胡 月，賈欽瑞，吳桂靈，車傳忠，劉建華，加爾肯，冉多良

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

馬皰疹病毒1型(equine herpesvirus-1，EHV-1)曾被列為馬鼻肺炎的病原體之一，2012年5月世界衛(wèi)生組織將其所致疾病稱為馬皰疹病毒-1型感染(infection with equine herpesvirus-1)，2020年7月我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將該病列為二類動(dòng)物傳染病[1]。該病毒可引起馬屬動(dòng)物呼吸系統(tǒng)疾病、孕馬流產(chǎn)、新生馬駒死亡和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，給馬產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的威脅[2]。歷年來，我國的流行病學(xué)調(diào)查顯示，全國各地區(qū)均有EHV-1的流行[3]。2015-2019年，新疆地區(qū)該病的平均陽性率為30.47%，成為當(dāng)前需要重點(diǎn)防控的病毒性傳染病之一[4-5]。

EHV-1具有很強(qiáng)的傳染性，潛伏期長且無特效藥治療，免疫接種是預(yù)防該病最有效的手段。目前，我國尚無防控該病的商品化疫苗，主要依賴進(jìn)口，價(jià)格昂貴，故急需一種適用于我國流行毒株的、自主研發(fā)的疫苗。FRYMUS等[6]研究表明,EHV-1減毒活疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，其免疫保護(hù)效果高于滅活疫苗。EHV-1的gp2蛋白含有817個(gè)氨基酸，是病毒復(fù)制過程中非必需糖蛋白，與病毒的毒力直接相關(guān)。與HSV-1和α亞科其他的病毒相比，gp2是EHV-1編碼的特有的糖蛋白，富含絲氨酸和蘇氨酸，具有很高的免疫原性[7]。因此,本試驗(yàn)擬以我國流行毒株EHV-1 XJ2015株為親本毒株，采用同源重組方法篩選出gp2基因缺失毒株，為后續(xù)EHV-1毒力基因缺失疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株與細(xì)胞EHV-1 XJ2015株、RK-13細(xì)胞系、載體pEGFP-C1和pUC19均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑2×PrimerSTAR Max購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA Marker購自于TaKaRa寶生物(大連)工程有限公司；Gel Extraction Kit 和Cycle Pure Kit購自于OMEGA廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司，LipofectamineTM3000購自于賽默飛世爾科技公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)合成參照EHV-1 XJ2015株的全基因測序結(jié)果及pEGFP-C1的序列信息，設(shè)計(jì)gp2基因左右同源臂和EGFP表達(dá)盒的特異性引物及鑒定性引物，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pUC-gp2-LR與pUC-gp2-LR-EGFP構(gòu)建過程如圖1所示，采用酚-氯仿法提取EHV-1 XJ2015基因組，利用gp2L-F和gp2L-R、gp2R-F和gp2R-R引物PCR擴(kuò)增gp2基因左右同源臂，參照Gel Extraction Kit說明書回收PCR產(chǎn)物，使用Q.Cut HindⅢ/BamHⅠ、kpnⅠ/EcoRⅠ分別酶切g(shù)p2L和gp2R，與pUC19載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pUC-gp2-LR送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定。將pUC-gp2-LR和EGFP表達(dá)盒片段采用Q.Cut BamHⅠ/kpnⅠ進(jìn)行酶切，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pUC-gp2-LR-EGFP送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定。通過NCBI Blast比對(duì)，確保序列正確并按照Endo-free Plasmid Miniprep Kit說明書提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

A.轉(zhuǎn)移載體pUC-gp2-LR構(gòu)建策略；B.轉(zhuǎn)移載體pUC-gp2-LR-EGFP構(gòu)建策略

1.5 EHV-1 XJ2015-gp2-/EGFP+的篩選及純化采用酚-氯仿法提取EHV-1基因組，當(dāng)RK-13細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，采用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000對(duì)轉(zhuǎn)移載體pUC-gp2-LR-EGFP與EHV-1基因組進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48～72 h，在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE)，當(dāng)出現(xiàn)CPE時(shí)，用低熔點(diǎn)營養(yǎng)瓊脂鋪板進(jìn)行重組病毒的蝕斑篩選，挑取最大的熒光蝕斑加入DMEM培養(yǎng)基重懸，反復(fù)凍融3次后，4℃下10 000 r/min離心10 min，按10倍系列稀釋接種RK-13細(xì)胞中孵育1 h后鋪板培養(yǎng)，重復(fù)上述操作直至藍(lán)光條件下觀察到的所有病毒蝕斑均呈現(xiàn)綠色熒光。命名純化干凈的重組病毒為EHV-1 XJ2015-gp2-/EGFP+。使用△gp2-F和△gp2-R引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.6 EHV-1 XJ2015-gp2-的篩選及純化提取EHV-1 XJ2015-gp2-/EGFP+株基因組，將其與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC-gp2-LR共轉(zhuǎn)染至RK-13細(xì)胞，利用上述方法挑取不發(fā)出綠色熒光的蝕斑進(jìn)行篩選純化，直至所有病毒蝕斑均不發(fā)出綠色熒光，命名該病毒為EHV-1 XJ2015-gp2-。使用△gp2-F、△gp2-R、△EGFP-F和△EGFP-R引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.7 重組病毒的生長特性分析RK-13細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；按照常規(guī)方法計(jì)算病毒感染復(fù)數(shù)(muhiplieity of infection，MOI)；按MOI=0.1將XJ2015株與XJ2015-gp2-接種至細(xì)胞中，并設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照；分別在感染后4,6,12,24,36,48,60,72 h逐一收獲病毒液；反復(fù)凍融3次后離心過濾測定病毒液TCID50并繪制病毒的一步生長曲線。按MOI=0.1將XJ2015株與XJ2015-gp2-接種至細(xì)胞中；37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h 后使用低熔點(diǎn)營養(yǎng)瓊脂鋪板培養(yǎng)；3 d后采用中性紅染色并測量蝕斑面積。

2 結(jié)果

2.1 左右同源臂的擴(kuò)增及測序結(jié)果利用gp2L和gp2R特異性引物進(jìn)行EHV-1 XJ2015株gp2基因左右同源臂的擴(kuò)增，結(jié)果顯示分別擴(kuò)增出1 237 bp和1 235 bp 大小的片段(圖2)，經(jīng)測序及序列分析結(jié)果顯示該片段與相應(yīng)的基因片段同源性達(dá)100%，成功獲得同源臂序列。

M.DL2000 DNA Marker；1.gp2L陰性對(duì)照；2.gp2L陽性對(duì)照；3.gp2L擴(kuò)增產(chǎn)物；4.gp2R陰性對(duì)照；5.gp2R陽性對(duì)照；6.gp2R擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC-gp2-LR 和pUC-gp2-LR-EGFP 酶切鑒定結(jié)果pUC-gp2-LR分別經(jīng)HindⅢ/BamHⅠ、kpnⅠ/EcoRⅠ酶切和EcoRⅠ酶切，結(jié)果顯示1泳道出現(xiàn)3條帶，包括約為1 237 bp(gp2L)的片段；2泳道出現(xiàn)2條帶，包括約為1 235 bp(gp2R)的片段；3泳道出現(xiàn)1條帶，約為5 340 bp(圖3A)，均與預(yù)期片段大小相符，表明成功構(gòu)建pUC-gp2-LR。pUC-gp2-LR-EGFP分別經(jīng)HindⅢ/BamHⅠ、BamHⅠ/kpnⅠ、kpnⅠ/EcoR Ⅰ酶切，1泳道出現(xiàn)3條帶，包括約為1 237 bp(gp2L)的片段；2泳道出現(xiàn)2條帶，包括大小為1 550 bp(EGFP)的片段；3泳道出現(xiàn)2條帶，包括約為1 235 bp(gp2R)的片段(圖3B)，均與預(yù)期片段大小相符，表明成功構(gòu)建pUC-gp2-LR-EGFP。

M1.DL5000 DNA Marker；A1.HindⅢ/BamHI酶切產(chǎn)物；A2.KpnⅠ/EcoRⅠ酶切產(chǎn)物；A3.EcoRⅠ酶切產(chǎn)物;M2.DL10000 DNA Marker；B1.HindⅢ/BamH I酶切產(chǎn)物；B2.BamHⅠ/KpnⅠ酶切產(chǎn)物；B3.KpnⅠ/EcoRⅠ酶切產(chǎn)物

2.3 EHV-1 XJ2015-gp2-/EGFP+的拯救及鑒定pUC-gp2-LR-EGFP與EHV-1 DNA基因組共轉(zhuǎn)染至RK-13細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后收獲病毒液，連續(xù)經(jīng)過7輪蝕斑純化，所有的病毒蝕斑均呈現(xiàn)綠色熒光(圖4)，采用△gp2-F/△gp2-R，EGFP-F/EGFP-R引物對(duì)重組病毒EHV-1 XJ2015-gp2-/EGFP+進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示，重組病毒可以特異性擴(kuò)增出大小為1 550 bp的EGFP基因片段，但不能擴(kuò)增出大小為544 bp的△gp2片段(圖5),表明重組病毒已純化完全。

A.常光下XJ2015-gp2-/EGFP+形成的蝕斑；B.藍(lán)光下XJ2015-gp2-/EGFP+形成的蝕斑

M.DL2000 DNA Marker；1.△gp2陰性對(duì)照；2.△gp2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3.△gp2陽性對(duì)照；4.EGFP陰性對(duì)照；5.EGFP PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;6.EGFP陽性對(duì)照

2.4 EHV-1 XJ2015-gp2-的拯救及鑒定pUC-gp2-LR與EHV-1 XJ2015-gp2-/EGFP+株病毒DNA共轉(zhuǎn)染至RK-13細(xì)胞進(jìn)行反向重組，經(jīng)過3輪純化后，所有的病毒蝕斑均不呈現(xiàn)綠色熒光(圖6)，采用EGFP-F/EGFP-R，△gp2-F/△gp2-R引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示重組病毒不能特異性擴(kuò)增EGFP和△gp2片段(圖7)。結(jié)果表明,成功拯救并純化獲得了去除EGFP基因的EHV-1gp2基因缺失株。

A.常光下XJ2015-gp2-形成的蝕斑；B.藍(lán)光下XJ2015-gp2-形成的蝕斑

M.DL2000 DNA Marker；1.△EGFP陰性對(duì)照；2，3.△EGFP PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；4.△EGFP陽性對(duì)照；5.△gp2陰性對(duì)照；6，7.△gp2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；8.△gp2陽性對(duì)照

2.5 病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線的繪制將親本株與gp2缺失株分別以MOI=0.1感染RK-13細(xì)胞，不同時(shí)間段收獲病毒后繪制一步生長曲線(圖8)，親本株與gp2基因缺失株的增殖速度及病毒效價(jià)存在差異，親本毒在36 h達(dá)到最高效價(jià)，為10-8.75TCID50/0.1 mL，后者在48 h達(dá)到最高效價(jià)，為10-6.3TCID50/0.1 mL；gp2基因缺失株測定結(jié)果顯示，該毒株增殖能力降低了約2個(gè)病毒滴度，表明gp2基因影響病毒增殖能力。

2.6 EHV-1 XJ2015-gp2-毒株與EHV-1 XJ2015株空斑大小的比較將EHV-1 XJ2015-gp2-重組毒株和親本毒以MOI=0.1接種單層RK-13細(xì)胞，經(jīng)吸附，固定培養(yǎng)和中性紅染色等操作后在熒光倒置顯微鏡拍照，隨機(jī)各測量50個(gè)EHV-1 XJ2015-gp2-毒株和親本毒的獨(dú)立空斑面積，平均值分別為0.378 mm2和1.698 mm2，經(jīng)One-way ANOVA方法分析空斑面積大小顯示，兩者差異極顯著(P<0.01)(圖9)。

圖9 EHV-1 gp2基因缺失毒株和親本毒株的蝕斑形態(tài)(A、B)及面積比較(C)

3 討論

目前，本課題組已進(jìn)行了滅活疫苗、核酸疫苗、亞單位疫苗的初步研制，但上述這些疫苗需與免疫佐劑配合使用，免疫原性較低，需要多次免疫，并建立完善的免疫程序才能達(dá)到較好的免疫效果[8]。相比之下，減毒活疫苗的免疫程序較簡單且節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本，毒力減弱或無毒的活毒株本身即為疫苗株，不需要配合佐劑使用，免疫效果強(qiáng)而持久，但保質(zhì)期相對(duì)較短，存在毒力返租的風(fēng)險(xiǎn)，需要在研發(fā)階段進(jìn)行大量的安全性與穩(wěn)定性監(jiān)測[9]。我國對(duì)于EHV-1減毒活疫苗的研發(fā)還處于開拓階段。

根據(jù)XJ2015株的全基因測序及遺傳進(jìn)化分析表明，gp2基因?yàn)樵摬《?6個(gè)基因中保守性最低的基因[10]。而根據(jù)VON EINEM等[11]的報(bào)道，gp2基因缺失對(duì)EHV-1 Ab4、RacL11、RacH、KyA這4株病毒生長的影響存在差異性。本研究測定了EHV-1 XJ2015株和EHV-1 XJ2015-gp2-株在RK-13細(xì)胞上的一步生長曲線，結(jié)果顯示gp2基因缺失株較親本株增殖能力有所下降，其毒價(jià)在病毒增殖的不同時(shí)間段均低于親本株，表明gp2基因影響病毒在細(xì)胞與細(xì)胞之間的傳播。雖然非必需糖蛋白功能的缺失不影響病毒DNA的復(fù)制，但是影響了病毒在細(xì)胞間的傳播和病毒從細(xì)胞中釋放出來的能力，導(dǎo)致病毒吸附到細(xì)胞上的效率低于野生型毒株，病毒出膜和釋放時(shí)間也受到明顯的推遲。因此gp2基因的缺失可間接影響病毒的增殖。

同源重組是構(gòu)建重組病毒常用的策略之一，BAC和CRISPR/Cas9等技術(shù)是在此基礎(chǔ)上的一些加工和修飾的方法，以提高重組效率[12]。本研究雖采用傳統(tǒng)的同源重組方法，但將轉(zhuǎn)移載體進(jìn)行了線性化處理，能提高同源重組的效率；同時(shí)使用LipofectamineTM3000試劑轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染后每12 h更換1次營養(yǎng)液，使細(xì)胞的生長處于良好狀態(tài)，為重組病毒的拯救提供了良好的環(huán)境；通過篩選得到轉(zhuǎn)移載體與病毒基因組的最佳轉(zhuǎn)染比例，提高了轉(zhuǎn)染和基因重組的效率。此外，本研究通過反向同源重組的方法去除了外源的EGFP基因，排除了機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)外源蛋白的抗體的風(fēng)險(xiǎn)，提高了基因缺失疫苗的穩(wěn)定性和安全性。

本研究將通過構(gòu)建EHV-1 XJ2015 US4基因缺失毒株并分析其生物學(xué)特性，為我國研發(fā)EHV-1基因缺失減毒活疫苗奠定基礎(chǔ)，為預(yù)防和控制該病原所引起的馬屬動(dòng)物疫病提供有效方法。