趙巧雅，宋丹丹，劉麗萍，郭效珍，劉存霞，盛 媛，史玉穎，黃 兵*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 家禽研究所，山東 濟南 250023；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山東 泰安 271018)

兔輪狀病毒(lapine rotavirus，LaRV)是呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，可感染各日齡兔尤其是1～2月齡幼兔[1]，造成腹瀉[2]。該病傳播迅速，發(fā)病急、發(fā)病率高，四季均可發(fā)生。兔腸冠狀病毒(rabbit enteric coronavirus，RECV)為冠狀病毒科冠狀病毒屬病毒，最早于1980年在加拿大腹瀉癥狀幼兔身上發(fā)現(xiàn)[3]，后在健康兔中也觀察到該病毒[4]。兩者均是引起仔兔腹瀉的重要病原，臨床癥狀極為相似且存在混合感染情況，僅僅根據(jù)臨床上的方法難以進行鑒別和診斷。目前，已有RT-PCR、熒光定量RT-PCR及LAMP等方法對牛輪狀病毒[5]、豬輪狀病毒[6]、牦牛源輪狀病毒[7]、豬冠狀病毒[8]、大鼠冠狀病毒[9]等進行檢測，而關(guān)于LaRV和RECV的雙重RT-PCR檢測方法在我國尚未見報道。

輪狀病毒基因組編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白和5種非結(jié)構(gòu)蛋白。NSP3基因較為保守，人輪狀病毒[10]、豬輪狀病毒[11]等均針對NSP3基因建立了相關(guān)檢測方法。N蛋白是一種堿性磷蛋白，是冠狀病毒粒子主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，既具有高度保守性,又具有很強的免疫原性，在病毒RNA合成中發(fā)揮作用[12]，常用于抗原檢測[13]。據(jù)報道，檢測臨床樣本時N基因檢測的靈敏度比ORF1b基因高10倍左右[14]。因此，本試驗針對輪狀病毒的NSP3基因、冠狀病毒N基因設(shè)計特異性引物，建立了LaRV和RECV雙重RT-PCR檢測方法，并在山東部分規(guī)模化兔場采集樣品進行檢測，為LaRV和RECV的疫情監(jiān)控、臨床檢測及流行病學(xué)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品、病毒及菌株2020年4-7月，從10個山東規(guī)?；脠霾杉?07份腹瀉兔糞便樣品，所有樣品單獨分裝，4℃保存送至實驗室檢測。LaRV(J20180417)、RECV(J20190039)及兔瘟(rabbit haemorrhagic disease virus，RHDV--J20181263)、大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli--CPCC120001)、魏氏梭菌(Clostridiumwelchii，Cl.welchii-J20171208)、沙門菌(Salmonella，SE-CMCC-50041)、泰澤氏菌(Bacilluspiliformis，BP-J20160243)、巴氏桿菌(Pasteurella，PS-BNCC132368)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus--CPCC140575)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa，PA-ATCC9027)、鏈球菌(Streptococcus，SS-BNCC102637)、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica，Bb--J20180503)陽性樣品均為標(biāo)準(zhǔn)菌株或由本實驗室鑒定保存。

1.2 主要試劑DL2000 DNA Marker、PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA提取試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pMD18-T克隆載體購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒均購自Axygen公司。

1.3 引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank上發(fā)表的LaRV和RECV病毒的保守序列，利用Premier 5.0軟件對該2種病毒的基因保守區(qū)域分別設(shè)計1對引物，預(yù)計擴增LaRV的NSP3基因部分片段291 bp，預(yù)計擴增RECV的N基因部分片段163 bp。引物由華大基因生物科技有限公司合成，引物信息見表1。

表1 引物信息

1.4 核酸提取及反轉(zhuǎn)錄LaRV、RECV、RHDV陽性樣品及臨床樣品(用生理鹽水按1∶10混懸)4℃、8 000 r/min離心5 min，上清用于核酸提取。病毒RNA的提取參照提取試劑盒說明書進行，cDNA的反轉(zhuǎn)錄參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行，產(chǎn)物-20℃保存。細(xì)菌陽性樣品參照提取試劑盒提取核酸，產(chǎn)物-20℃保存。

1.5 PCR擴增對反應(yīng)的引物、模板等用量進行優(yōu)化和多重重復(fù)試驗后確定最佳反應(yīng)體系。取5 μL擴增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 特異性試驗利用本試驗建立的反應(yīng)體系分別對LaRV和RECV、RHDV、E.coli、Cl.welchii、SE、BP、PS、S.aureus、PA、SS、Bb陽性樣品的核酸及水進行RT-PCR擴增，并電泳驗證。

1.7 敏感性試驗將陽性樣品進行單一RT-PCR擴增，回收RT-PCR擴增產(chǎn)物，分別與pMD18-T載體連接，構(gòu)建陽性質(zhì)粒，并測定陽性質(zhì)粒的濃度，LaRV和RECV單一質(zhì)粒測定濃度后，將陽性質(zhì)粒10倍梯度稀釋后進行多重RT-PCR的敏感性試驗。

1.8 臨床樣品檢測用本試驗建立的方法對2019年以來從山東部分地區(qū)采集的107份兔腹瀉樣品進行檢測，并與單一RT-PCR檢測結(jié)果進行比較。

2 結(jié)果

2.1 雙重RT-PCR體系的構(gòu)建及優(yōu)化對退火溫度及引物濃度等條件進行優(yōu)化，當(dāng)LaRV和RECV引物終濃度均為0.125 μmol/L、退火溫度為52℃、模板比例為1∶1時，2條擴增條帶均清晰。最終確定該多重RT-PCR體系：Premix Taq 10 μL，LaRV和RECV的上、下游引物各0.25 μL，模板1 μL，無菌去離子水補足至20 μL。最佳反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 20 s，52℃ 20 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。

以LaRV和RECV的混合質(zhì)粒為模板，用建立的多重RT-PCR同時擴增，以水做陰性對照。結(jié)果顯示，雙重RT-PCR分別擴增出約291 bp和163 bp的目的片段(圖1)。擴增的目的片段均經(jīng)測序驗證。

M.DL2000 DNA Marker；1.LaRV、RECV雙重RT-PCR產(chǎn)物；2.LaRV單一RT-PCR產(chǎn)物；3.RECV單一RT-PCR產(chǎn)物；4.陰性對照

2.2 特異性試驗用本試驗建立的雙重RT-PCR方法檢測兔常見腹瀉病原的陽性樣品,結(jié)果顯示具有良好的特異性(圖2)。

M.DL2000 DNA Marker；1.LaRV、RECV雙重RT-PCR產(chǎn)物；2.陰性對照；3.J20181263；4.CPCC120001；5.J20171208；6.CMCC50041；7.J20160243；8.BNCC132368；9.CPCC140575；10.ATCC9027；11.BNCC102637；12.J20180503

2.3 敏感性試驗本試驗所建立的雙重RT-PCR對LaRV的最低檢出限為2.73×105拷貝/μL,對RECV的最低檢出限為1.22×104拷貝/μL(圖3)。

M.DL2000 DNA Marker；1～8.LaRV 2.73×1011～104 拷貝/μL，RECV1.22×1011～104 拷貝/μL；9.陰性對照

2.4 臨床樣本檢測分別用建立的雙重RT-PCR和單一RT-PCR對107份樣品進行檢測，部分檢測結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，LaRV的陽性樣品11份，陽性率為10.28%；RECV 的陽性樣品8份，陽性率為7.48%；并檢出共感染的樣品2份，陽性率為1.87%(表2)。雙重RT-PCR與單一RT-PCR對比，檢測結(jié)果一致，符合率100%。

表2 臨床樣品的檢測結(jié)果

M.DL2000 DNA Marker；1～12.臨床樣品(3-8、3-9、3-10、4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9)；13.陰性對照

3 討論

兔輪狀病毒和兔腸道冠狀病毒作為一種急性消化道傳染病，均可導(dǎo)致仔兔腹瀉。發(fā)病率高且較難根除[15]，易與大腸桿菌病、魏氏梭菌病等相混淆[1]，僅靠臨床鑒別診斷難以作出判定。目前國內(nèi)尚未報道關(guān)于兔輪狀病毒、冠狀病毒的雙重RT-PCR檢測方法，傳統(tǒng)的檢測方法如電鏡觀察[16]、病毒分離鑒定[17]、RNA聚丙烯酰胺電泳(RNA-PAGE)[14]、血清學(xué)試驗[15]等存在費時費力、特異性差、試驗周期長等不足[18]，因此快速準(zhǔn)確的診斷技術(shù)對該病顯得尤為重要。本試驗建立的雙重RT-PCR方法，能夠同時檢測2種病原，且特異性良好。該方法對LaRV的最低檢出限為2.73×105拷貝/μL、對RECV的最低檢出限為1.22×104拷貝/μL，敏感性較高。應(yīng)用本方法對臨床樣品檢測，共檢出17份陽性樣品，與單一RT-PCR檢測相比符合率100%，表明本方法在對臨床樣品檢測中具有良好的應(yīng)用價值。

有關(guān)其他種源輪狀病毒、冠狀病毒相關(guān)多重RT-PCR的檢測方法已有相關(guān)報道。王文佳等[19]建立的牛冠狀病毒、牛諾如病毒和牛嵴病毒多重PCR方法中對BCoV的檢出限為9.51×105拷貝/μL；韓麗等[20]建立的豬Delta冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒雙重RT-PCR診斷方法對冠狀病毒檢出限為3.14×103拷貝/μL；蒲翠敏等[21]在PEDV、TGEV和PoRV三重PCR檢測方法中對輪狀病毒的檢出限為1×103拷貝/μL。結(jié)果表明，本試驗建立的檢測方法敏感性良好。

關(guān)于兔其他腹瀉病原及其他常見病原的相關(guān)檢測方法的報道，許國洋等[22]建立了銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的檢測方法，林穎崢等[23]建立了兔病毒性出血癥的快速檢測方法。本研究建立的檢測方法彌補的兔輪狀病毒、冠狀病毒檢測方法的缺乏，可以為該2種病原的快速檢測和流行病學(xué)調(diào)查等研究提供有力的技術(shù)支持。