錢炳旭，白雪雁，張成成，郭夢(mèng)嬌，李夢(mèng)嬌，廖 凱，薛 峰，吳艷濤，張小榮*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物健康與食品安全國(guó)際合作實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

豬德爾塔冠狀病毒(porcine Deltacoronavirus，PDCoV)是2012年首次在中國(guó)香港發(fā)現(xiàn)的腸道致病性冠狀病毒[1]，可感染各個(gè)年齡段的豬，對(duì)新生仔豬有較強(qiáng)的致病性，表現(xiàn)為水樣腹瀉、嘔吐，嚴(yán)重時(shí)會(huì)因脫水致死，發(fā)病率和病死率較高[2-5]。2014年，美國(guó)首次出現(xiàn)PDCoV的大規(guī)模流行，俄亥俄州、愛(ài)荷華州、伊利諾斯州等多地相繼暴發(fā)了仔豬腹瀉，研究人員在發(fā)生腹瀉的豬場(chǎng)檢測(cè)到PDCoV，并采集病料進(jìn)行了病毒分離[6-7]。隨后，PDCoV在泰國(guó)[8]、加拿大[9]、韓國(guó)[10]、中國(guó)[11]等地均有出現(xiàn)和報(bào)道，呈現(xiàn)全球流行的趨勢(shì)，逐漸成為威脅世界養(yǎng)豬業(yè)的重要腹瀉病原之一。

PDCoV屬于冠狀病毒科、德爾塔(δ)冠狀病毒屬，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒粒子呈多形性，內(nèi)部基因組RNA和核衣殼蛋白組成了核蛋白核芯。病毒外膜上有大量棒狀結(jié)構(gòu)突起，直徑為60～180 nm，呈典型的“皇冠”狀冠狀病毒形態(tài)[12]。PDCoV的基因組約為25.4 kb，是目前已知的冠狀病毒中基因組最小的，GC含量約為43%?；蚪M組成、排列順序?yàn)椋?′非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)、開放閱讀框(open reading frame，ORF)1a/1b、棘突蛋白(spike，S)、小膜蛋白(envelope，E)、膜蛋白(membrane，M)、核衣殼蛋白(nucleocapsid，N)、輔助蛋白NS6、輔助蛋白NS7以及3′端非翻譯區(qū)[13]。

PDCoV感染后的病理變化與豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)十分相似，主要表現(xiàn)為腸壁變薄、透明(遠(yuǎn)端空腸至結(jié)腸)，腸腔內(nèi)有大量淡黃色的液體；組織病理切片可觀察到淺層絨毛上皮腫脹和空泡化；胃中有未消化的凝乳，嚴(yán)重者可觀察到胸腔腹腔積液，小腸壁及腸系膜充血、出血[12,14]。所以豬場(chǎng)一旦出現(xiàn)豬腹瀉，在臨床上難以鑒別診斷，確診病原需依賴實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。PAN等[15]根據(jù)PDCoV的ORF1b基因設(shè)計(jì)了特異性的引物和探針，建立了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)限可達(dá)1×102拷貝/L。LUO等[16]和LU等[17]分別以M和S蛋白為靶蛋白，建立了快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)血清和乳汁中抗體的間接ELISA方法，可用于PDCoV的臨床診斷和疫苗免疫評(píng)價(jià)。N蛋白是冠狀病毒粒子中數(shù)量最多的結(jié)構(gòu)蛋白，高度保守[18]，因此本試驗(yàn)選擇N蛋白作為靶蛋白，建立了用于PDCoV特異性抗體檢測(cè)的間接ELISA方法，從而為PDCoV感染的快速診斷和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供快速、準(zhǔn)確、有效的高通量檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 載體與菌株表達(dá)載體pET-32a，購(gòu)自Novagen公司；大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 血清PDCoV、PEDV、TGEV、豬輪狀病毒(porcine rotavirus，PRoV)等抗血清均由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備和保存。

1.3 主要試劑T4DNA連接酶、TMB substrate kit和限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自Thermo Fisher公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗豬IgG和羊抗鼠IgG購(gòu)自Sigma公司；小量提取質(zhì)粒試劑盒與膠回收試劑盒均購(gòu)自Axygen公司；His標(biāo)簽蛋白的單克隆抗體和Ni-NTA親和層析介質(zhì)均購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.4 PDCoV N蛋白的原核表達(dá)及純化

1.4.1PDCoV N蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 通過(guò)DNAStar軟件包中的Protean程序，對(duì)PDCoV CHN/Tianjin/2016株N蛋白氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)：KY065120)進(jìn)行分析，挑選其中抗原性較好的一段(265～342 aa)，根據(jù)大腸桿菌密碼子使用的偏嗜性規(guī)律，對(duì)其基因片段進(jìn)行密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)，為方便克隆，基因片段兩端分別加上BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，優(yōu)化的基因片段N-Opti委托南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行合成。利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ將人工合成的N基因片段定向克隆入原核表達(dá)載體pET-32a相應(yīng)位點(diǎn)之間，獲得重組質(zhì)粒pET-32a-PDCoV-N-Opti(圖1)。

圖1 pET-32a-PDCoV-N-Opti重組質(zhì)粒圖譜

1.4.2PDCoV N蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定 將重組質(zhì)粒pET-32a-PDCoV-N-Opti轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組表達(dá)菌BL21(DE3)/pET-32a-PDCoV-N-Opti。將重組菌1∶100接種于含有氨芐青霉素(100 g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌液D600 nm值在0.4～0.6之間，加入終濃度0.5 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)設(shè)立BL21(DE3)/pET-32a的陰性菌對(duì)照，進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot試驗(yàn)以分析PDCoV-N-His蛋白的表達(dá)情況。

1.4.3PDCoV N蛋白的純化 利用Ni-NTA親和層析介質(zhì)純化PDCoV-N-His蛋白，參照說(shuō)明書配制試劑，使用含250 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫蛋白，完成后收集蛋白濾液、洗滌液、洗脫液，進(jìn)行SDS-PAGE，觀察蛋白條帶，分析純化效果。

1.5 檢測(cè)PDCoV抗體的間接ELISA方法的建立

1.5.1抗原最佳包被質(zhì)量濃度和一抗最佳稀釋度的確定 棋盤滴定法確定抗原最佳包被濃度和一抗血清最佳稀釋度。PDCoV-N-His蛋白用碳酸鹽包被液按8.0,4.0,2.0,1.0,0.5 mg/L質(zhì)量濃度梯度進(jìn)行稀釋，PDCoV陽(yáng)性血清和豬陰性血清用PBST稀釋1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400的梯度，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，比較P/N值，選擇P/N最大值對(duì)應(yīng)孔的抗原包被濃度和一抗血清稀釋度作為最佳工作濃度。

1.5.2最佳封閉條件的確定 分別以1% BSA、5%脫脂乳、5%馬血清、5%小牛血清作為封閉液，每種封閉液設(shè)立30，60，90，120 min的孵育時(shí)間梯度，PDCoV陽(yáng)性血清和豬陰性血清作為一抗，每份血清各做3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，比較各組陰陽(yáng)性血清的P/N值，選擇P/N值最大的封閉液和封閉時(shí)間作為最佳封閉條件。

1.5.3最佳一抗和底物孵育時(shí)間的確定 一抗孵育時(shí)間設(shè)立30，60，90，120 min的時(shí)間梯度，底物顯色時(shí)間設(shè)立10，15，20，25 min的時(shí)間梯度，PDCoV陽(yáng)性血清和豬陰性血清作為一抗，每份血清各做3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，比較各組陰陽(yáng)性血清的P/N值，分別選擇P/N值最大的孵育時(shí)間為最佳條件。

1.5.4酶標(biāo)二抗最佳孵育條件的確定 根據(jù)已確定的最佳條件，兔抗豬IgG-HRP按照1∶2 500,1∶5 000,1∶7 500,1∶10 000的梯度進(jìn)行稀釋，每個(gè)稀釋度再設(shè)30，60，90，120 min的孵育時(shí)間梯度，PDCoV陽(yáng)性血清和豬陰性血清作為一抗，每份血清各做3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，比較各組陰陽(yáng)性血清的P/N值，選擇P/N值最大的二抗稀釋度和孵育時(shí)間為最佳條件。

1.5.6特異性試驗(yàn) 利用本研究建立的間接ELISA方法檢測(cè)PEDV、TGEV、PRoV陽(yáng)性血清，同時(shí)設(shè)立PDCoV陽(yáng)性血清和豬陰性血清的對(duì)照，驗(yàn)證ELISA方法的特異性。

1.5.8間接ELISA方法的初步應(yīng)用 應(yīng)用本研究所建立的檢測(cè)PDCoV抗體的間接 ELISA 方法，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的20份PDCoV豬陽(yáng)性血清樣品和20份豬陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證間接ELISA方法的檢測(cè)結(jié)果是否可靠。

2 結(jié)果

2.1 PDCoV N蛋白的原核表達(dá)

2.1.1原核表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定 利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖2，可見(jiàn)重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物可產(chǎn)生5.4 kb 大小的載體條帶和234 bp大小的目的條帶，空載體pET-32a則僅觀察到1條5.4 kb的載體條帶。

M.100 bp DNA Marker；1.pET-32a-PDCoV-N-Opti；2.pET-32a

2.1.2PDCoV N蛋白的SDS-PAGE鑒定 如圖3所示，重組菌BL21(DE3)/pET-32a-PDCoV-N-Opti的表達(dá)產(chǎn)物蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為31 kDa，與PDCoV-N-His重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量大小一致，并且表達(dá)產(chǎn)物主要存在于上清中，表明重組N蛋白呈可溶性表達(dá)。

M.蛋白Marker；1.重組菌/上清；2.重組菌/沉淀；3.陰性對(duì)照/上清；4：陰性對(duì)照/沉淀

2.1.3Western blot分析 取1.4制備的蛋白樣，以His蛋白的單抗(1∶1 000稀釋)為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)為二抗，稀釋液均為5%脫脂乳，進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果如圖4所示，可見(jiàn)重組菌裂解產(chǎn)物在31 kDa處有特異性蛋白條帶，而陰性菌的裂解產(chǎn)物僅在20 kDa處有特異性條帶，與His標(biāo)簽蛋白分子量大小相符，說(shuō)明重組蛋白PDCoV-N-His在表達(dá)過(guò)程中，融合了載體上的His標(biāo)簽蛋白成功表達(dá)。

M.蛋白Marker；1.重組菌/上清；2.重組菌/沉淀；3.陰性對(duì)照/上清；4.陰性對(duì)照/沉淀

2.1.4PDCoV N蛋白的純化 使用Ni-NTA親和層析介質(zhì)純化PDCoV-N-His蛋白，SDS-PAGE分析蛋白純化效果。PDCoV-N-His蛋白純化后的洗脫液在31 kDa有較為單一的蛋白條帶(圖5)，與預(yù)期相符，純化效果較好，蛋白質(zhì)量濃度為2.2 g/L。將純化后的重組蛋白透析到PBS(pH7.4)中，-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

M.蛋白Marker；1.PDCoV-N-His蛋白；2.PDCoV-N-His蛋白濾液；3,4.洗滌液；5.洗脫液

2.2 PDCoV抗體的間接ELISA檢測(cè)方法的建立

2.2.1抗原最佳包被質(zhì)量濃度和血清最佳稀釋度的確定 采用棋盤滴定法，確定最佳抗原包被質(zhì)量濃度和血清稀釋倍數(shù)。PDCoV-N-His重組蛋白質(zhì)量濃度8.000～0.125 mg/L倍比稀釋，PDCoV陽(yáng)性血清和豬陰性血清進(jìn)行1∶25,1∶50,1∶100,1∶200,1∶400,1∶800倍稀釋，每個(gè)血清設(shè)3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，讀取D450 nm值。結(jié)果如圖6所示，最佳抗原包被質(zhì)量濃度為1 mg/L，最佳血清稀釋倍數(shù)為1∶100。

圖6 抗原包被濃度及血清稀釋倍數(shù)的確定

2.2.2最佳封閉條件的確定 分別以1% BSA、5%脫脂乳、5%馬血清、5%類胎牛血清作為封閉液，每個(gè)封閉液孵育時(shí)間設(shè)立30，60，90，120 min的梯度，PDCoV陽(yáng)性血清和豬陰性血清作為一抗，每份血清各做3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，讀取D450 nm值。結(jié)果如圖7所示，最佳封閉液為1% BSA，最佳封閉時(shí)間為60 min。

圖7 封閉液和封閉時(shí)間的確定

2.2.3最佳一抗孵育時(shí)間和底物顯色時(shí)間的確定 一抗孵育時(shí)間設(shè)立30，60，90，120 min的梯度，底物顯色時(shí)間設(shè)立10，15，20，25 min的時(shí)間梯度，PDCoV陽(yáng)性血清和豬陰性血清作為一抗，每份血清各做3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，讀取D450 nm值。結(jié)果如圖8所示，一抗的最佳孵育時(shí)間為60 min。

圖8 一抗孵育時(shí)間和底物顯色時(shí)間的確定

2.2.4酶標(biāo)二抗最佳孵育條件的確定 PDCoV陽(yáng)性血清和豬陰性血清作為一抗，每份血清各做3個(gè)重復(fù)，兔抗豬IgG-HRP設(shè)立1∶2 500,1∶5 000,1∶7 500,1∶10 000的稀釋梯度，每個(gè)稀釋度的孵育時(shí)間設(shè)立30，60，90，120 min的梯度，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，讀取D450 nm值。結(jié)果如圖9所示，兔抗豬IgG-HRP的最佳稀釋度為1∶5 000，最佳孵育時(shí)間為60 min。

圖9 兔抗豬IgG-HRP稀釋度和孵育時(shí)間的確定

2.2.6特異性試驗(yàn) 使用建立的間接ELISA方法檢測(cè)PEDV、TGEV、PRoV血清，同時(shí)設(shè)立PDCoV 血清和豬陰性血清對(duì)照，每份樣品均設(shè)立3個(gè)重復(fù)，讀取D450 nm值。結(jié)果如圖10所示，PEDV、TGEV、PRoV血清和豬陰性血清的D450 nm值均小于臨界值0.3，判定為陰性；PDCoV陽(yáng)性血清的D450 nm值大于臨界值0.3，判定為陽(yáng)性。結(jié)果表明建立的間接ELISA方法可與PDCoV抗體特異性反應(yīng)，具有良好的特異性。

圖10 間接ELISA方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.7重復(fù)性與穩(wěn)定性試驗(yàn) 使用建立的間接ELISA方法檢測(cè)8份PDCoV陽(yáng)性血清樣品，每個(gè)樣品重復(fù)4次，讀取D450 nm值。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如表1所示，方法的批內(nèi)變異系數(shù)為2.0%～3.5%，批間變異系數(shù)為5.8%～9.7%，變異范圍均小于10%，表明本研究建立的間接ELISA檢測(cè)方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

表1 批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)變異情況

2.2.8間接ELISA方法的初步應(yīng)用 應(yīng)用本研究建立的檢測(cè)PDCoV抗體的間接ELISA方法，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的20份PDCoV陽(yáng)性血清(1～20)和20份豬陰性血清(21～40)進(jìn)行檢測(cè)，讀取D450 nm值。結(jié)果如表2所示，20份陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，陽(yáng)性符合率為100%(20/20)；20份陰性血清檢測(cè)結(jié)果均為陰性，陰性符合率為100%(20/20)，表明間接ELISA方法的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

表2 間接ELISA方法對(duì)40份血清的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

PDCoV是一種新發(fā)現(xiàn)的腸道致病性冠狀病毒，主要引起新生仔豬腹瀉，發(fā)病率和病死率較高。PDCoV在我國(guó)各地廣泛流行，如四川、黑龍江、天津、河南等地均有該病毒的相關(guān)報(bào)道。有研究顯示[19]，目前PDCoV感染已成為導(dǎo)致我國(guó)新生仔豬死亡的重要原因之一。PDCoV感染仔豬的臨床癥狀與豬流行性腹瀉(PED)和豬傳染性胃腸炎(TGE)非常相似，臨床上難以鑒別診斷。因此，本研究的目的是建立用于PDCoV特異性抗體檢測(cè)的間接ELISA方法，從而為PDCoV感染的快速診斷和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供快速、準(zhǔn)確、有效的檢測(cè)手段。

PDCoV N蛋白是具有高度保守性和種屬特異性的結(jié)構(gòu)蛋白，且在PDCoV感染細(xì)胞過(guò)程中產(chǎn)生量最大，病毒感染宿主后最早可檢出的抗體也是針對(duì)N蛋白的特異性抗體[20]，因此，以N蛋白作為目標(biāo)蛋白建立PDCoV感染相關(guān)檢測(cè)技術(shù)具有重要意義。SU等[21]通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，制備了PDCoV N重組蛋白，表達(dá)的N蛋白能特異性結(jié)合PDCoV抗血清，具有良好的特異性，然而該研究中表達(dá)的N蛋白基本以包涵體形式存在。通常情況下以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白在純化環(huán)節(jié)操作較為復(fù)雜，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，且在蛋白變性和復(fù)性的過(guò)程中容易失敗，更為重要的是包涵體蛋白的免疫原性比可溶性蛋白差，應(yīng)用價(jià)值相對(duì)較低。為了使原核表達(dá)的PDCoV N蛋白具有可溶性且保持更好的免疫原性，本研究依據(jù)生物信息學(xué)分析和大腸桿菌密碼子使用偏嗜性規(guī)律，設(shè)計(jì)、合成了N-Opti基因片段，并將其克隆入融合表達(dá)載體pET-32a多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。表達(dá)載體pET-32a攜帶的His可溶性標(biāo)簽蛋白可以和PDCoV N蛋白進(jìn)行融合，促進(jìn)蛋白正確折疊，從而提高目的蛋白的可溶性，并且可以通過(guò)標(biāo)簽蛋白純化PDCoV N重組蛋白，簡(jiǎn)化純化的步驟。本研究經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和純化，成功制備了高純度、可溶性重組蛋白PDCoV-N-His，一系列生物學(xué)特性試驗(yàn)結(jié)果顯示制備的重組蛋白具有良好的免疫原性和特異性，為后續(xù)PDCoV抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

以可溶性的PDCoV N重組蛋白為包被抗原，并優(yōu)化各步反應(yīng)條件，建立了特異性檢測(cè)PDCoV抗體的間接ELISA方法。為了驗(yàn)證其檢測(cè)效果，使用該方法檢測(cè)20份已知背景的PDCoV陽(yáng)性血清和20份豬陰性血清，結(jié)果顯示陽(yáng)性符合率為100%(20/20)，陰性符合率為100%(20/20)，表明建立的檢測(cè)PDCoV抗體的間接ELISA方法具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，為豬群中PDCoV感染的抗體水平監(jiān)測(cè)、快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了一種血清學(xué)檢測(cè)方法。

由于目前國(guó)內(nèi)外尚未研制出預(yù)防PDCoV感染的疫苗，因此豬群只要檢出PDCoV抗體陽(yáng)性，就可以確診為PDCoV感染。本研究建立的針對(duì)PDCoV抗體的間接ELISA檢測(cè)方法適用于PDCoV感染流行病學(xué)調(diào)查中對(duì)于大批樣品的篩查，也為豬群中PDCoV感染的快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查和抗體水平監(jiān)測(cè)提供了準(zhǔn)確而有效的檢測(cè)手段。