石雅琴，蘇 倩，王騰宇，毛曉偉，陳昕迪，穆嘉明，王文龍*，劉春霞

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲是家畜最常見的胃腸道寄生蟲之一，主要以吸食宿主血液為生，導(dǎo)致宿主出現(xiàn)貧血、消瘦、皺胃黏膜損傷等癥狀[1-2]，寄生嚴重者可致宿主死亡，特別是幼齡宿主。目前，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲對伊維菌素、丙硫咪唑、左旋咪唑等均出現(xiàn)了耐藥性[3-4]。丙硫咪唑作為一種廣譜、高效、低毒的苯并咪唑類抗蠕蟲藥物，廣泛應(yīng)用于國內(nèi)畜禽蠕蟲病的臨床防治，在一定程度上促進了我國畜牧行業(yè)的發(fā)展[5]。但是，耐藥性的產(chǎn)生，在一定程度上給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重威脅，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟損失。傳統(tǒng)的耐藥性檢測方法是在產(chǎn)生了明顯的耐藥性之后才能進行檢測，因此，探索一種新的耐藥性檢測方法勢在必行，而關(guān)于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲丙硫咪唑耐藥性的轉(zhuǎn)組學(xué)研究尚未見報道[6-7]。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析作為一種新型基因研究手段，對遺傳疾病、物種進化、藥物設(shè)計與應(yīng)用、種群多樣性、腫瘤標志性變化[8]及法醫(yī)學(xué)等方面的研究有重要意義。SNP是單個堿基序列發(fā)生突變，因此會直接影響氨基酸序列，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能發(fā)生改變，因而SNP位點可能是疾病遺傳機制研究的重點方向[9-11]。據(jù)報道，1991年對荷蘭羊場進行驅(qū)蟲藥耐藥性調(diào)查，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了芬苯咪唑耐藥性，之后便停止使用了該藥物；5年之后，再次使用該藥物，發(fā)現(xiàn)該羊場的圓線蟲依然對其具有耐藥性[12-13]，這說明耐藥性具有相對穩(wěn)定性。HOEKSTRA等[14]對左旋咪唑耐藥性選擇遺傳進行研究，發(fā)現(xiàn)左旋咪唑的耐藥性在連續(xù)的線蟲世代中逐漸發(fā)展。有些線蟲一旦產(chǎn)生耐藥性，后期即使不再用該藥，若干代后也很難恢復(fù)對該藥的敏感性，這更加證實耐藥性是一種遺傳性狀。而SNP分析對于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲耐藥機制的研究和新藥物研發(fā)有重要意義。本試驗從不同地區(qū)羊群中采集丙硫咪唑敏感和耐藥蟲株，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行耐藥相關(guān)基因SNP分析，確定耐藥性相關(guān)SNP突變，并對其基因進行生物信息學(xué)分析、PCR擴增以及測序分析。

1 材料與方法

1.1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲試驗蟲株捻轉(zhuǎn)血矛線蟲丙硫咪唑耐藥蟲株(Hc-WSrBZ1、Hc-WSrBZ2)采自內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市烏審旗；捻轉(zhuǎn)血矛線蟲丙硫咪唑耐藥蟲株(Hc-CYrBZ)和臨床敏感蟲株(Hc-CYsBZ)采自內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市察右后旗；捻轉(zhuǎn)血矛線蟲丙硫咪唑耐藥蟲株(Hc-XArBZ)采自內(nèi)蒙古自治區(qū)興安盟科右前旗；捻轉(zhuǎn)血矛線蟲標準敏感蟲株(Hc-ssBZ)為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院王瑞教授實驗室友情饋贈。所有蟲株均在體視鏡下鑒定雌蟲和雄蟲后，做好標記后于液氮中保存。

1.2 主要試劑及儀器RNA提取試劑TRIzol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴增用試劑購自TaKaRa公司。小型臺式高速離心機(1-14)，德國Sigma公司產(chǎn)品；低溫高速離心機(5430R)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；PCR儀(2720 Thermal Cycler)，Applied Biosystems公司產(chǎn)品；水平凝膠電泳儀(BG-subMIDI)，北京百晶生物技術(shù)公司產(chǎn)品；BDA凝膠成像儀(BDA digital)，美國BioDocAnalyze公司產(chǎn)品。

1.3 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲耐藥相關(guān)SNP基因篩選以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲丙硫咪唑耐藥蟲株(Hc-XArBZ)和標準敏感蟲株(Hc-ssBZ)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行SNP比較分析，選取非同義突變且發(fā)生在外顯子區(qū)域的基因，以敏感蟲株為參照，耐藥蟲株發(fā)生突變?yōu)檫x擇依據(jù)，確定耐藥相關(guān)候選基因。

1.4 突變基因生物信息學(xué)分析使用DNAstar 7.1.0軟件將4個基因翻譯成氨基酸序列，應(yīng)用在線軟件ExPASy-Prot Param分析4個基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列組成及理化性質(zhì)[15]；SOPMA在線軟件分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL預(yù)測基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)[16]等。

1.5 試驗樣品RNA提取及cDNA合成取捻轉(zhuǎn)血矛線蟲第3期幼蟲，經(jīng)DEPC水清洗后，放入預(yù)冷的研缽中加入液氮研磨，取研磨后組織置于1.5 mL的離心管中，加入 800 μL的TRIzol試劑，充分混勻，室溫靜置5～10 min；加入 200 μL氯仿，蓋緊離心管蓋，輕微混勻至乳化，室溫靜置5～10 min；4℃、13 000 r/min 離心15 min，小心取出離心管，取上清液移入另一新的離心管中；向上清液中加入等體積的異丙醇，輕微的上下顛倒混勻，冰上靜置10～20 min；4℃、13 000 r/min離心10 min，棄上清，加入 1 mL 75%酒精(DEPC水配制)，輕微上下顛倒洗滌，4℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清，將離心管倒置在濾紙上，自然風(fēng)干 5 min；沉淀干燥后，加入10～20 μL RNase-free水，室溫促溶 2 min后，使用NanoDrop2000測定RNA的濃度和純度。將測定后的RNA按照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.6 差異基因PCR擴增根據(jù)從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出的HCON_00192020、HCON_00037800、HCON_00129090和HCON_00178650等 4 個基因序列，利用Primer 5軟件設(shè)計特異性引物，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物序列：HCON_00192020上游引物P1：5′-CCAAGGTTGATCACAGCGAATG-3′，HCON_00192020下游引物P2：5′-GGCCGAAACTATTGTCT-3′；HCON_00037800上游引物P3：5′-CCGAAGGCTAAACGACCATGTC-3′，HCON_00037800下游引物P4：5′-TGCTTTGCGAAGACGATTCTG-3′；HC-ON_00129090上游引物P5：5′-TGTCGACGTCAAGAACAATAGA-3′，HCON_00129090下游引物P6：5′-CGGCTGGAACAGAGTTACAT-3′；HCON_00178650上游引物P7：5′-ATGGAAATTCACGAACAAGGA-3′，HCON_00178650下游引物P8：5′-CTAAAACCTTTCATCTGCAGTG-3′。PCR擴增反應(yīng)體系25 μL，Premix TaqTM12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，50～55℃ 30 s(HCON_00192020退火溫度為 50℃；HCON_00037800退火溫度為 55℃；HCON_00129090退火溫度為 52℃；HCON_00178650退火溫度為 55℃)，72℃ 1.5 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.7 PCR產(chǎn)物測序分析將擴增條帶大小正確的4個基因的PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司進行測序分析。

2 結(jié)果

2.1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲耐藥相關(guān)SNP基因篩選以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲丙硫咪唑耐藥蟲株(Hc-XArBZ)和標準敏感蟲株(Hc-ssBZ)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行SNP比較分析，選取非同義突變且發(fā)生在外顯子區(qū)域的基因，以敏感蟲株為參照，耐藥蟲株發(fā)生突變?yōu)檫x擇依據(jù)，篩選耐藥相關(guān)候選基因。共篩選到41個具有SNP位點的基因，選擇reads≥10的4個基因進行后續(xù)基因擴增和生物信息學(xué)分析。

2.2 差異基因生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.2.1理化性質(zhì)分析 將4個基因序列用DNAStar中EditSeq軟件翻譯為氨基酸序列后，經(jīng)ExPASy-Prot Param分析發(fā)現(xiàn)：4個基因敏感株和耐藥株的原子總數(shù)、分子式和相對分子質(zhì)量分別有不同程度的改變。HCON_00192020基因敏感株蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為37.93(<40為穩(wěn)定蛋白)，總平均親水性為―0.370。耐藥株蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為38.18，總平均親水性為―0.383。HCON_00037800基因敏感株蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為48.14，總平均親水性為―0.441。耐藥株蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為48.36，總平均親水性為―0.430。HCON_00129090基因敏感株蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為61.28，總平均親水性為―0.495。耐藥株蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為61.72，總平均親水性為―0.505。HCON_00178650基因敏感株蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為42.69，總平均親水性為0.157。耐藥株蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為42.97，總平均親水性為0.147。

2.2.2蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 應(yīng)用SOPMA程序預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)，敏感蟲株和耐藥蟲株HCON_00192020、HCON_00037800、HCON_00129090和HCON_00178650基因所編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)組成均發(fā)生改變見表1，突變前和突變后見圖1。

A,a.HCON_00192020;B,b.HCON_00037800;C,c.HCON_00129090;D,d.HCON_00178650;大寫字母表示敏感蟲株，小寫字母表示耐藥蟲株(下同);藍線表示α螺旋；紫線表示無規(guī)則卷曲；紅線表示延伸鏈；綠線表示β轉(zhuǎn)角

表1 4個基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)組成

2.2.3蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 應(yīng)用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測敏感株和耐藥株HCON_00192020、HCON_00037800、HCON_00129090和HCON_00178650基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)(圖2)。其中，敏感蟲株和耐藥蟲株HCON_00192020和HCON_00037800基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，紅色箭頭表示三級結(jié)構(gòu)改變位置；而HCON_00129090和HCON_00178650基因編碼蛋白其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，三級結(jié)構(gòu)未見明顯改變。

A,a.HCON_00192020；B,b.HCON_00037800；C,c.HCON_00129090；D,d.HCON_00178650

2.3 差異基因擴增結(jié)果采用RT-PCR方法，根據(jù)HCON_00192020、HCON_00037800、HCON_00129090和HCON_00178650等 4個基因不同的PCR反應(yīng)條件，對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲1個標準敏感蟲株和3個耐藥蟲株分別進行RT-PCR擴增，擴增結(jié)果電泳圖見圖3，目的條帶大小均正確，可用于后續(xù)測序分析。

A.HCON_00192020;B.HCON_00037800;C.HCON_00129090;D.HCON_00178650;M.DL2000 DNA Marker;1.標準敏感蟲株;2～4.3個地區(qū)耐藥蟲株

2.4 差異基因擴增產(chǎn)物測序分析根據(jù)4個基因在4個不同樣本中PCR產(chǎn)物測序結(jié)果，利用DNAstar中Megalign軟件，進行捻轉(zhuǎn)血矛線蟲標準敏感蟲株與3個耐藥蟲株測序序列的兩兩比對。HCON_00192020基因在3個耐藥蟲株中第266位均由T突變?yōu)镃；HCON_00037800基因在3個耐藥蟲株中，第179、182、188位均由A突變?yōu)镚；HCON_00129090基因在3個耐藥蟲株中第283位由G突變?yōu)锳；HCON_00178650基因在3個耐藥蟲株中第89位均由C突變?yōu)锳。突變結(jié)果均與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。

3 討論

目前，對于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲耐藥性的檢測仍然是以傳統(tǒng)方法為主，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的迅猛發(fā)展為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲耐藥性檢測提供了新思路。因此，本試驗從轉(zhuǎn)錄組水平出發(fā)，對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲耐藥性進行了初步探索。

本試驗首先根據(jù)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)篩選出HCON_00192020、HCON_00037800、HCON_00129090和HCON_00178650等4個與耐藥相關(guān)候選差異基因。4個差異基因序列經(jīng)NCBI中BLAST比對，分析其所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域，HCON_00192020基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域為C1肽酶家族，也稱為木瓜蛋白酶家族，由半胱氨酸肽酶(CPs)的2個亞家族C1A(木瓜蛋白酶)和C1B(博來霉素水解酶)組成。而組織蛋白酶B是一種木瓜蛋白酶樣半胱氨酸肽酶[17]，屬于溶酶體，在所有組織中均有表達，它與其他組織蛋白酶一起，參與蛋白質(zhì)降解、酶原活化、抗原加工、代謝和細胞凋亡等。HCON_00037800基因編碼蛋白存在WD40結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域存在于許多真核生物蛋白中[18]，這些蛋白家族均具有多種功能，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、mRNA前加工和細胞骨架組裝配制中的銜接作用或調(diào)控作用等。HCON_00129090基因編碼蛋白注釋到鋅指蛋白家族，鋅指蛋白是真核生物中較為豐富的一類轉(zhuǎn)錄因子[19]，指含有通過結(jié)合鋅離子形成穩(wěn)定的可以自我折疊形成類似于“手指”結(jié)構(gòu)的一類蛋白，在胚胎發(fā)育和細胞分化等生命過程中發(fā)揮重要作用。HCON_00178650基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域為主要促進者超家族(MFS)。MFS家族在細菌、真核生物中普遍存在[20]，是一個龐大而多樣的次級轉(zhuǎn)運者群體，包括單向轉(zhuǎn)運蛋白、同向轉(zhuǎn)運蛋白和反向轉(zhuǎn)運蛋白。MFS蛋白能促進跨越多種底物的細胞質(zhì)或內(nèi)膜上進行運輸，這些底物包括離子、磷酸糖、藥物、神經(jīng)遞質(zhì)、核苷酸、氨基酸和多肽。單向轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運單個底物，而同向轉(zhuǎn)運蛋白和反向轉(zhuǎn)運蛋白可以分別沿膜的相同或相反方向轉(zhuǎn)運2種底物。其次，對這4個差異基因進行了生物信息分析，在了解了其編碼蛋白主要理化性質(zhì)后，對其進行了二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果顯示，HCON_00192020基因編碼的蛋白是穩(wěn)定的親水性蛋白；HCON_00037800基因編碼的蛋白是不穩(wěn)定親水性蛋白；HCON_00129090基因編碼的蛋白是不穩(wěn)定親水性蛋白；HCON_00178650基因編碼的蛋白是不穩(wěn)定疏水性蛋白。但敏感蟲株與耐藥蟲株這4個基因編碼蛋白原子總數(shù)、分子式及相對分子質(zhì)量等均發(fā)生了改變。二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示單個堿基發(fā)生改變，導(dǎo)致敏感蟲株和耐藥蟲株蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，對應(yīng)的功能也有可能發(fā)生改變，例如鐮刀型貧血癥，就是典型的單核苷酸突變，致使氨基酸序列發(fā)生改變，血紅蛋白結(jié)構(gòu)異常[21]，從而引起的一種疾病。所以也可以大膽的推測這些改變具有導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生的可能性。最后，對這4個差異基因進行PCR擴增，對條帶大小正確的擴增產(chǎn)物進行測序。將測序得到的標準敏感蟲株與3個地區(qū)不同的耐藥蟲株序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該4個差異基因在3個不同地區(qū)耐藥蟲株中均有相應(yīng)位點發(fā)生單核苷酸突變，且與轉(zhuǎn)錄組測序所得的突變位點信息一致，證明了HCON_00192020、HCON_00037800、HCON_00129090和HCON_00178650基因可作為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲耐丙硫咪唑蟲株的分子標記，用于耐藥蟲株的分子鑒定。