翟俊瓊，單 芬，李婉萍，周 妞，羅滿林，陳 武*

(1.廣州動物園 廣州市野生動物研究中心，廣東 廣州 510070；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

禽博爾納病毒(avian Borna virus，ABV)是單股、不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒[1]，基因組全長8.9 kb，病毒粒子呈球形，直徑約90 nm[2]，基因組編碼6種蛋白：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、與磷蛋白重疊的小蛋白(X)、基質(zhì)蛋白(M)、包膜蛋白(G)和RNA依賴的RNA聚合酶(L)[3]。2008年，ABV首次被鑒定為引起一種致命的鸚鵡神經(jīng)疾病-腺胃性擴張癥(proventricular dilatanon disease,PDD)的病原體[4-5]；隨后，在水禽和鳴禽中也發(fā)現(xiàn)該病毒[6-10]。到目前為止，已經(jīng)從超過80種鳥類、50種鸚鵡上檢測到8種不同基因型ABV[11-15]。ABV主要引起患病鳥類出現(xiàn)腹部腫大、體質(zhì)量減輕、消化不良、共濟失調(diào)等癥狀，病死率很高，導(dǎo)致大量圈養(yǎng)鳥類包括瀕危物種的死亡，對養(yǎng)殖業(yè)以及供觀賞類的服務(wù)業(yè)造成極大威脅[16-17]。目前，還沒有有效的方法來治療ABV感染，只能進(jìn)行對癥治療和管理[12,18]。

國內(nèi)對鸚鵡源禽博爾納病毒(parrot Bornavirus，PaBV)的相關(guān)報道甚少[19]，本試驗通過觀察疑似感染ABV的鸚鵡生前體征、死后剖檢、病理切片以及RT-PCR檢測PaBV核酸，最終證實鸚鵡感染PaBV；選取1份陽性樣本擴增全基因組序列，通過分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系和核苷酸同源性，了解該毒株的親緣關(guān)系及流行趨勢，為我國PaBV的防控提供一定的理論基礎(chǔ)和參考。

1 材料與方法

1.1 病料收集于上海、成都、廣州、佛山等養(yǎng)殖場的死亡鸚鵡,其中太陽錐尾鸚鵡4只、琉璃金剛鸚鵡1只、藍(lán)眼巴丹鸚鵡2只、黃頭亞馬遜鸚鵡1只、紅綠金剛鸚鵡1只和灰鸚鵡1只。

1.2 主要試劑病毒RNA抽提試劑盒購自AXYGEN，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD19-T載體、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa，膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA，PCR反應(yīng)酶購自Thermo Fisher。

1.3 疑似PaBV感染的臨床癥狀以及病理觀察觀察并記錄疑似PaBV感染的鸚鵡生前癥狀以及死亡剖檢變化，并取病變較嚴(yán)重的組織做病理切片觀察。

1.4 引物的設(shè)計與合成參照GenBank上發(fā)表的PaBV序列，設(shè)計合成1對用于擴增PaBV的通用引物(PaBV-F和PaBV-R)和用于擴增PaBV4的全基因序列引物7對(表1)。

表1 RT-PCR擴增所用的引物

1.5 PaBV的RT-PCR檢測取疑似感染ABV的鸚鵡腺胃、腦，參照病毒RNA/DNA抽提試劑盒說明書提取經(jīng)研磨的組織RNA/DNA。根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將提取的病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用檢測引物PaBV-F和PaBV-R進(jìn)行檢測。PCR反應(yīng)體系：Mix 12.5 μL,PCR Forward Primer 1 μL，PCR Reverse Primer 1 μL，cDNA 1 μL，Nuclease-free Water 9.5 μL。反應(yīng)程序：95℃ 4 min；95℃ 30 s，55℃(根據(jù)各引物而定)30 s，72℃ 45 s(1 kb/min)，35個循環(huán)；72℃ 10 min。1%電泳觀察試驗結(jié)果，并將陽性產(chǎn)物送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序，將測序結(jié)果通過NCBI上的Blast比對，看是否與PaBV最接近，然后下載各個不同基因型的PaBV序列，建立遺傳進(jìn)化樹進(jìn)行分型。

1.6 全基因組的克隆與測序同1.5方法，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，分別用引物PaBV-4-F1/PaBV-4-R1～PaBV-4-F7/PaBV-4-R7進(jìn)行全基因序列擴增，電泳觀察結(jié)果。切膠回收陽性條帶，將產(chǎn)物與pMD19-T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，將鑒定為陽性的菌液送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。

1.7 序列比對與分析將全基因測序結(jié)果通過NCBI的BLAST進(jìn)行比對，觀察其是否是PaBV-4的序列，正確序列進(jìn)行拼接，將得到的PaBV-4全基因序列上傳至NCBI，獲得登錄號。從NCBI上下載PaBV相關(guān)序列，應(yīng)用DNAStar和MEGA6.06軟件對PaBV各個基因型進(jìn)行同源性比較和遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀以及病理觀察結(jié)合臨床癥狀和剖檢變化(表2)，初步懷疑為PaBV，后進(jìn)一步進(jìn)行實驗室診斷。取病變較嚴(yán)重的腺胃(琉璃金剛鸚鵡)做病理切片觀察，腺胃黏膜上皮細(xì)胞變性壞死，可見大量炎細(xì)胞浸潤，胃腺結(jié)構(gòu)紊亂(圖1)。

表2 臨床癥狀和剖檢變化

圖1 死亡鸚鵡腺胃病理切片圖

2.2 PABV的RT-PCR檢測與分型PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果顯示擴增出約350 bp條帶(圖2)，與目的基因大小相符，將產(chǎn)物送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序，序列比對結(jié)合進(jìn)化樹分析(圖3)證實10只鸚鵡中有6只感染PaBV，其中4只太陽錐尾鸚鵡和1只藍(lán)眼巴丹鸚鵡例感染PaBV-4，1只琉璃金剛鸚鵡感染PaBV-5，其余4只檢測均呈陰性，排除ABV(表3)。

表3 10只鸚鵡PaBV檢測情況

M.DL2000 DNA Marker；1～8.樣品cDNA擴增產(chǎn)物

圖3 基于M基因部分序列的遺傳進(jìn)化分析

2.3 全基因組的克隆與測序通過RT-PCR方法分7個片段擴增被鑒定為PaBV-4的全基因組，電泳得到預(yù)期大小目的條帶(圖4)，切膠回收目的片段，將回收產(chǎn)物與pMD19-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至DH5α進(jìn)行單菌落搖菌培養(yǎng)，將鑒定為陽性的菌液送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。拼接獲得的7個片段，得到PaBV-4 GZ 2019株全長8 915 bp的基因組，與GenBank上公布的PaBV-4基因組大小一致，將該序列上傳至GenBank，得到登錄號為MT258650。

1～7.分別為引物PaBV-4-F1/PaBV-4-R1～PaBV-4-F7/PaBV-4-R7的擴增產(chǎn)物；M.DL2000 DNA Marker

2.4 序列分析

2.4.1同源性分析 應(yīng)用DNAStar軟件里的MegAlign對本研究中獲得的PaBV-4全基因序列與GenBank上下載的13個毒株的PaBV序列(部分序列接近全基因)進(jìn)行同源性比較，結(jié)果(圖5,6)顯示，本試驗所得到的GZ 2019毒株與參考的13個毒株的核苷酸相似性為64.8%～99.6%，氨基酸相似性為68.7%～99.8%。其中，與同為PaBV-4的4個參考毒株的核苷酸相似性為94.7%～99.8%，氨基酸相似性為98.0%～99.8%；與2009年從美國藍(lán)黃金剛鸚鵡大腦檢測的PaBV-4毒株NM_20(接近全基因)核苷酸相似性最高，為99.6%；與2008年從德國藍(lán)黃金剛鸚鵡檢測的PaBV-4毒株6758氨基酸相似性最高，為99.8%；與2015年從美國的鳳頭鸚鵡檢測到的PaBV-5毒株Cockg5相似性最低，核苷酸相似性為64.8%，氨基酸相似性為68.7%。

2.4.2遺傳進(jìn)化分析 應(yīng)用MEGA6.06軟件對本試驗獲得的PaBV-4全基因序列與GenBank上下載的13個毒株的PaBV序列(部分序列接近全基因)進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析(圖7)，結(jié)果顯示GZ 2019病毒株與M14、AG5、6758親緣關(guān)系最近，同屬一個小的分支，其次是NM_01，與PaBV-5各分離株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖6 本試驗獲得的PaBV-4與參考的13株P(guān)aBV氨基酸序列同源性比較

圖7 基于全基因序列的遺傳進(jìn)化樹

3 討論

自2008年首次在腺胃擴張癥的鸚鵡中發(fā)現(xiàn)ABV以來，其多感染鸚鵡、金絲雀等鳥類[20]，病死率高，使各類珍禽受到很大威脅。由于廣泛的商貿(mào)活動，使得ABV在鳥類中持續(xù)傳播，到目前為止，在世界各國廣泛分布，巨嘴鳥、加拿大鵝、鴕鳥、番鴨、貓頭鷹、鶩、密雀、織雀及其他雀形目鳥類已經(jīng)檢出該病毒，家禽中鴨、鵝、鴿也攜帶該病毒，甚至棕尾虹雉也發(fā)現(xiàn)感染PaBV-4[21]。有研究表明，ABV可通過分泌物排出，因此糞便、尿液甚至羽毛污染物被認(rèn)為是可疑的污染源[6,13]，糞便、羽毛也是最易獲取的樣本。然而也有研究證實，鳥類只是間歇性傳播該病毒[13]，因此應(yīng)多次采樣進(jìn)行檢測才能有效減少假陰性。本試驗是通過檢測死亡鸚鵡的腦和腺胃來判斷有無感染ABV，若后續(xù)對群體進(jìn)行該病毒的監(jiān)測，可多次取糞便、羽毛作為樣本進(jìn)行檢測。腺胃擴張癥、神經(jīng)癥狀是PaBV感染的典型癥狀[22-23]，在本試驗中，多數(shù)檢測到ABV陽性的鸚鵡表現(xiàn)出腺胃擴張、撞墻等癥狀。不同地區(qū)ABV流行毒株序列分析顯示，各毒株有發(fā)生基因突變，但不同基因型的地理分布還未發(fā)現(xiàn)規(guī)律性，PaBV共有8個不同基因型，有研究報道，以PaBV-2、PaBV-4較常見[4,6,11,24]，本試驗中檢測到的6例，通過基因分型顯示(圖2)有5例為PaBV-4型，僅1例為PaBV-5型，這可能與采樣數(shù)量和地域有關(guān)，其流行病學(xué)還有待進(jìn)一步研究調(diào)查。

到目前為止，國內(nèi)有報道鸚鵡感染ABV的案例，但僅限于檢測，本試驗對檢測到的PaBV同時進(jìn)行了分型，并對檢測到的1株P(guān)aBV-4進(jìn)行全基因測序和分析，結(jié)果顯示GZ 2019株全基因組全長8 915 nt，編碼6種蛋白，與NM_20株核苷酸同源性最高，僅相差35個核苷酸，與6758株氨基酸同源性最高，相差6個氨基酸，同源性比較結(jié)果顯示，GZ 2019毒株與同為PaBV-4的4個參考宿主核苷酸相似性為94.7%～99.8%，氨基酸相似性為98.0%～99.8%，說明該毒株具有較高的保守性，這一結(jié)果與參考文獻(xiàn)[23]的結(jié)果一致。遺傳進(jìn)化分析顯示，GZ 2019毒株與M14、AG5、6758親緣關(guān)系最近，可能由同一祖先進(jìn)化而來。

總之，本試驗豐富了國際上關(guān)于PaBV的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，為后續(xù)更深入的研究該病毒的診斷方法、疫苗研發(fā)以及致病機理奠定了良好的試驗基礎(chǔ)。