吳志強，劉少蓉，白民俊，段曉珮，高 強，黃素文，段躍強*

(1.內蒙古華希生物科技有限公司，內蒙古 呼和浩特 010111；2.北京美聯(lián)泰科生物技術有限公司，北京 100176)

布魯菌的主要傳統(tǒng)檢測技術分別有培養(yǎng)特性的鑒定、生化檢驗、病原分離鑒定及血清學檢測等[1]。近年來，運用于臨床檢測布魯菌病的免疫學方法主要有虎紅平板凝集試驗(RBPT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、補體結合試驗(CFT)和試管凝集試驗(SAT)等[2]。SAT和RBPT操作方法簡單，是我國檢測布魯菌病最通用的方法[3]，但缺點是容易發(fā)生交叉凝集反應，導致出現(xiàn)假陽性結果[4]。補體結合試驗參與試驗的因素多，操作比較復雜，試驗耗時較長。ELISA雖然診斷率高，但存在交叉反應、試驗干擾因素較多、重復性不好、對試劑成分及其生產(chǎn)品牌的選擇性高、難以同時區(qū)分多種病菌等缺點[1]。

光滑型布魯菌脂多糖(smooth lipopolysaccharide,sLPS)抗原能誘導動物機體產(chǎn)生長時間的抗體水平，因此，sLPS抗原是布病抗體檢測的優(yōu)勢抗原。目前，市售布魯菌檢測試紙條將布魯菌可溶性蛋白多糖復合物抗原作為檢測線，但是存在的問題是產(chǎn)品靈敏度稍差，漏檢概率較大。我們研制的布魯菌抗體檢測試紙條，采用了高度純化的sLPS抗原作為檢測抗原，同時利用間接法將膠體金標記在能與哺乳動物IgG普遍反應的葡萄球菌蛋白A(slaphylococcal protein A,SPA)上[5]，充分發(fā)揮了膠體金試紙條敏感性高、可對不同動物進行布魯菌病檢測的特點和優(yōu)勢。

本試劑采用膠體金免疫層析法(GICA)研制了可檢測牛、羊光滑型布魯菌抗體的試紙條[6]，作為當前獸醫(yī)臨床診斷動疫病最簡便、快速、敏感特異的免疫學檢測技術之一，可廣泛應用于獸醫(yī)臨床快速檢測和現(xiàn)場診斷[7]，有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應用前景。

1 材料與方法

1.1 菌種與血清光滑型布魯菌脂多糖(sLPS)由本實驗室培養(yǎng)純化；布魯菌病陽性血清標準品，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；大腸桿菌陽性血清(牛源)、大腸桿菌陽性血清(羊源)、都柏林沙門菌陽性血清(牛源)、都柏林沙門菌陽性血清(羊源)、產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性血清(牛源)、產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性血清(羊源)、小腸結腸炎耶爾森菌O：9陽性血清(牛源)、小腸結腸炎耶爾森菌O：9陽性血清(羊源)、布魯菌病陰性血清(牛源)和布魯菌病陰性血清(羊源)等，均由本實驗室制備；粗糙型布魯菌陽性血清，由北京希牧生物技術有限公司研發(fā)中心饋贈。

1.2 主要試劑布魯菌病試管凝集試驗抗原，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；市售布魯菌檢測試紙條，購自浙江迪恩生物科技股份有限公司；硝酸纖維膜購自默克公司；氯金酸購自Sigma公司；玻璃纖維、PVC底板購自上海金標生物科技有限公司；SPA購自杭州紐龍生物科技有限公司；其他化學試劑均為分析純。

1.3 sLPS的粗提及精純采用熱酚水法粗提。取檢驗合格的菌液，以8 000×g離心30 min，棄上清，測定菌體質量，按比例加入蒸餾水，加熱至66℃，在此溫度下加入苯酚溶液(水飽和酚溶液)，持續(xù)攪拌15 min，冷卻至2～8℃。具體操作參照文獻[8]。

1.4 sLPS抗原的檢驗取10 μL sLPS抗原溶液，經(jīng)SDS-PAGE后分別進行考馬斯亮藍染色和銀染?？捡R斯亮藍染色：將電泳后的凝膠取出，置于考馬斯亮藍染色液染色4 h以上，放入脫色液中脫色數(shù)次，脫色后取出觀察分析；銀染：將電泳后的凝膠浸入固定液中，于22℃氧化固定15 min，棄去固定液清洗3次加入銀染染色液，棄染色液后將凝膠浸入顯影液，最后在10%乙酸溶液中作用1 min終止反應。

1.5 膠體金溶液的制備及鑒定配制1%氯金酸溶液，搖勻后放到電磁爐上加熱至沸騰，迅速加入1%檸檬酸三鈉溶液，搖勻，繼續(xù)加熱10 min左右，直至溶液呈透亮的酒紅色，冷卻至室溫，用純化水恢復至原體積，分裝到棕色試劑瓶中，置2～8℃避光保存。

1.6 SPA最佳蛋白標記量的確定將不同蛋白含量的SPA加入裝有l(wèi) mL pH7.0的膠體金溶液的1～9號離心管內，混勻靜置，再在上述各管內分別加入0.l mL 10%氯化鈉溶液，混勻后靜置20 min。觀察使膠體金溶液呈橙紅色未變的最小SPA 用量即為最低穩(wěn)定量，最低穩(wěn)定量的10倍即為最適SPA用量。

1.7 試紙條的制備

1.7.1質控線(C線)和檢測線(T線)的劃膜 將兔抗SPA多克隆抗體和純化的sLPS分別作為質控抗原和檢測抗原，按照摸索好的濃度稀釋后，使用金標劃膜儀在NC膜噴印C線、T線。

1.7.2膠體金試紙條的組裝及結果判定 將各組分依次粘貼，組裝成試紙條，置陰涼干燥處貯存。檢測血清樣品時，C、T線同時出現(xiàn)條帶，表示為布魯菌抗體陽性；只有C線出現(xiàn)條帶，表示為布魯菌抗體陰性；如果C線無紅色條帶出現(xiàn)，則該試紙條無效。

1.8 試紙條的檢驗

1.8.1敏感性試驗 用樣品稀釋液將布魯菌病陽性血清國家標準品(1 000 IU/mL)進行系列稀釋，取100.00，10.00，1.00，0.10,0.01 IU/mL 5個稀釋度進行試紙條檢測，試紙條的敏感度應為結果呈陽性的血清最高稀釋度。

1.8.2重復性試驗 取同批次及3批不同批次的試紙條分別對布魯菌病陰、陽性血清檢測，根據(jù)檢測結果判定試紙條的批內和批間重復性。

1.8.3特異性試驗 用同一批次試紙條分別檢測11種特異性質控血清，根據(jù)試驗結果觀察其特異性。

1.8.4穩(wěn)定性試驗 取密封后的試紙條分別置于4,30℃的環(huán)境下保存1,3,6,9,12,15,18,21,24,27個月，取樣進行各項指標的檢測，根據(jù)檢測結果確定試紙條的穩(wěn)定性。

1.9 比對試驗(試紙條與試管凝集試驗)用試紙條與試管凝集試驗同時檢測110份牛血清和羊血清，牛、羊血清樣品由本實驗室制備、采集和檢驗。凝集試驗中先將待檢血清稀釋后再加入凝集抗原反應，根據(jù)血清凝集程度判定結果。根據(jù)試驗結果比較二者的符合率。

1.10 臨床樣品檢測用試紙條檢測120份臨床樣品，分別為羊源的布魯菌病陽性血清、牛源的布魯菌病陽性血清、羊源的布魯菌病陰性血清和牛源的布魯菌病陰性血清，各30份，均由本實驗室采集分離、檢驗。將臨床樣品設盲，由不參與試驗的人員對待檢血清進行編號，盲底一式二份密封保存。

2 結果

2.1 sLPS抗原純度測定純化的sLPS抗原SDS-PAGE后，經(jīng)考馬斯亮藍染色檢測，無蛋白條帶(圖1)；銀染條帶均勻分散，條帶的相對分子質量主要集中在40～60 kDa(圖2)。

M.Marker；1.脂多糖；2,3.sLPS抗原

M.Marker；1～4.sLPS抗原；5.脂多糖

2.2 膠體金表征分析當1%氯金酸溶液與1%檸檬酸三鈉溶液的比例為1∶1.6時，肉眼觀察制備的膠體金溶液顏色為橙紅色，制備的膠體金最大吸收峰在525 nm處，膠體金粒徑大小達到要求(表1)。已知膠體金顆粒直徑在20～40 nm范圍內最穩(wěn)定，所以，該產(chǎn)品的研發(fā)選用25 nm左右粒徑的膠體金顆粒。制備的膠體金透射電鏡表征見圖3，顆粒呈球形，分散性較好，顆粒大小均一。在自然光照下，膠體金溶液呈酒紅色，清澈透亮，室溫下放置3個月仍能保持穩(wěn)定，顏色清澈無沉淀析出。

表1 不同比例膠體金顆粒紫外檢測結果 nm

圖3 膠體金電鏡圖

2.3 試紙條的制備按照圖4的順序，依次將試紙條各組分組裝在一起，結果按照1.7.2方法判定。

1.樣品墊；2.金標墊；3.硝酸纖維膜：4.吸水紙；5.T線；6.C線；7.PVC板

2.4 膠體金試紙條的鑒定

2.4.1敏感性試驗結果 用樣品稀釋液將布魯菌病陽性血清標準品(1 000 IU/mL)進行系列稀釋，取100.00,10.00,1.00，0.10,0.01 IU/mL 5個稀釋度進行試紙條檢測，結果顯示試紙條最低可檢測至0.1 IU/mL的布魯菌病陽性血清，所以試紙條的靈敏度為0.1 IU/mL(圖5)，遠高于虎紅平板凝集試驗(25 IU/mL)和試管凝集試驗(2.5 IU/mL)的最低檢出量。和市場上經(jīng)批準銷售的同類試紙條相比，檢測靈敏性提高了100倍，表明我們的試紙條具有高靈敏性。

1.100.00 IU/mL；2.10.00 IU/mL；3.1.00 IU/mL；4.0.10 IU/mL；5.0.01 IU/mL

2.4.2重復性試驗結果 用同一批試紙條檢測4份陽性血清和4份陰性血清，試驗重復3次，結果一致，詳細試驗結果見圖6,7。用3批不同批次試紙條分別檢測4份陽性、陰性血清，結果均一致,表明研制的試紙條批內和批間的可重復性均為100%。

1,2.布魯菌陽性血清(羊源)；3,4.布魯菌陽性血清(牛源)

2.4.3特異性試驗結果 用膠體金試紙條檢測11種特異性血清，布魯菌陽性血清和陰性血清作對照。結果顯示，在對照組均成立的條件下，其他11種特異性血清檢測結果均為陰性，表明試紙條具有較好的特異性，不與其他非相關疾病感染血清反應(圖8)。

1,2.布魯菌陰性血清(羊源)；3,4.布魯菌陰性血清(牛源)

1.大腸桿菌陽性血清(牛源)；2.大腸桿菌陽性血清(羊源)；3.都柏林沙門菌陽性血清(牛源)；4.都柏林沙門菌陽性血清(羊源)；5.粗糙型布魯菌陽性血清；6.產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性血清(牛源)；7.產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性血清(羊源)；8.小腸結腸炎耶爾森菌O：9陽性血清(牛源)；9.小腸結腸炎耶爾森菌O：9陽性血清(羊源)；10.布魯菌病陰性血清(牛源)；11.布魯菌病陰性血清(羊源)

2.4.4穩(wěn)定性試驗結果 在4,30℃不同環(huán)境溫度下儲存的試紙條，用同一批血清樣品進行檢測，試驗結果顯示直到第27個月，試紙條各項性能指標合格，仍可對檢測結果進行判定。

2.5 比對試驗(試紙條與試管凝集試驗)兩者對牛血清檢測，陽性符合率為100%，陰性符合率為 95.2%，總符合率為95.4%(表2)；對羊血清檢測，陽性符合率為97.9%，陰性符合率為93.3%，總符合率為97.2%(表3)。由此可見試紙條檢出效率符合診斷試劑的國家標準(標準號：GB/T 26124-2011)。

表2 牛血清樣品檢測結果符合率

表3 羊血清樣品檢測結果符合率

2.6 臨床樣品檢測揭盲對120份臨床盲樣進行檢測并揭盲，60份樣品為陽性，60份樣品為陰性，檢測結果均與盲底一致，表明試紙條對于實際檢測臨床樣品具有很強的應用性和準確性。

3 討論

布魯菌病(簡稱布病)近幾年在世界范圍內廣泛流行，特別是在發(fā)展中國家暴發(fā)更為嚴重，也對人的健康造成極大的威脅。為此,我國緊急發(fā)布了《關于加強布魯菌防治工作的通知》[9]。通過對血清抗體的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，當病情反復發(fā)作時，機體的IgG 抗體可以迅速回升[10]。

我國動物布魯菌病診斷技術國家標準[11](GB/T 18646-2002)介紹的布病血清學檢測方法中，虎紅平板凝集試驗結果判定主觀性強，主觀差異性較大；乳牛全乳環(huán)狀試驗僅適用于奶牛，且試驗的操作復雜[12]。上述各種試驗技術各有其自身的特點，但存在的共同缺陷是以上各種檢驗都需要在實驗室完成，難以在基層中推廣使用，而免疫膠體金技術克服了上述缺陷。膠體金試紙條憑借其使用方便、現(xiàn)場迅速判定結果等優(yōu)勢，在動物疫病檢測中已得到較廣泛的應用[13]。

本試驗即采用了高度純化的 sLPS 抗原作為檢測抗原，成功制備了布魯抗體檢測試紙條(膠體金法)。敏感性試驗結果表明，我們的試紙條具有高靈敏性；重復性試驗用3個不同批次試紙條分別檢測4份陽性血清和4份陰性血清，檢測結果與試管凝集試驗結果均一致，表明研制的試紙條批內和批間可重復性均為100%，具有較好的穩(wěn)定性；特異性試驗在保證對照組成立的條件下，檢測11份特異性血清樣品為陰性，證明試紙條特異性強，和有可能存在交叉的血清均沒有交叉現(xiàn)象，避免像傳統(tǒng)檢測方法易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。

根據(jù)國家標準《動物布魯菌病診斷技術》(GB/T 18646-2018)中將試管凝集試驗方法確定為標準方法，本試紙條與試管凝集試驗進行比對，2者對牛、羊血清的檢測的符合率分別為95.4%和97.2%，由此可見試紙條檢出效率符合診斷試劑的國家標準，可以保證檢測的準確性。常規(guī)檢測方法耗時較長，本試紙條檢測樣品時僅需1～2 min即可判讀結果，不需要特殊儀器設備，不需要專業(yè)操作人員，具有敏感、特異、簡便、快速的特點。穩(wěn)定性試驗證明本試紙條在4～30℃條件下可保存長達24個月，更加適合在基層農(nóng)村和小規(guī)模養(yǎng)殖場推廣使用。本產(chǎn)品為多種疾病聯(lián)檢試紙條的研制和多標本快速定量檢測方法的建立奠定了基礎[14]。

本研究成功研制了布魯菌抗體檢測試紙條，它具有很高的靈敏性、特異性、重復性，這一研究結果為基層進行快速動物疾病檢測提供了基礎。