高亞桃，王紫燕，馬亞賓，蔣桂娥，倪俊卿，張明勇，李 妍，武二斌，秦建華*，趙月蘭*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001;2.河北省畜牧良種工作站，河北 石家莊 050061；3.懷來縣畜牧水產(chǎn)局，河北 張家口 075400;4.張家口市畜牧技術(shù)推廣站，河北 張家口 075000)

牛呼吸道疾病綜合征(bovine respiratory disease complex，BRDC)是一類多病原多因素的傳染性疾病，可引起牛肺炎、運(yùn)輸熱、支氣管炎等病癥[1]，引發(fā)該病的病原種類繁多，包括牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)、牛呼吸道合胞體病毒(bovine respiratory syncytial virus，BRSV)、牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus stype 3,BPIV3)、牛冠狀病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhoea virus，BVDV)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae，Kp)、牛支原體(Mycoplasmabovis,MYPB)和溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica，Mh)等[2-6]。近年來，該病在國內(nèi)外常見報(bào)道，多呈地方性或散發(fā)性流行，嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展[7]。此外，此病多病原混合感染的病原種類增加、病原體之間的相互作用，可導(dǎo)致病癥加重、病情復(fù)雜，使得該病的診斷和治療更加困難，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8]。為了解河北省部分地區(qū)規(guī)?；膛鯞RDC病原種類，本試驗(yàn)自河北省不同地區(qū)不同牛場奶牛呼吸道疾病臨床病例采集病料，進(jìn)行病原的分離和鑒定。

1 材料與方法

1.1 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank公布的 BVDV、IBRV、BRV、BPV、Pm、Kp、MYPB和Mh參考基因組序列，利用 Primer5 軟件設(shè)計(jì)8對特異性引物，由上海生物工程股份有限公司合成。引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息

1.2 被檢樣品自河北省張家口、秦皇島、保定、衡水、滄州、石家莊、邯鄲等地區(qū)規(guī)?；膛霾杉膛：粑兰膊∨R床病例鼻拭子樣品及死亡奶牛的肺臟組織樣品，共計(jì)56份。將所采集病料用IBRV、BRSV、BPIV3、BCV和BVDV基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR檢測結(jié)果為IBRV和BVDV陽性，初篩陽性的樣品進(jìn)行IBRV和BVDV分離鑒定。用Pm、Kp、MYPB和Mh基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，初檢結(jié)果Pm、Kp陽性，將篩陽性的樣品進(jìn)行細(xì)菌Pm和Kp分離鑒定。

1.3 毒株和細(xì)胞BVDV標(biāo)準(zhǔn)毒株(Oregon C24V)、BVDV標(biāo)準(zhǔn)陽性和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、IBRV標(biāo)準(zhǔn)毒株(HVRI-IBRV-004)、IBRV標(biāo)準(zhǔn)陽性和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、MDBK細(xì)胞等，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.4 培養(yǎng)基和主要試劑細(xì)菌分離用培養(yǎng)基、生化鑒定常規(guī)試劑及PCR試劑，均購自當(dāng)?shù)厣锕净蚧瘜W(xué)試劑公司。

1.5 BVDV和IBRV的分離與鑒定

1.5.1病毒的分離培養(yǎng) 初檢IBRV和BVDV陽性樣品采取常規(guī)方法進(jìn)行樣品處理。取1份鼻拭子樣品，加入適量Hanks 處理液；1份肺臟研磨樣品，加4倍生理鹽水，用振蕩器振蕩混勻，反復(fù)凍融后以3 000 r/min離心15 min，上清液用0.22 μm微孔濾器過濾除菌，用于病毒的分離。

待MDBK傳代細(xì)胞長成單層后，用PBS洗3次，按細(xì)胞量的1/10將被檢樣品處理液接種于MDBK細(xì)胞，經(jīng)37℃吸附2 h后加入細(xì)胞維持液，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每日鏡檢觀察細(xì)胞病變(CPE)，5 d后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，備用。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞和接標(biāo)準(zhǔn)株OregonC24V、HVRI-IBRV-004的細(xì)胞作對照。盲傳3代。待90%～95%的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變(CPE)時(shí)收取病毒培養(yǎng)物，倒掉大部分細(xì)胞培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次，3 000 r/min離心5 min，取病毒上清液經(jīng)PEG(聚乙二醇)和NaCl濃縮、TNE緩沖液洗脫，制備PEG濃縮病毒。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2病毒的PCR鑒定及測序鑒定 BVDV的鑒定采用RT-PCR方法，IBRV的鑒定采用PCR方法。利用病毒DNARNA提取試劑盒(全式金生物科技有限公司)提取病毒基因組DNARNA,具體操作步驟按說明書進(jìn)行。以提取的基因組RNA為模板，用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。病毒基因組RNA的反轉(zhuǎn)錄具體操作步驟按說明書進(jìn)行。以BVDV的cDNA為模板，BVDV特異性引物P1/P2(表1)進(jìn)行BVDVE0基因片段的PCR擴(kuò)增。以提取的IBRV DNA為模板，用IBRV特異性引物P3/P4(表1)進(jìn)行IBRVgB基因片段的PCR擴(kuò)增。分別取5 μL PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，并對測序結(jié)果進(jìn)行序列分析，與GenBank上所公布的部分其他毒株的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，并通過系統(tǒng)發(fā)生樹分析該分離株與其他毒株之間的親緣關(guān)系。

1.6 Pm與Kp的分離與鑒定

1.6.1Pm與Kp的分離培養(yǎng) 無菌取初檢Pm與Kp陽性鼻拭子樣品，肺臟內(nèi)部組織剪碎、研磨，加入適量Hanks液勻漿處理，用于細(xì)菌的分離鑒定。取鼻拭子與肺臟處理液，分別劃線接種于綿羊血瓊脂平板培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取血平板上可疑單菌落進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，觀察是否符合Pm的形態(tài)特征。取陽性菌落接種于5 mL 含犢牛血清的TBS液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，純化培養(yǎng)后進(jìn)行下一步生化鑒定。

挑取麥康凱培養(yǎng)基上可疑單菌落進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，觀察是否符合Kp形態(tài)特征。取陽性菌落接種于5 mL含犢牛血清的TBS液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，再次接種于西蒙檸檬酸鹽培養(yǎng)基上，37℃鑒別培養(yǎng)48 h后，挑取單一菌落進(jìn)一步鏡檢，觀察是否符合Kp的形態(tài)特征，取陽性培養(yǎng)液純化培養(yǎng)后進(jìn)行下一步生化鑒定。

1.6.2Pm與Kp分離菌株的生化鑒定 取Pm純培養(yǎng)物接種于糖微量發(fā)酵管(葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖)，進(jìn)行糖發(fā)酵。同時(shí)進(jìn)行甲基紅(MR)試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、麥康凱試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)及β溶血性試驗(yàn)等，37℃培養(yǎng) 24～72 h，觀察并記錄結(jié)果。

取Kp純培養(yǎng)物分別進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、枸鹽酸鹽利用試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、丙二酸鹽試驗(yàn)、尿素分解試驗(yàn)，觀察并記錄結(jié)果。

1.6.3Pm與Kp分離菌株P(guān)CR鑒定與序列分析 取Pm和Kp分離株細(xì)菌純培養(yǎng)物，進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取，參照細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書(北京天根生化科技有限公司)進(jìn)行具體操作。以提取的細(xì)菌DNA為模板，分別用Pm特異性基因kmt引物F1/F2和Kp特異性基因phoE引物F3/F4(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。膠回收純化目的片段，具體按照DNA快速純化回收試劑盒說明書(北京天根生化科技有限公司)進(jìn)行。純化后的PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，應(yīng)用DNAstar軟件分別對kmt和phoE基因核苷酸序列進(jìn)行分析。

1.6.4Pm與Kp分離菌的致病性檢測 取健康小鼠20只，隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對照組，每組10只。將肉湯培養(yǎng)的待測菌液(5×108CFU/mL)腹腔接種于試驗(yàn)組小鼠，0.2 mL/只；對照組小鼠注射等量生理鹽水，觀察72 h。剖檢死亡小鼠，并記錄病理變化。無菌采集死亡小鼠對心臟和肝臟，涂片、染色、鏡檢及細(xì)菌分離培養(yǎng)，方法同前。

1.6.5Pm與Kp分離菌的藥物敏感性試驗(yàn) 選取16種常用抗生素藥敏片，按世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的 Kirby-Barer法進(jìn)行，取待檢菌液均勻涂布瓊脂平板表面，待菌液吸附后，將各種定量濃度抗菌藥圓紙片分別貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，根據(jù)藥物紙片有無抑菌圈及其大小來判斷該菌對各種藥物的敏感程度。

2 結(jié)果

2.1 BVDV和IBRV的分離培養(yǎng)結(jié)果

2.1.1BVDV的分離培養(yǎng)結(jié)果 初檢BVDV陽性樣品處理液接種于MDBK細(xì)胞，37℃培養(yǎng)，盲傳至第3代時(shí)開始出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、細(xì)胞核固縮到邊緣、細(xì)胞內(nèi)空泡、脫落、拉網(wǎng)、空斑，與BVDV標(biāo)準(zhǔn)毒株OregonC24V結(jié)果一致(圖1)。將分離毒株命名為HB-BDZ。

A.正常MDBK細(xì)胞;B.分離毒(CPE);C.OregonC24V(CPE)

2.1.2IBRV的分離培養(yǎng)結(jié)果 初檢IBRV陽性樣品處理液接種于MDBK細(xì)胞，37℃培養(yǎng)，連續(xù)盲傳 3 代篩選出病變穩(wěn)定的毒株，可見細(xì)胞皺縮變圓，繼而細(xì)胞出現(xiàn)拉網(wǎng)現(xiàn)象、細(xì)胞大量脫落等細(xì)胞病變(CPE)，與IBRV標(biāo)準(zhǔn)毒株HVRI-IBRV-004結(jié)果一致(圖2)。將分離毒株命名為HB-XTZ。

A.正常MDBK細(xì)胞;2.分離毒(CPE);3.HVRI-IBRV-004(CPE)

2.2 BVDV和IBRV的 PCR鑒定及測序分析

2.2.1BVDV的PCR鑒定及序列分析 提取病毒基因組RNA，RT-PCR方法擴(kuò)增BVDVE0基因,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果出現(xiàn)約686 bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖3)。PCR結(jié)果進(jìn)一步表明，分離毒株HB-BDZ為BVDV。序列測定結(jié)果表明，分離毒HB-BDZ株E0基因擴(kuò)增片段為686 bp，與預(yù)期長度相同。序列同源性分析結(jié)果顯示，分離毒HB-BDZ株E0基因序列與GenBank中發(fā)表的BVDV國外NADL株(AJ133739.1)、國內(nèi)毒株HB-DCZ 株(JX046799.1)、JL-1株(KF501393.1)、BJ-2013株(MH490942.1)、國外毒株1-SD1(M96751.1)、Powder株(JN380089.1)、6010株(JN380080.1)、180株(HQ174292.1)、2724株(S71487.1)、Oregon C24株(AF091605.1)、國內(nèi)毒株GS8株(KY675205.1)、國外毒株SLO/2407/2006株(KX577637.1)、USMARC-55477株(KP941586.1)各毒株的同源性依次為82.0%，99.2%，90.2%，80.7%，80.7%，90.2%，81.1%，81.3%，81.0%，80.5%，81.1%，80.5%，80.7%(圖4)。同源性分析結(jié)果進(jìn)一步表明，分離毒為BVDV。HB-BDZ與國內(nèi)毒株HB-DCZ 株(JX046799.1)、JL-1株(KF501393.1)、國外毒株P(guān)owder株(JN380089.1)的遺傳距離較近，與國內(nèi)毒株BJ-2013株(MH490942.1)、國外毒株1-SD1株(M96751.1)、SLO/2407/2006株(KX577637.1)、Oregon C24株(AF091605.1)(Ia亞型)遺傳距離較遠(yuǎn)(圖5)。分離毒HB-BDZ株與國內(nèi)毒株HB-DCZ 株同屬于Ib亞型。

M.DL1000 DNA Marker；1.BVDV分離株；2.Oregon C24V

圖4 BVDV分離株HB-BDZ的E0基因核苷酸序列與其他毒株的同源性比較

圖5 BVDV分離株HB-BDZ的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.2.2IBRV的PCR鑒定及序列分析 以 IBRV 特異性引物P3/P4為引物，擴(kuò)增分離株基因組DNA，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果獲得約 380 bp特異性目的條帶(圖6)，大小與 IBRV參考株目的條帶相符。PCR結(jié)果進(jìn)一步表明，分離毒株HB-XTZ為IBRV。利用DNAstar軟件對分離株HB-XTZ與其他參考株gB基因相應(yīng)核苷酸進(jìn)行同源性比較分析，其同源性分別為SZ 株(JN106446)94.1%、XE株(JN106447)94.1%、BH81 株(DQ006854)94.4%、BoHV-1-1564-11(KF584167)94.7%、IBRV-DM株(JN106443)94.1%、LD19 株(AY078725)93.8%、XT-IBRV(MF287966)100%、BH80 株(AY745877)94.1%、BHV1.1USA 株(KJ652515)94.1%、SMU6352株(MK654723)94.7%(圖7)。序列同源性分析結(jié)果進(jìn)一步標(biāo)明，分離株為IBRV。利用DNAstar軟件對HB-XTZ株與GenBank中代表毒株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)分離株HB-XTZ株與國內(nèi)XT-IBRV(MF287966)首先集合在一起，其親緣關(guān)系最近，與BHV1.1USA 株(KJ652515)和BH80 株(AY745877)遺傳距離相對較近，而與其他毒株遺傳距離較遠(yuǎn)(圖8)。

M.DL1000 DNA Marker；1.IBRV分離株；2.HVRI-IBRV-004

圖7 IBRV分離株gB基因核苷酸序列與其他毒株的同源性比較

圖8 IBRV分離株HB-XTZ的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.3 Pm與Kp的分離培養(yǎng)

2.3.1Pm的分離培養(yǎng)結(jié)果 被檢樣品中有48份離出疑似Pm，將其編號為Pm1～Pm48。分離菌株在綿羊血瓊脂平板培養(yǎng)基上生長良好，菌落呈灰白色，透明光滑，如露珠狀，無溶血圈(圖9A)；鏡檢結(jié)果為革蘭陰性，菌體呈細(xì)小的短桿狀或球桿狀，中間微凸，兩端頓圓(圖9B)。其基本符合Pm的培養(yǎng)特征與形態(tài)特征，可初步判定其為Pm。

A.綿羊血瓊脂平板培養(yǎng)Pm分離株；B.Pm分離株的鏡檢結(jié)果

2.3.2Kp的分離培養(yǎng)結(jié)果 被檢樣品中有46份分離出疑似Kp，將其編號為Kp1～Kp46。分離菌株在麥康凱培養(yǎng)基上生長，呈粉紅色、光滑濕潤的圓形菌落(圖10A)。鏡檢結(jié)果為革蘭陰性，菌體呈粗短桿狀形、圓桿狀，成雙或短鏈狀排列(圖10B)，在西蒙氏檸檬酸鹽鑒別培養(yǎng)基呈藍(lán)色、光滑、邊緣整齊的圓形菌落(圖10C)。分離菌株基本符合Kp的培養(yǎng)特征與形態(tài)特征，可初步判定其為Kp。

A.麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)Kp分離株；B.西蒙檸檬酸鹽鑒別培養(yǎng)Kp分離株；C.Kp分離株的鏡檢結(jié)果

2.4 Pm與Kp分離株的生化鑒定

2.4.1Pm分離株的生化鑒定結(jié)果 部分Pm分離菌的生化鑒定結(jié)果由表2可知，Pm分離菌的生化特性基本符合Pm的生化特性。根據(jù)分離菌的生化特性，結(jié)合其培養(yǎng)特性和菌體形態(tài)特征觀察結(jié)果，可進(jìn)一步判斷分其為Pm。

表2 Pm分離菌株生化鑒定結(jié)果

2.4.2Kp分離株的生化鑒定結(jié)果 部分K p分離菌的生化鑒定結(jié)果由表3可知，Kp分離菌的生化特性基本符合Pm的生化特性。從分離菌的生化特性結(jié)合培養(yǎng)特性和形態(tài)特征，可進(jìn)一步判斷分離菌為Kp。

2.5 Pm與Kp分離株P(guān)CR鑒定與序列分析

2.5.1Pm分離株P(guān)CR鑒定與序列分析 提取Pm分離株滄州株CZ-Pm42、保定株BD-Pm28、邯鄲株HD-Pm 19細(xì)菌基因組DNA，用特異性引物F1/F2擴(kuò)增kmt基因,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果均出現(xiàn)約277 bp目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖11)。序列測定結(jié)果表明，擴(kuò)增kmt基因片段為686 bp，與預(yù)期長度相同。同源性分析結(jié)果顯示，Pm分離株BD-Pm28、BD-Pm19、CZ-Pm42與GenBank其他參考菌株的同源性分別為96.4%～100%,95.5%～100%和96.4%～100%，3株分離菌之間的同源性為98.4%～97.6%(圖12)。同源性分析結(jié)果進(jìn)一步標(biāo)明分離株為Pm。kmt基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，Pm分離株BD-Pm28、HD-Pm19、CZ-Pm42與MH068783.1的親緣關(guān)系最近(圖13)。

M.DL1000 DNA Marker，1～3.分離株CZ-Pm42、BD-Pm28、HD-Pm 19的kmt基因

圖12 Pm分離株CZ-Pm42、BD-Pm28、HD-Pm19 kmt基因核苷酸同源性分析

圖13 BD-Pm28、HD-Pm19、CZ-Pm24系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.5.2Kp分離株P(guān)CR鑒定與序列分析 提取Kp分離株邯鄲株HD-Kp21、滄州株CZ-Kp28、石家莊株SJZ-Kp34、衡水HS-Kp35Kp分離菌基因組DNA，用特異性引物F3/F4擴(kuò)增phoE基因,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果均出現(xiàn)約441 bp目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖14)。序列測定結(jié)果表明，擴(kuò)增phoE基因片段為441 bp，與預(yù)期長度相同。同源性分析結(jié)果顯示，Kp分離株HD-Kp21、CZ-Kp28、SJZ-Kp34、HS-Kp35與GenBank其他參考菌株的同源性分別為96.5%～97.1%,98.6%～98.8%，99.3%～99.5%和97.2%～97.6%，4株分離菌之間的同源性為96.6%～99.3%(圖15)。同源性分析結(jié)果進(jìn)一步表明分離株為Kp。phoE基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，Kp分離株HS-Kp65、CZ-Kp28、CZ-Kp34、HD-Kp21與AF064793.1的親緣關(guān)系最近(圖16)。

M.DL1000 DNA Marker；1～4.分離株HD-Kp21、CZ-Kp28、CZ-Kp34、HS-Kp35

圖15 Kp分離株HS-Kp35、CZ-Kp28、SJZ-Kp34、HD-Kp21 phoE基因核苷酸同源性分析

圖16 HS-Kp35、CZ-Kp28、SJZ-Kp34、HD-Kp21系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.6 分離菌Pm與Kp的致病性檢測結(jié)果各試驗(yàn)組小鼠均出現(xiàn)精神沉郁，倦怠，被毛粗亂呼吸急促、雙目緊閉等癥狀。對照組小鼠正常。Kp試驗(yàn)組小鼠24 h后開始死亡，48 h內(nèi)全部死亡，剖檢可見肺臟嚴(yán)重充血，散在多個(gè)灰白色結(jié)節(jié)，肝臟和脾臟腫大(圖17)；Pm試驗(yàn)組小鼠12～36 h內(nèi)全部死亡，剖檢可見肺臟充血、有出血點(diǎn)，肝臟腫大，脾臟充血嚴(yán)重(圖18)。

A.肺臟充血、有出血點(diǎn);B.脾臟充血;C.鏡檢革蘭陰性桿菌

無菌采取死亡小鼠的肺臟、肝臟及脾臟，涂片、染色、鏡檢及分離培養(yǎng)，鏡下可見革蘭染色陰性短桿菌(圖17，18)，培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)基本符合Pm或Kp形態(tài)特征。

A.肺臟充血、灰白色結(jié)節(jié);B.脾臟腫大;C.鏡檢結(jié)果革蘭陰性桿菌

2.7 分離菌的耐藥性檢測結(jié)果分離菌耐藥性檢測結(jié)果見表4。由表4可以看出，Pm的分離株對氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、阿米卡星等4種抗生素敏感；對鏈霉素、四環(huán)素、頭孢拉啶、紅霉素、苯唑西林中度敏感；對青霉素、頭孢呋辛、卡那霉素、復(fù)方新諾明中度耐藥；對磷霉素、慶大霉素、新霉素明顯耐藥。Kp的分離株對氧氟沙星、阿米卡星、新霉素等3種抗生素中度敏感；對鏈霉素、環(huán)丙沙星、頭孢拉啶、磷霉素中度耐藥；對青霉素、四環(huán)素、頭孢呋辛、慶大霉素、復(fù)方新諾明、卡那霉素、氟苯尼考、紅霉素、苯唑西林明顯耐藥。

表4 分離菌耐藥性檢測結(jié)果

3 討論

牛呼吸道疾病綜合征是一類多病原多因素的傳染性疾病，是奶牛最常見的疫病之一[9]，近年來，有關(guān)革蘭陰性菌引起牛呼吸道疾病綜合征的報(bào)道越來越多，特別是由多殺性巴氏桿菌及肺炎克雷伯桿菌感染引起對呼吸道疾病日益受到研究人員的關(guān)注[10]。本試驗(yàn)從奶牛呼吸道病臨床病例采取鼻拭子樣品中進(jìn)行病原的分離鑒定，分離菌在形態(tài)特征、培養(yǎng)特性和生化特性、致病性方面與多殺性巴士桿菌及肺炎克雷伯桿菌基本一致；用分子生物學(xué)方法對分離菌Pm和Kp進(jìn)行kmt基因及phoE基因擴(kuò)增及序列分析，鑒定為Pm和Kp，表明該奶牛場BRDC的病原菌主要是Pm和Kp。

抗生素作為治療藥物在奶牛細(xì)菌感染引起對呼吸道疾病的控制中起了重要作用，但長期應(yīng)用抗生素導(dǎo)致耐藥性菌株產(chǎn)生和抗生素殘留等嚴(yán)重問題[11]。本研究藥敏試驗(yàn)的結(jié)果表明，Pm的分離株對氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、阿米卡星等4種抗生素敏感；對鏈霉素、四環(huán)素、頭孢拉啶、紅霉素、苯唑西林中度敏感；對青霉素、頭孢呋辛、卡那霉素、復(fù)方新諾明中度耐藥；對磷霉素、慶大霉素、新霉素明顯耐藥。Kp的分離株對氧氟沙星、阿米卡星、新霉素等3種抗生素中度敏感；對鏈霉素、環(huán)丙沙星、頭孢拉啶、磷霉素中度耐藥；對青霉素、四環(huán)素、頭孢呋辛、慶大霉素、復(fù)方新諾明、卡那霉素、氟苯尼考、紅霉素、苯唑西林明顯耐藥。分離菌對大部分藥物不敏感，可能與當(dāng)?shù)鼗鶎娱L期或大量使用該類藥物，使致病菌已產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。因此，在生產(chǎn)中可以選氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、阿米卡星、新霉素等作為由Pm和Kp引起的奶牛呼吸道病的首選藥物，且應(yīng)注意交替用藥，按療程投藥，嚴(yán)禁超劑量使用，避免或減少耐藥菌株的產(chǎn)生。及時(shí)掌握各地區(qū)奶牛乳呼吸道疾病感染細(xì)菌病原的種類及其對抗生素的敏感性，對預(yù)防及治療奶牛呼吸道疫病具有關(guān)鍵作用[12]。

病毒感染也是引起牛呼吸道疾病綜合征的主要原因，據(jù)報(bào)道，BVDV、IBRV是導(dǎo)致牛發(fā)生BRDC對主要原因[13]。BVDV是黃病毒科瘟病毒屬的成員，可引起動(dòng)物的流產(chǎn)、腹瀉和呼吸系統(tǒng)疾病[14]。IBRV 又稱牛皰疹病毒I型(bovine herpesvirus 1，BHV-1)，是皰疹病毒科皰疹病毒亞科水痘病毒屬(Varicellovirus)的成員，屬于α-皰疹病毒亞科[15]。IBRV 多引起上呼吸道及氣管黏膜發(fā)炎，表現(xiàn)為呼吸困難和流鼻涕等癥狀，還可引起生殖道感染、結(jié)膜發(fā)炎、腦膜腦炎、流產(chǎn)等多種疾病，嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)健康[16]。因此，對該病進(jìn)行有效防控已經(jīng)迫在眉睫。本研究自河北省7個(gè)地區(qū)的奶牛養(yǎng)殖場56例臨床病例采樣檢測，分離出BVDV和IBRV，表明BVDV和IBRV 也是引起河北省牛呼吸道疾病的主要病原。

為了解河北省地方毒株的分子特征，本研究對河北分離株HB-BDZ的E0基因進(jìn)行序列測定與分析，對河北分離株HB-XTZ的gB基因進(jìn)行序列測定與分析。BVDV分離毒HB-BDZ株E0基因序列與GenBank參考毒株國外毒株SLO/2407/2006株(KX577637.1)、NADL株(AJ133739.1)、Powder株(JN380089.1)國內(nèi)毒株GS8株(KY675205.1)、HB-DCZ 株(JX046799.1)等其他毒株的同源性為80.5%～99.2%；系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中，分離毒株HB-BDZ與HB-DCZ 株(JX046799.1)、JL-1株(KF501393.1)、國外毒株P(guān)owder株(JN380089.1)的遺傳距離較近，與國內(nèi)毒株HB-DCZ 株同屬于Ib亞型。IBRV分離株HB-XTZ的gB基因序列與GenBank其他IBRV參考株LD19 株(AY078725)、IBRV-DM株(JN106443)、BH80 株(AY745877)、XT-IBRV(MF287966)等gB基因核苷酸同源性為93.8%～100.0%。在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中與國內(nèi)河北分離株XT-IBRV(MF287966)首先集合在一起，其親緣關(guān)系最近，與BHV1.1USA株(KJ652515)和BH80 株(AY745877)遺傳距離相對較近，而與其他毒株遺傳距離較遠(yuǎn)。

綜上所述，本研究通過采集河北省不同地區(qū)不同奶牛場奶牛呼吸道疾病臨床病例病料，對病原進(jìn)行分離鑒定，其結(jié)果表明BVDV、IBRV、Pm、KP等4種病原是引起B(yǎng)RDC的主要病原。同時(shí)對2種病原菌Pm、KP分離株的致病性進(jìn)行了研究，并篩選出敏感藥物。本研究為揭示河北省奶牛場BRDC的流行特征，實(shí)施科學(xué)有效的防制措施奠定了基礎(chǔ)。