]等相關靶位，影響靶細菌或靶細胞的功能，與許多細菌的致病性相關。研究表明，T6SS也利于細菌獲取營養(yǎng)素和DNA，提高細菌在宿主體內的生存能力。T6SS結構組分的缺失，能影響T6SS的組裝從而影響其相關功能[32，35]。

2.1 參與細菌競爭T6SS參與細菌競爭過程中強效毒素的傳遞，在大多數情況下導致競爭細菌細胞損傷，有利于細菌獲取生態(tài)位[36]。腸產毒素大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)分泌的T6SS依賴性毒素VT1和VT5能水解細胞壁肽聚糖，利于種間競爭[33]。銅綠假單胞菌釋放的Tse7核酸酶引起靶細菌DNA降解和生長停滯，有益于自身存活[6]。體外試驗表明，都柏林沙門菌(Salmonelladublin)T6SS缺失株與大腸桿菌菌株共培養(yǎng)時，突變株較野生型菌株競爭能力減弱[37]。伯克霍爾德菌(Burkholderiacenocepacia)T6SS-1能夠限制大腸桿菌和惡臭假單胞菌的生長[38]。比較腸外致病性大腸桿菌(extraintestinal pathogenicEscherichiacoli,ExPEC)VgrG缺失株和親本株中共培養(yǎng)的T6SS陰性大腸桿菌菌株含量變化，結果顯示缺失株對細菌的競爭能力顯著低于親本株[39]。在肺炎克雷伯菌中，icmF(TssM)或Hcp基因缺失均降低了菌株種間和種內的體外抗菌能力[40]。

體內研究表明，在諸如腸道的多微生物環(huán)境中，T6SS通過參與細菌競爭抑制局部微生物群，促進表達T6SS的細菌在腸道中定植?；魜y弧菌(Vibriocholerae)中T6SS介導的對宿主共生微生物群的抗菌活性，能抑制或清除競爭者以獲得目標生態(tài)位，利于自身在幼鼠腸道中定植，同時加重了相關疾病癥狀[9]。鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)毒力島-6(SPI-6)編碼T6SS，分泌的抗菌酰胺酶Tae4(切割肽聚糖)與hcp特異性結合作用于靶細菌，這種T6SS依賴性共生細菌的殺傷是鼠傷寒沙門菌在宿主腸內建立感染所必需的[41]。而宋內志賀菌(Shigellasonnei)T6SS缺失株則無法突破正常微生物群形成的保護屏障，不利于其在小鼠腸道中定植[42]。T6SS不只存在于致病菌中，也有研究表明，非產毒素脆弱擬桿菌(non-toxigenicBacteroidesfragilis，NTBF)競爭排除腸產毒性脆弱擬桿菌(enterotoxigenicBacteroidesfragilis,ETBF)，限制毒素分泌并保護宿主抵抗腸炎性疾病，這種細菌間的競爭或許可用于新型益生菌的開發(fā)[43]。上述相關報道證實了T6SS能克服微生物群介導的定植抗力，也有報道稱T6SS介導的細菌間競爭還可以導致不相同細菌種群的空間分離[44]。

細菌通過T6SS介導的競爭細菌的殺傷，自身及其同源姐妹細菌卻能不受影響，是由于存在相應免疫蛋白阻止效應蛋白進入后的毒性作用[45-46]。這些效應-免疫對具有菌株特異性和多樣性，不同效應-免疫對間還存在相互作用[47]，加強了細菌間的競爭。

2.2 介導細菌與真核細胞的相互作用T6SS分泌的效應蛋白作用于靶目標，可引起一系列的宿主反應。伯克霍爾德菌效應蛋白TecA,引起RhoA GTP酶中特定的天冬酰胺殘基去酰胺化，破壞肌動蛋白，激活炎性小體，宿主細胞發(fā)生焦亡[48]。JIANG等[49]報道，銅綠假單胞菌T6SS分泌的Tle4家族磷脂酶TplE可導致細胞內質網損傷，從而誘導自噬并最終造成宿主細胞死亡。

細菌對宿主細胞的黏附和入侵是其在宿主體內定植的2個關鍵過程。T6SS的表達對細菌黏附、入侵宿主細胞具有重要意義，能影響病原體感染宿主能力或病癥的嚴重程度。豬源腸外致病性大腸桿菌的VgrGs缺失株對人腦微血管內皮細胞(HBMEC)的年附、入侵能力和細胞毒性顯著下降；缺失株感染小鼠，較親本株而言，在小鼠血液、大腦、肝臟和脾臟中的載菌量減少，小鼠存活率顯著升高[39]。與報道的Hcp缺失株試驗結果一致[50]。在禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichiacoli，APEC)中也有相似研究，缺失 VgrG 的菌株對細胞黏附、入侵作用減弱，在組織器官中增殖能力顯著降低，對雛鴨致病力減弱[51]。ClpB 是ClpV的同源蛋白，為T6SS提供能量，缺失 ClpB 的禽致病性大腸桿菌在巨噬細胞內存活能力及對動物的致病能力降低[52]。雞傷寒沙門菌(Salmonellagallinarum)T6SS突變株與野生株相比，對來自母雞的單核細胞衍生的原代巨噬細胞的細胞毒性顯著降低[37]。T6SS陽性雞源空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)具有對細胞更強的黏附、入侵能力，利于在組織器官中定植，還可誘導更強烈的免疫應答[53]。肺炎克雷伯菌中的Ⅵ型分泌系統參與對人Caco-2結腸上皮細胞的黏附和入侵，其T6SS受損的突變體腸道定植減少[40]。

2.3 促進基因水平轉移許多革蘭陰性菌T6SS介導的非自身細胞裂解，導致DNA從靶細胞中釋放出來，從而促進基因水平轉移[54-55]。研究表明，霍亂弧菌可以通過基因水平轉移獲得新的T6SS效應基因并利用它們殺死相鄰細胞[56]。肺炎克雷伯菌與霍亂弧菌一樣，可以通過自然轉化獲得新的T6SS效應蛋白和免疫蛋白，并能將其遞送到靶細胞中[5]。類似地，在鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)中也證實了T6SS介導水平基因的獲得。遺傳物質能從獵物大腸桿菌轉移到鮑曼不動桿菌中，并且轉移的頻率足以允許實時觀察。除此之外，鮑曼不動桿菌還能通過此途徑獲得適應性的抗生素抗性基因，這可能也是其容易產生抗生素耐藥性的原因之一[57]。但關于T6SS介導的外源耐藥基因獲取作用還有待進一步研究。

2.4 具有抗氧化脅迫作用研究表明，細菌T6SS受環(huán)境信號調節(jié)[58]，在氧化應激的條件下，釋放效應物到外環(huán)境中，利于細菌吸收營養(yǎng)素，維持胞內羥基自由基水平，起到抗氧化脅迫作用。據報道，在假結核耶爾森菌(Yersiniapseudotuberculosis)中，OxyR蛋白響應氧化脅迫，激活T6SS基因的表達，將鋅離子結合蛋白轉移到胞外，實現金屬離子的獲得，進而消除體內自由基，達到抗氧化脅迫的目的[59]。在嚴重氧化脅迫壓力下，泰國伯克霍爾德菌T6SS分泌TseZ 鋅清除蛋白，也能結合環(huán)境中Zn2+，并與血紅素轉運蛋白HmuR相互作用，利于攝取Zn2+，增強氧化應激抗性[60]。相似地，它還可通過釋放T6SS依賴性Mn2+結合效應物TseM，促進Mn2+的捕獲以減輕氧化應激[61]。此外，來自腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli，EHEC)的T6SS效應物KatN過氧化氫酶，可以降低宿主細胞的活性氧(ROS)水平，促進吞噬細胞中EHEC的存活[62]。這些擁有T6SS和相關效應蛋白的細菌，更易抵抗不良環(huán)境，相較其他菌更具優(yōu)勢。

3 展望

T6SS通過傳遞各種效應蛋白以實現其功能的多樣性，為細菌在宿主體內生存提供益處?，F有報道T6SS介導腸道內共生細菌的殺傷，未來很有可能會出現更多實例證明多微生物群的組成、變化和功能與T6SS有關。并且T6SS介導的細菌競爭作用，或許可用于研發(fā)特異性靶向藥物抑制細菌T6SS，降低攜帶T6SS病原體的環(huán)境適應性以達到抗菌目的，為開發(fā)新型抗菌藥提供了潛在可能性。近幾年來，有關細菌T6SS功能的研究，主要集中在其能夠影響細菌對宿主的致病力方面。因此，深入研究細菌的T6SS，對于了解細菌的致病機理，開發(fā)相關弱毒苗或亞單位疫苗，有積極作用。除此之外，研究T6SS的效應蛋白及其與靶細胞的相互作用，還有利于了解更多關于宿主的基本生理學?？傊?，細菌的T6SS是近幾年研究熱點，無論是從疾病預防方面，還是加深對宿主認識方面都具有重大意義。