董俊升，王雅麗，方 麗 ，孫法壯，崔璐瑩，王 亨，李建基 *

(1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009)

子宮內(nèi)膜對哺乳動物的生殖起著至關(guān)重要的作用，影響生殖周期、著床、妊娠等，且能夠抵御病原菌的入侵。子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞是子宮內(nèi)膜的最外層，直接與外界環(huán)境接觸，在分娩以后子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞受到破壞，并且在此時幾乎所有奶牛的生殖道都會被細(xì)菌污染，可導(dǎo)致奶牛子宮炎與子宮內(nèi)膜炎[1-2]。因此，產(chǎn)后奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(BEECs)的快速修復(fù)對子宮內(nèi)膜恢復(fù)正常的生理功能有著重要意義。大腸桿菌是引起奶牛子宮內(nèi)膜炎最常見的致病菌，脂多糖(LPS)是其致病性內(nèi)毒素的主要成分[3]。已有研究報(bào)道，用1 mg/L LPS可制作奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的炎性損傷模型[1]。

組織的修復(fù)涉及炎癥消退、血管生成、組織重塑和新組織的形成[4]。上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、白細(xì)胞等產(chǎn)生的生長因子，參與修復(fù)過程，主要的生長因子有TGF-β、CTGF和VEGF。TGF-βs調(diào)控多種細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)胚胎發(fā)育、傷口愈合及血管生成，并且TGF-β1是CTGF的強(qiáng)效誘導(dǎo)劑[5]。CTGF對子宮內(nèi)膜的修復(fù)有明顯的促進(jìn)作用。在增殖期的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中的CTGF蛋白表達(dá)水平明顯升高[6]。VEGF是促進(jìn)血管生成的調(diào)控因子，它可以增加血管的通透性，促進(jìn)細(xì)胞遷移[7]。Wnt/β-catenin和PI3K/AKT信號通路對細(xì)胞的增殖、代謝、生存和侵襲等方面都有調(diào)控作用[8-9]。近幾年，很多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin通路參與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的生長修復(fù)進(jìn)程[10]。

皮質(zhì)醇作為一種內(nèi)源性糖皮質(zhì)醇激素，對維持機(jī)體的生理活動是必須的。但是，在奶牛圍產(chǎn)期期間，由于受到多種應(yīng)激刺激，如妊娠應(yīng)激、分娩應(yīng)激、泌乳應(yīng)激等，奶牛體內(nèi)皮質(zhì)醇濃度會出現(xiàn)較大范圍的波動[11-12]。目前，系統(tǒng)分析生理濃度和病理濃度的皮質(zhì)醇水平對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖作用的研究較少，因此本研究選用不同濃度的皮質(zhì)醇與LPS共同處理原代奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，觀察在奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生炎性損傷時皮質(zhì)醇對Wnt/β-catenin和PI3K/AKT信號通路以及多種生長因子TGF-β1、TGF-β3、CTGF和VEGF基因表達(dá)的影響，為深入了解產(chǎn)后奶牛子宮內(nèi)膜的修復(fù)機(jī)制提供資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器DMEM/F12培養(yǎng)基、鏈蛋白酶、LPS(O111：B4)和皮質(zhì)醇均購自Sigma公司；胎牛血清購自Gibco公司；胰蛋白酶購自Amresco公司；兔源一抗C-Myc、CyclinD1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、β-actin和山羊抗兔二抗均購自CST公司；兔源一抗β-catenin購自Abcam公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司；TRIzol購自北京全式金生物有限公司；熒光定量PCR儀和蛋白電泳系統(tǒng)均購自Bio-Rad公司；化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.2 奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)采集健康的奶牛子宮角并置冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行以下處理。用碘伏、75%酒精對子宮外表進(jìn)行消毒，無菌條件下將子宮角切成3～4 cm的小塊。用含有500 U/mL青霉素和500 U/mL鏈霉素的PBS反復(fù)沖洗，直至清澈。縱向?qū)⒆訉m角切開，暴露子宮內(nèi)膜組織，放入0.1%鏈蛋白酶中，4℃ 消化18 h[13]。消化結(jié)束后，刮取子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，置于PBS中，1 200 r/min離心5 min,棄上清，重復(fù)3次后，加入完全培養(yǎng)基，接種到細(xì)胞瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換新的培養(yǎng)液，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

1.3 熒光定量PCR檢測生長因子的基因表達(dá)將奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞達(dá)到80%融合，棄掉培養(yǎng)液。對照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，LPS處理組加入含1 mg/L LPS的基礎(chǔ)培養(yǎng)液處理，皮質(zhì)醇處理組加入分別含5,15,30 μg/L皮質(zhì)醇與1 mg/L LPS的基礎(chǔ)培養(yǎng)液共處理。在3,12,18 h時收集細(xì)胞，加入TRIzol試劑，根據(jù)試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，吸光度(D260/D280)應(yīng)在1.8～2.1之間，取900 ng RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s,60℃ 30 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)體系：SYBR Green mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，cDNA 1.0 μL，無核酸酶水補(bǔ)至25.0 μL。生長因子TGF-β1、TGF-β3、CTGF、VEGF及內(nèi)參β-actin的特異性引物序列見表1。

表1 奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞目的基因引物序列

1.4 Western blot檢測Wnt/β-catenin和PI3K/AKT通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)將奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合后棄掉培養(yǎng)液。對照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，LPS處理組加入含1 mg/L LPS的基礎(chǔ)培養(yǎng)液處理，皮質(zhì)醇處理組加入分別含5,15,30 μg/L的皮質(zhì)醇與1 mg/L LPS的基礎(chǔ)培養(yǎng)液共處理。30 min后收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)量濃度，并將各組蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至一致。取20～30 μg蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。PVDF膜于5 %脫脂乳中封閉1 h,放入相應(yīng)的一抗中，4℃孵育過夜。TBST洗滌PVDF膜，二抗室溫孵育1 h。TBST洗滌后ECL發(fā)光拍照，并用Image J軟件對圖像灰度值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 皮質(zhì)醇對LPS誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TGF-β1、TGF-β3、CTGF和VEGF mRNA表達(dá)的影響5,15,30 μg/L皮質(zhì)醇與LPS處理細(xì)胞后，熒光定量PCR法檢測各生長因子mRNA的相對表達(dá)量。如圖1所示，與空白組相比，LPS處理細(xì)胞后極顯著增加了TGF-β1和TGF-β3 mRNA的表達(dá)(P<0.01)。與LPS組相比，在3和12 h時，各質(zhì)量濃度的皮質(zhì)醇顯著降低TGF-β1 mRNA 的表達(dá)(P<0.05)，在18 h時，5，15 μg/L皮質(zhì)醇極顯著降低TGF-β1 mRNA的表達(dá)(P<0.01)；在3，12，18 h時，各個質(zhì)量濃度的皮質(zhì)醇均極顯著抑制TGF-β3 mRNA的表達(dá)(P<0.01)(圖1A，B)。與空白組相比，LPS處理后對VEGF mRNA的表達(dá)沒有顯著影響。與LPS組相比，在12 h時，15 μg/L皮質(zhì)醇顯著增加了VEGF mRNA的表達(dá)(P<0.05)，在18 h 時，15，30 μg/L皮質(zhì)醇均顯著增加VEGF mRNA的表達(dá)(P<0.05)(圖1C)。與空白組相比，LPS處理12 h時，CTGF mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，但在18 h時，其表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。與LPS組相比，在18 h時，各個質(zhì)量濃度皮質(zhì)醇處理組CTGF mRNA的表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01)(圖1D)。

與對照組相比，*示差異顯著(P<0.05)，**示差異極顯著(P<0.01)；與LPS組相比，#示差異顯著(P<0.05)，##示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2 皮質(zhì)醇對LPS誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞Wnt/β-catenin通路的影響由圖2可知，LPS處理奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞后，與對照組相比，β-catenin、C-Myc和CyclinD1的蛋白表達(dá)水平顯著性升高(P<0.05)，表明LPS處理30 min后可以誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞Wnt/β-catenin通路的活化。與LPS組相比，15，30 μg/L皮質(zhì)醇均顯著降低β-catenin的表達(dá)水平(P<0.05)，30 μg/L皮質(zhì)醇顯著抑制C-Myc和CyclinD1的表達(dá)水平(P<0.05)，提示皮質(zhì)醇能夠抑制由LPS誘導(dǎo)的Wnt/β-catenin通路的活化狀態(tài)。

圖2 皮質(zhì)醇對LPS誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞β-catenin、C-Myc、CyclinD1表達(dá)的影響

2.3 皮質(zhì)醇對LPS誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞PI3K/AKT通路的影響如圖3所示，LPS處理奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞后，與對照組相比，PI3K和AKT的磷酸化水平極顯著升高(P<0.01)，可見LPS處理30 min后激活了奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞PI3K/AKT通路。與LPS組相比，30 μg/L皮質(zhì)醇顯著降低了AKT的磷酸化水平(P<0.05)。15，30 μg/L 皮質(zhì)醇均顯著降低PI3K的磷酸化水平(P<0.05)。由此可見，皮質(zhì)醇能夠抑制LPS誘導(dǎo)的PI3K/AKT通路的活化。

圖3 皮質(zhì)醇對LPS誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞PI3K和AKT磷酸化水平的影響

3 討論

分娩后，奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞受到破壞，子宮內(nèi)膜的快速修復(fù)對今后正常的妊娠具有關(guān)鍵作用。并且，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞在抵御外界病原微生物的入侵中起到天然屏障的作用。皮質(zhì)醇參與多種生理功能的調(diào)控，例如生長增殖、免疫反應(yīng)、機(jī)體代謝等。本試驗(yàn)結(jié)果表明，皮質(zhì)醇能夠降低LPS誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TGF-β1、TGF-β3和CTGF的基因表達(dá)，抑制LPS引起的Wnt/β-catenin和PI3K/AKT通路的活化。

傷口愈合是一種高度有序和相互協(xié)調(diào)的進(jìn)程，涉及到炎癥、細(xì)胞增殖、基質(zhì)沉積和組織重塑。參與子宮內(nèi)膜修復(fù)的生長因子主要有TGF-βs、VEGF和CTGF。研究表明，哺乳動物的TGF-β1和TGF-β3有64%～85%的氨基酸序列是一致的，大部分功能是相似的，但是也有一些區(qū)別，TGF-β1誘導(dǎo)皮膚組織的瘢痕化，TGF-β3可抑制這種效果[14]。CTGF是一種多功能生長因子，在多種細(xì)胞中都有表達(dá)，如在上皮細(xì)胞和分泌細(xì)胞有表達(dá)。在創(chuàng)傷修復(fù)期間，CTGF的表達(dá)量明顯升高，促進(jìn)傷口愈合、結(jié)締組織細(xì)胞增殖及細(xì)胞黏附[5]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，LPS處理后細(xì)胞中TGF-β1和TGF-β3基因表達(dá)量均增加，這與之前的一些研究是相似的。鄧洋[15]證實(shí)LPS能夠引起奶牛子宮內(nèi)膜上皮組織中TGF-β1的表達(dá)；GU等[16]證實(shí)LPS處理髓核細(xì)胞后，其TGF-β蛋白表達(dá)水平上升。細(xì)胞受到LPS刺激后，NF-κB由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，誘導(dǎo)促炎因子的釋放，這些促炎因子能促進(jìn)TGFβ信號的活化，導(dǎo)致TGF-β表達(dá)升高[17]。但是,糖皮質(zhì)激素具有良好的抗炎效果，能夠抑制NF-κB通路，這也與我們的研究結(jié)果是相吻合。皮質(zhì)醇處理后，能夠明顯抑制TGF-β1和TGF-β3的表達(dá)。據(jù)報(bào)道，LPS能夠直接引起肝星狀細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞因子的產(chǎn)量[18-19]。CTGF在LPS處理前期呈下降趨勢，在18 h時出現(xiàn)升高趨勢，這可能是由于在炎癥前期以炎性損傷為主，后期CTGF表達(dá)增多，參與組織修復(fù)。當(dāng)皮質(zhì)醇處理細(xì)胞后，CTGF與TGF-β1和TGF-β3出現(xiàn)相似的結(jié)果，其基因表達(dá)抑制，說明皮質(zhì)醇能夠抑制由LPS誘導(dǎo)引起的增殖反應(yīng)。新血管的生成對子宮內(nèi)膜修復(fù)是必要的過程。本試驗(yàn)中VEGF基因的表達(dá)水平在LPS處理后沒有顯著變化，但是皮質(zhì)醇處理后 VEGF基因的表達(dá)明顯升高。鄧洋[15]研究也證實(shí)LPS沒有導(dǎo)致奶牛子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)量的明顯改變。OLLI等[20]報(bào)道，在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中VEGF的表達(dá)量可能不受炎癥的間接調(diào)控作用。當(dāng)然，具體的原因有待進(jìn)一步探討研究。

許多研究已經(jīng)證實(shí)，Wnt/β-catenin涉及子宮內(nèi)膜的修復(fù)，在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞再生時它處于動態(tài)的變化[21-22]。靜息狀態(tài)時，多數(shù)β-catenin結(jié)合在細(xì)胞膜表面，其余的β-catenin存在于細(xì)胞質(zhì)中，與破壞復(fù)合體(Axin、APC、GSK-3β和CK1α)結(jié)合。β-catenin發(fā)生泛素化，被降解。一旦Wnt/β-catenin被激活，活化的Dsh抑制β-catenin降解，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中聚集并進(jìn)入細(xì)胞核，參與基因的調(diào)控。在研究中可以看到，LPS能夠促進(jìn)β-catenin、C-Myc和CyclinD1的表達(dá)，表明LPS激活了該通路。據(jù)報(bào)道，LPS能夠活化Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖[23]。皮質(zhì)醇處理后，β-catenin、C-Myc和CyclinD1的表達(dá)均出現(xiàn)下降趨勢，并且在30 μg/L時其抑制效果最強(qiáng)。由此可見，皮質(zhì)醇能夠抑制LPS激活的Wnt/β-catenin通路。β-catenin的磷酸化與PI3K信號通路也存在著關(guān)聯(lián)，抑制PI3K的活性，能導(dǎo)致β-catenin泛素化和降解。

PI3K/AKT信號通路在胞內(nèi)信號傳導(dǎo)中有重要作用，調(diào)控細(xì)胞的增殖、黏附、遷移、侵襲、代謝和生存。PI3K是AKT的調(diào)控因子，能夠活化AKT，隨后AKT調(diào)控細(xì)胞的生長和生存。本試驗(yàn)結(jié)果表明，LPS能夠促進(jìn)PI3K和AKT發(fā)生磷酸化并激活該通路。但是，皮質(zhì)醇處理以后能抑制PI3K和AKT的磷酸化水平，抑制子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中PI3K/AKT通路的活化。據(jù)報(bào)道，LPS/TLR4信號傳導(dǎo)能觸發(fā)PI3K/AKT通路，增加細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)量，促進(jìn)纖維化[24]。據(jù)報(bào)道，糖皮質(zhì)激素能夠抑制LPS/TLR4信號，降低炎性反應(yīng)[25]。由此可見，皮質(zhì)醇能阻止TLR4與PI3K/AKT之間的信號傳導(dǎo)，抑制其活化。

綜上所述，皮質(zhì)醇能夠抑制LPS誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞Wnt/β-catenin和PI3K/AKT通路的活化，阻止LPS促進(jìn)生長因子TGF-β1、TGF-β3和CTGF表達(dá)量的上升。這可能會減少由于炎癥刺激導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜膠原沉積，避免子宮內(nèi)膜過度的纖維化，同時，干擾了子宮內(nèi)膜的修復(fù)進(jìn)程。