韓秋菊，李薇，馮雅郡，王晨，陳仔君，潘睿悅，任璐，羅靜雯

(遼寧石油化工大學(xué) 石油化工學(xué)院，遼寧 撫順 113001)

藁本為傘形科植物藁本LigusticumsinenseOliv.或遼藁本LigusticumjeholenseNakaietKitag.的干燥根莖和根[1]，具有去濕除寒、緩解疼痛、抑菌抗炎、抗氧化、擴(kuò)張血管、保護(hù)肝功能等功效，常用于醫(yī)治風(fēng)濕感冒、關(guān)節(jié)疼痛等疾病，是一種重要的中藥材[2-4]。

大孔樹脂具有污染低、穩(wěn)定性高、選擇性強(qiáng)、易操作等優(yōu)點(diǎn)，常用于黃酮類化合物的分離純化[5]。本文通過D-101大孔樹脂柱層析對藁本黃酮粗提物進(jìn)行純化，并比較了純化前后藁本黃酮的體外抗氧化活性，為更好地開發(fā)藁本資源、最大限度地利用其有效成分提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

藁本，產(chǎn)自遼寧撫順；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH均為色譜純；硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、過氧化氫、水楊酸、鹽酸、硫酸亞鐵、三羥甲基氨基甲烷、無水乙醇、鄰苯三酚、抗壞血酸均為分析純。

ALC-1100.2型電子天平；Allbasic型分析研磨機(jī)；UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋；DUG-9021A型電熱恒溫干燥箱；T0Z5-WS型離心機(jī)；LGJ-10型冷凍干燥機(jī)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；SHB-Ш型循環(huán)水式多用真空泵。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藁本黃酮的提取 取烘干的藁本樣品，粉碎后過60目篩，以液料比15∶1加入75%的乙醇浸泡，超聲(200 W，40 ℃，15 min)，水浴(50 ℃，2 h)，離心(3 000 r/min，5 min)，取上清液，55 ℃濃縮，冷凍干燥，得藁本黃酮粗提物。準(zhǔn)確稱取藁本黃酮粗提物，溶于70%乙醇中制備藁本黃酮粗提液。

1.2.2 藁本黃酮含量的測定 黃酮含量按照NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測定[6]。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.290 2x-0.005 1，

R2=0.999 8。

1.2.3 藁本黃酮的純化

1.2.3.1 D-101大孔樹脂的預(yù)處理 將D-101大孔樹脂放入燒杯中，用95%乙醇浸泡12 h，充分溶脹后，濾除懸浮物，用95%乙醇反復(fù)沖洗，至加水不產(chǎn)生渾濁為止，用蒸餾水沖洗至無醇味，備用。

1.2.3.2 靜態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取2.0 g預(yù)處理過的D-101大孔樹脂，用濾紙吸干其表面水分，裝入具塞磨口三角瓶中。加入藁本黃酮粗提液30 mL，于25 ℃、100 r/min 恒溫振蕩24 h，使其充分吸附，過濾，測定濾液中黃酮濃度，計(jì)算吸附率(%)，考察上樣液黃酮濃度和pH值對D-101大孔樹脂吸附藁本黃酮性能的影響。將過濾后的樹脂裝入具塞磨口三角瓶中，再加入30 mL乙醇溶液，于25 ℃、100 r/min 恒溫振蕩24 h，使其充分解吸，過濾，測定濾液中的黃酮濃度，計(jì)算解吸率(%)，考察洗脫液濃度對D-101大孔樹脂解吸性能的影響。

吸附率=(C0-C1)/C0×100%

解吸率=(C2×V2)/[(C0-C1)×V0]×100%

式中C0——吸附前上樣液黃酮濃度，mg/mL；

C1——吸附后濾液中黃酮濃度，mg/mL；

C2——解吸液中黃酮濃度，mg/mL；

V0——上樣液體積，mL；

V2——解吸液體積，mL。

1.2.3.3 動態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn) 將預(yù)處理過的D-101大孔樹脂裝入規(guī)格為2.6 cm×50.0 cm 的玻璃層析柱中，藁本黃酮上樣液按一定流速上樣，測定流出液中黃酮的濃度，計(jì)算吸附率，考察上樣液體積和流速對D-101大孔樹脂吸附藁本黃酮性能的影響。用3 BV的水淋洗樹脂柱，之后洗脫液按一定流速解吸，測定流出液中的黃酮濃度，計(jì)算解吸率，考察洗脫液流速對D-101大孔樹脂解吸性能的影響及洗脫液用量。

1.2.3.4 藁本黃酮純化工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照優(yōu)化后的條件純化藁本黃酮，收集洗脫液，55 ℃濃縮，冷凍干燥。準(zhǔn)確稱取固體樣品，溶于70%乙醇中，計(jì)算藁本黃酮回收率(%)和純度(%)。

回收率=吸附率×解吸率×100%

純度=C×V/M×100%

式中C——藁本黃酮濃度，mg/mL；

V——藁本黃酮溶液體積，mL；

M——藁本黃酮固體樣品質(zhì)量，mg。

1.2.4 藁本黃酮體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 清除DPPH自由基 取 0.2 mmol/L DPPH 溶液2 mL，加入1 mL不同濃度的藁本黃酮樣品或VC溶液、1 mL 95%乙醇，混勻，室溫暗光下反應(yīng)30 min，以重蒸水作參比，于517 nm測定樣品吸光值，以95%乙醇為空白對照[7]，計(jì)算清除率(%)。

清除率=(AC-AS)/AC×100%

式中AC——空白組吸光度；

AS——樣品組吸光度。

以下清除率計(jì)算均用此式。

1.2.4.3 清除羥基自由基(·OH) 取10 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，加入1 mL 10 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、1 mL不同濃度的藁本黃酮樣品或VC溶液、1 mL 8.8 mmol/L的H2O2溶液，水浴(37 ℃，30 min)，以重蒸水作參比，于510 nm測定樣品吸光值，計(jì)算清除率[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 藁本黃酮純化工藝條件研究

2.1.1 上樣液pH的影響 將藁本黃酮粗提液按圖1條件調(diào)節(jié)為不同pH值的上樣液，進(jìn)行靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，上樣液濃度為2.0 mg/mL，結(jié)果見圖1。

圖1 上樣液pH值對吸附率的影響Fig.1 Effect of pH value of loading solution on adsorption rate

由圖1可知，pH值對吸附率的影響較大，pH值為4左右時(shí)，吸附率達(dá)到最大值，隨著pH值的進(jìn)一步增大，吸附率呈下降趨勢，故選擇上樣液pH值為4。

2.1.2 上樣液濃度的影響 將藁本黃酮粗提液按圖2條件稀釋為不同濃度的上樣液，進(jìn)行靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，上樣液pH為4，結(jié)果見圖2。

圖2 上樣液濃度對吸附率的影響Fig.2 Effect of loading solution concentration on adsorption rate

由圖2可知，在上樣液濃度>2.5 mg/mL后，吸附率明顯下降，故上樣液濃度選擇2.5 mg/mL。

2.1.3 上樣液體積的影響 將濃度為2.5 mg/mL、pH 4的藁本黃酮上樣液以2 mL/min 流速上樣，按柱體積倍數(shù)分段收集流出液，測量流出液中黃酮濃度，結(jié)果見圖3。

圖3 上樣液體積的影響Fig.3 Effect of loading solution volume

由圖3可知，當(dāng)上樣量增加到0.5 BV 時(shí)，流出液中開始出現(xiàn)藁本黃酮，當(dāng)上樣液到2.5 BV時(shí)，測定流出液黃酮濃度為0.24 mg/mL，接近于上樣液濃度的10%，此時(shí)即為曲線的泄露點(diǎn)，故上樣液體積選擇2.5 BV。

2.1.4 上樣液流速的影響 分別取7組2.5 BV濃度為2.5 mg/mL、pH 4的上樣液，以不同上樣流速上樣，進(jìn)行動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，吸附率隨上樣液流速增加而減小，流速>3 mL/min后，吸附率下降明顯，吸附不完全，故上樣液流速選擇3 mL/min。

圖4 上樣液流速對吸附率的影響Fig.4 Effect of loading liquid velocity on adsorption rate

2.1.5 洗脫液濃度的影響 分別以不同濃度的乙醇溶液作為洗脫液進(jìn)行靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖5。

圖5 洗脫液濃度對解吸率的影響Fig.5 Effect of eluent concentration on desorption rate

由圖5可知，隨洗脫液濃度的增加，藁本黃酮的解吸率逐漸增大，當(dāng)洗脫液的濃度為70%時(shí)，解吸率達(dá)到最大值，故洗脫液濃度選擇70%。

2.1.6 洗脫液流速的影響 將 2.5 BV 濃度為 2.5 mg/mL、pH 4的上樣液按3 mL/min 的流速上樣，3 BV水淋洗層析柱，用70%乙醇分別按不同流速進(jìn)行動態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖6。

圖6 洗脫液流速對解吸率的影響Fig.6 Effect of eluent flow rate on adsorption rate

由圖6可知，隨洗脫液流速的增加，藁本黃酮的解吸率先略升高，當(dāng)洗脫液流速為 2 mL/min 時(shí)，曲線具有最高點(diǎn)，繼續(xù)增加洗脫液流速，解吸率下降明顯，故洗脫液流速選擇2 mL/min。

2.1.7 洗脫液體積的影響 將2.5 BV濃度 2.5 mg/mL、pH 4的上樣液按3 mL/min 的流速上樣，3 BV水淋洗層析柱，用70%乙醇以3 mL/min流速洗脫，按柱床體積對解吸液進(jìn)行分段收集，測量解吸液中的黃酮濃度，結(jié)果見圖7。

圖7 洗脫液體積的影響Fig.7 Effect of eluent volume

由圖7可知，洗脫液用量為 5 BV 時(shí)，吸附的黃酮基本被解吸完全，故洗脫液用量5 BV左右為宜。

2.1.8 純化工藝驗(yàn)證 按照上述實(shí)驗(yàn)得到的最佳純化工藝條件對藁本黃酮粗提液進(jìn)行純化，藁本黃酮的回收率達(dá)到81.88%，純化后樣品純度達(dá)到71.09%，比純化前純度(34.76%)高出2.05倍，說明此純化工藝效果較好。

2.2 藁本黃酮純化前后體外抗氧化活性研究

2.2.1 對DPPH自由基清除率的測定 由圖8可知，VC和粗提、純化藁本黃酮對DPPH自由基的清除率均隨樣品濃度的增加呈上升趨勢，清除DPPH自由基的IC50值分別為140.2，862.1，386.8 μg/mL，純化后藁本黃酮清除DPPH自由基的能力增強(qiáng)，略低于VC，但明顯高于粗提藁本黃酮。

圖8 藁本黃酮對DPPH自由基的清除能力Fig.8 Scavenging ability of Ligusticum flavonoids on DPPH free radical

圖9 藁本黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.9 Scavenging ability of Ligusticum flavonoids on superoxide anion radical

2.2.3 對羥基自由基(·OH)清除率的測定 由圖10可知，VC和粗提、純化藁本黃酮對·OH的清除率均隨樣品濃度的增加呈上升趨勢，清除·OH的IC50值分別為348.4，1 689.4，953.3 μg/mL，純化后藁本黃酮清除·OH的能力增強(qiáng)，雖明顯低于VC，但高于粗提藁本黃酮。

圖10 藁本黃酮對羥基自由基的清除能力Fig.10 Scavenging ability of Ligusticum flavonoids on hydroxyl radical

3 結(jié)論

采用D-101大孔樹脂對藁本黃酮粗提液進(jìn)行純化的最佳工藝為：將體積為2.5 BV、濃度2.5 mg/mL、pH 4的上樣液以3 mL/min流速上樣后，用體積5 BV、濃度 70%的乙醇溶液以2 mL/min流速洗脫，此條件下藁本黃酮回收率可達(dá)81.88%，樣品純度達(dá)到71.09%。

純化前后的藁本黃酮均具有一定的體外抗氧化活性。純化后藁本黃酮的抗氧化活性明顯增強(qiáng)，其清除DHHP自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的IC50值分別為386.8，764.0，953.3 μg/mL。