蘇小艷，李運(yùn)莉，燕 霞，張東升，李 林，侯 蓉，岳嬋娟，劉頌蕊*

(1.成都大熊貓繁育研究基地，四川 成都 610081;2.四川省瀕危野生動物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，四川 成都 610081;3.四川省大熊貓科學(xué)研究院，四川 成都 610081)

肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumonia，Kpn)屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，為革蘭陰桿菌；作為一種人獸共患病病原，廣泛分布于人和動物腸道以及自然環(huán)境中[1-7]。Kpn能引起典型的原發(fā)性肺炎，也能引起各種肺外的感染，如骨髓炎、泌尿道感染及敗血癥等[8-10]。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)是由細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)的一類酶，能賦予細(xì)菌對頭孢菌素類、單酰胺類(氨曲南)及青霉素類抗生素耐藥[11]。由于產(chǎn)ESBLs-Kpn菌株在攜帶ESBLs質(zhì)粒的同時，常攜帶對其他抗生素如氟喹諾酮類、磺胺類、氨基糖苷類的多種耐藥基因，故可造成多重耐藥[12-13]。

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)是世界公認(rèn)的瀕危動物，是生物多樣性保護(hù)的旗艦種，屬于國家Ⅰ級保護(hù)動物，現(xiàn)分布于四川、甘肅、陜西三省山區(qū)。第4次大熊貓普查結(jié)果顯示，全國野生大熊貓種群數(shù)量達(dá)1 864只[14]，目前全國圈養(yǎng)大熊貓種群數(shù)量達(dá)500只。在圈養(yǎng)大熊貓的疾病防控中會使用抗生素，其中包括β-內(nèi)酰胺類抗生素。在人醫(yī)及動物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，專家學(xué)者對ESBLs-Kpn的臨床分離株在耐藥性、毒力基因和分子流行病學(xué)等方面進(jìn)行了深入研究，這些研究結(jié)果為科學(xué)有效地防控超廣譜ESBLs-Kpn都起到了積極作用。然而，對于大熊貓源ESBLs-Kpn的分子流行病學(xué)研究目前還處于空白狀態(tài)。因此，本試驗擬對大熊貓源ESBLs-Kpn進(jìn)行分離鑒定，探究大熊貓源ESBLs-Kpn在圈養(yǎng)大熊貓中的流行情況和基因型，為臨床合理使用抗生素提供科學(xué)依據(jù)，也為預(yù)防和控制此類細(xì)菌的傳播提供系統(tǒng)的實(shí)驗數(shù)據(jù)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理2018-2019年共收集某基地圈養(yǎng)大熊貓新鮮糞便390份；用滅菌鑷子夾取少許糞便放入裝有1 mL無菌生理鹽水的無菌EP管中，充分震蕩混勻后接種到腦心浸液(BHI)肉湯中擴(kuò)菌培養(yǎng)。

1.2 菌株的分離培養(yǎng)與革蘭染色將1.1中的BHI肉湯在無菌條件下接種到麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素瓊脂培養(yǎng)基(MIAC，購自北京陸橋公司)上，37℃培養(yǎng)12～24 h后觀察菌落形態(tài)特征。挑選較大、圓凸起、邊緣紅色中間粉白色的具有一定黏度的單菌落進(jìn)行進(jìn)一步純化后于37℃搖床振蕩進(jìn)行單菌落擴(kuò)增培養(yǎng)。挑取少許菌液進(jìn)行革蘭染色后觀察菌體形態(tài)及染色特征。

1.3 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定按照TIANGEN?細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA。用細(xì)菌基因組DNA作為模板，細(xì)菌16S rDNA基因通用引物(由生工生物公司合成)擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 500 bp。引物序列為：上游引物27F：5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′，下游引物1 492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。配制PCR反應(yīng)體系(25 μL)：模板DNA 2 μL，TaqMIX(2×)12.5 μL，上、下游引物各1 μL、ddH2O 8.5 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物在110 V條件下，1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，并將PCR產(chǎn)物送至生工生物公司測序后在NCBI中比對，確定分離菌株的種屬。

1.4 分離菌的同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建GenBank中選取1株Kpn、3株腸桿菌科的不同屬的16S rDNA序列和分離菌株的16S rDNA序列，使用MEGA 7.0軟件，采用Neighbor-joining法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹并分析其同源性。

1.5 菌株的生化鑒定將純化好的細(xì)菌接種于MH肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，使用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管進(jìn)行分離菌株的生化試驗，其操作按文獻(xiàn)[15]方法進(jìn)行。

1.6 產(chǎn)ESBLs-Kpn菌株的表型鑒定將分離菌株按0.5麥?zhǔn)蠞舛染鶆蛲坎加贛H平板上進(jìn)行ESBLs初篩和確證試驗，具體操作按文獻(xiàn)[16]方法進(jìn)行。

1.7 ESBLs-Kpn菌株的基因型鑒定將表型鑒定篩選出的陽性菌株采用TIANGEN?細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株DNA。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：模板DNA 2 μL，TaqMIX(2×)12.5 μL，上、下游引物(各引物序列見表1[16])各1 μL、ddH2O 8.5 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，72℃延伸10 min，各退火溫度見表1[16]。取擴(kuò)增產(chǎn)物在110 V條件下，1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，將PCR產(chǎn)物送至生工生物公司測序后并在NCBI中比對，確定相應(yīng)的基因型。

表1 ESBLs基因引物序列信息

2 結(jié)果

2.1 菌株的分離培養(yǎng)MIAC培養(yǎng)基上菌落，較大、圓凸起、邊緣紅色中間粉白色的具有一定黏度的菌落判定為疑似Kpn(圖1A)；顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征為兩端鈍圓長短不一的革蘭陰性桿菌(圖2B)。本試驗從390份大熊貓新鮮糞便中根據(jù)形態(tài)和革蘭染色初步判斷出362株疑似Kpn菌株。

圖1 分離菌株在MIAC培養(yǎng)基上的生長特征(A)和革蘭染色特征(B,1 000×)

2.2 分離菌株的16S rDNA結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果通過PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測在1 500 bp大小處出現(xiàn)條帶(圖2)，將該產(chǎn)物送生工生物公司測序后在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，選取相似度大于98%且為Kpn的結(jié)果?；蜻M(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，分離菌株與Kpn(NR036794.1)的同源性最高，與大腸桿菌(NR024570.1)和志賀菌(NR104901.1)同源性較低，表明該菌株為Kpn(圖3)。對362株疑似Kpn菌株進(jìn)行16S rDNA鑒定并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行同源性分析鑒定出211株Kpn。

M.DL2000 DNA Marker;1.為生理鹽水作為陰性對照;2～9.樣品

圖3 部分分離菌株16S rDNA基因序列發(fā)育進(jìn)化樹

2.3 生化鑒定結(jié)果通過微量生化反應(yīng)管對211株菌株進(jìn)行生化測定，結(jié)果如表2所示，分離菌株能發(fā)酵麥芽糖、蕈糖、蔗糖、甘露醇、產(chǎn)酸產(chǎn)氣；尿素、葡萄糖試驗結(jié)果呈陽性；硫化氫、乳糖試驗呈陰性。將生化試驗結(jié)果比對伯杰細(xì)菌鑒定手冊[15]，判定211株分離菌株均為Kpn。

表2 分離菌株的生化試驗結(jié)果

2.4 ESBLs-Kpn的表型鑒定結(jié)果確定為Kpn后通過初篩試驗和確證試驗對ESBLs-Kpn進(jìn)行表型鑒定。初篩試驗中，從211株Kpn中鑒定出31株疑似ESBLs-Kpn(表3和圖4A)。31株疑似陽性菌ESBLs確證試驗結(jié)果顯示，菌株編號為3,30,31的菌株鑒定為ESBLs陽性菌株，分離率為1.42%(表4和圖4B)。對3株ESBLs-Kpn菌株采用PCR技術(shù)進(jìn)行基因型鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測在CTX-M(593 bp)、CTX-M-1(415 bp)、TEM(800 bp)、SHV(713 bp)處出現(xiàn)條帶(圖5)；CTX-M2、CTX-M8、CTX-M9、CTX-M25、GES、PER、VEB、OXA-1、OXA-2在相應(yīng)大小處未出現(xiàn)條帶。將陽性產(chǎn)物送生工生物公司測序后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對確定基因型得出，3號和31號菌株基因型為blaSHV+blaTEM+blaCTX-M-1，30號菌株基因型為blaSHV+blaCTX-M-1。

M.DL2000 DNA Marker;1.3號樣品;2.31號樣品;3.30號樣品;4.陰性對照

表3 ESBLs-Kpn初篩試驗結(jié)果

表4 ESBLs-Kpn確證試驗結(jié)果

CRO.頭孢曲松;CTX.頭孢噻肟;CAZ.頭孢他啶;CTX/CAL.頭孢噻肟/克拉維酸

3 討論

Kpn可引起大熊貓腸炎和敗血癥[17-18]。ESBLs則是由質(zhì)粒介導(dǎo)的一種β-內(nèi)酰胺酶，可以抑制多數(shù)青霉素和頭孢菌素，在臨床上增加了Kpn感染后治療的難度。本試驗從390份大熊貓新鮮糞便中通過MIAC選擇培養(yǎng)基分離出362株疑似Kpn菌株，通過PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA片段后測序比對，結(jié)合生化鑒定管結(jié)果最終鑒定出Kpn 211株，這提示大熊貓腸道中普遍存在Kpn；對這211株Kpn種進(jìn)行ESBLs初篩和確證試驗，最后分離出3株ESBLs表型陽性的Kpn，分離率為1.42%。在醫(yī)院臨床樣本中，ESBLs-Kpn的分離率為24%～35%[19-20]，而在大熊貓圈養(yǎng)種群中，ESBLs-Kpn的分離率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于人類醫(yī)學(xué)臨床樣本，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能有2個方面：一是人類醫(yī)學(xué)臨床樣本來自于可能已經(jīng)接受了抗生素治療的患病個體導(dǎo)致菌體耐藥性增加，而本研究中收集的樣本絕大部分為正常大熊貓個體糞便；二是在大熊貓細(xì)菌感染的臨床治療過程中，抗生素的使用頻率和種類可能明顯少于人類。但是，在大熊貓圈養(yǎng)種群中已出現(xiàn)了ESBLs-Kpn，因此，在圈養(yǎng)大熊貓臨床治療過程中應(yīng)合理使用抗生素以避免ESBLs菌株的進(jìn)一步增加。

全球目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)200多種ESBLs基因型[21]。根據(jù)各個酶特性的不同，大致分為SHV型、CTX-M型、TEM型、OXA型和其他類型，如PER、VEB、GES、SPO等[22]。由于抗菌藥物的使用差異及菌株流行的原始地域性差異，所以不同地區(qū)流行的ESBLs基因型和耐藥特征都存在一定的差異[9]。西班牙產(chǎn)ESBLs菌株具有高度多樣性，但以CTX-M-9、CTX-M-10、CTX-M-14及TEM-4型最多見[23]；英國以TEM-10和TEM-12為主[24]；韓國以SHV-12、TEM-52和SHV-2a為主；OXA型主要分布于法國及土耳其；美國則常見的為CTXM14、CTX-M-9、CTX-M-3和SHV-12等；我國的ESBLs以CTX-M型及SHV型為主[25-26]。本試驗中所分離的ESBLs-Kpn基因型主要表現(xiàn)出混合基因型的特征，即2株ESBL-Kpn基因型為blaSHV+blaTEM+blaCTX-M-1，1株的基因型為blaSHV+blaCTX-M-1，且均含有CTX-M和SHV基因型，說明在圈養(yǎng)大熊貓中出現(xiàn)的ESBLs基因型與國內(nèi)人群中流行的ESBLs基因型有高度的一致性。

綜上可知，本試驗從390份大熊貓新鮮糞便中分離出3株ESBLs-Kpn陽性菌株且表現(xiàn)出混合基因型的特征，由此說明ESBLs-Kpn菌株已在大熊貓圈養(yǎng)種群中出現(xiàn)。鑒于ESBLs-Kpn菌株感染后的治療難度和造成的危害，在大熊貓等野生動物的臨床治療中應(yīng)合理使用抗生素，以避免ESBLs-Kpn菌株的進(jìn)一步增加。