秦義人，王達(dá)鵬，趙紅如，方琪

氯吡格雷是一種在冠心病和缺血性腦卒中發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用的前體藥物，其必須經(jīng)人體中肝細(xì)胞色素P450（CYP）酶同工酶CYP2C19代謝生成活性產(chǎn)物，不可逆地阻斷P2Y12受體，從而發(fā)揮抗血小板的生物學(xué)效應(yīng)［1］。研究表明CYP2C19基因多態(tài)性（尤其是CYP2C19*2 和CYP2C19*3）在冠心病患者中與臨床預(yù)后高度相關(guān)［2］。然而，CYP2C19基因多態(tài)性與缺血性腦血管病的相關(guān)性目前仍存在爭(zhēng)議，尤其是在大動(dòng)脈粥樣硬化型腦卒中或小卒中人群中缺乏相關(guān)研究。以往研究認(rèn)為，腦卒中患者的CYP2C19酶活性減少與卒中不良臨床預(yù)后相關(guān)，亦有研究并未發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)性［3-4］，產(chǎn)生這種差異的機(jī)制解釋為年齡可能在其中扮演了重要角色。既往研究表明，CYP酶活性在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人體中均呈年齡依賴性降低，從而影響其藥物代謝效率［5-6］。因此，本研究通過分析不同年齡層大動(dòng)脈粥樣硬化型小卒中患者CYP2C19基因多態(tài)性與臨床預(yù)后的相關(guān)性，為優(yōu)化特定類型患者的二級(jí)預(yù)防策略提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年4月—2018年4月在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的大動(dòng)脈粥樣硬化型小卒中患者479例作為研究對(duì)象，年齡≤60歲169例，年齡＞60歲310例。大動(dòng)脈粥樣硬化型卒中的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2014》中缺血性腦卒中標(biāo)準(zhǔn)［7］，小卒中定義為美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評(píng)分≤3分［8］。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）48 h內(nèi)首次發(fā)生的急性缺血性腦卒中；（2）年齡28～90歲；（3）入組時(shí)僅同意使用氯吡格雷單抗血小板而非早期雙抗血小板治療方案。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）在入院前1個(gè)月、住院和隨訪期間接受了溶栓、抗凝、其他抗血小板藥物治療方案；（2）對(duì)氯吡格雷過敏；（3）近6個(gè)月內(nèi)有顱內(nèi)出血史；（4）診斷為血小板減少癥、惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎疾病、心功能不全；（5）有卒中或短暫性腦缺血發(fā)作病史；（6）住院和隨訪期間行頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除手術(shù)或頸動(dòng)脈支架成形術(shù)，中途改用其他抗血小板藥物或停服氯吡格雷的患者。本研究經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)〔（2020）倫研批第061號(hào)〕?；颊呋蚣覍倬炇鹬橥鈺?。

1.2 樣本量計(jì)算 根據(jù)假定的不良預(yù)后率使用PASS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行樣本量估算；根據(jù)以往中國(guó)人群中的報(bào)道，CYP2C19 功能變異型（loss of function，LOF）等位基因（*2、*3）攜帶者和非攜帶者腦卒中不良預(yù)后發(fā)生率分別為24%和12%，而CYP2C19 LOF等位基因（*2、*3）攜帶和非攜帶者的比例分別為60%和40%［9-10］，計(jì)算得出需入組415例患者才能滿足雙側(cè)檢驗(yàn)、顯著性為0.05、把握度90%的統(tǒng)計(jì)要求。

1.3 方法

1.3.1 治療及資料收集 患者均接受氯吡格雷口服治療75 mg/次、1次/d，為期1年。住院期間收集患者的基線資料，包括年齡、NIHSS評(píng)分、血糖水平、高密度脂蛋白（HDL）水平、低密度脂蛋白（LDL）水平、總膽固醇（TC）水平、三酰甘油（TG）水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、糖尿病史、高血壓史、CYP2C19 LOF等位基因、吸煙情況（連續(xù)或累積吸煙半年以上，每日超過1支，且仍然吸煙）、飲酒情況（男性平均每日大于4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位，女性大于3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位）、性別?；颊咴谌朐汉统鲈簳r(shí)均接受2次常規(guī)心電圖或Holter檢查來排除心源性栓塞的可能?；驒z測(cè)的血樣均在患者入院當(dāng)天采集，收集在EDTA管內(nèi)，DNA提取使用商業(yè)化萃取試劑盒。根據(jù)CYP2C19 LOF等位基因攜帶狀態(tài)將患者分為攜帶組和非攜帶組。由于樣本量偏小，本研究中未將患者分為快代謝型、中間代謝型、慢代謝型。

1.3.2 隨訪 研究隨訪開始時(shí)間為2015年7月，最終截止時(shí)間為2019年5月。隨訪方法：通過門診、電話隨訪等方式在患者出院后3個(gè)月和1年時(shí)進(jìn)行隨訪，記錄患者服藥情況、出現(xiàn)缺血性腦卒中復(fù)發(fā)（包括短暫性腦缺血發(fā)作）和長(zhǎng)期功能預(yù)后及其發(fā)生時(shí)間。在隨訪3個(gè)月和1年后，由專業(yè)的神經(jīng)科醫(yī)生通過隨訪記錄每個(gè)患者的卒中復(fù)發(fā)情況，采用改良Rankin 評(píng)分量表（mRS）對(duì)患者的神經(jīng)功能缺損及預(yù)后進(jìn)行判定［11］：完全無癥狀者為0分；有癥狀，但無明顯功能障礙，能完成所有日常職責(zé)和活動(dòng)者1分；輕度殘疾，不能完成病前所有活動(dòng)，但不需要幫助，能自理者2分；中度殘疾，要求部分幫助，但行走不需要幫助者3分；重度殘疾，不能獨(dú)立行走，無他人幫助不能滿足自身需要者4分；嚴(yán)重殘疾，臥床、失禁、需要持續(xù)護(hù)理及關(guān)注者5分；死亡者6分。mRS≤2分為臨床預(yù)后良好（預(yù)后良好組），mRS＞2分為臨床預(yù)后不良（預(yù)后不良組）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；CYP2C19 LOF等位基因攜帶和臨床預(yù)后的相關(guān)性與年齡間的交互效應(yīng)采用Breslow-Day檢驗(yàn)和Tarone's檢驗(yàn)；采用二元Logistic回歸法分析交互效應(yīng)大?。徊捎枚嘁蛩豅ogistic回歸分析探討臨床預(yù)后及復(fù)發(fā)/死亡的影響因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同年齡段不同預(yù)后患者基線資料比較 年齡≤60歲患者：預(yù)后良好組與預(yù)后不良組NIHSS評(píng)分、血糖水平、LDL水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、糖尿病比例、高血壓比例、CYP2C19 LOF等位基因、吸煙比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組年齡、HDL水平、TC水平、TG水平、飲酒比例、性別比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。年齡＞60歲患者：預(yù)后良好組與預(yù)后不良組血糖水平、HDL水平、LDL水平、TG水平、糖尿病比例、高血壓比例、性別比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組年齡、NIHSS評(píng)分、TC水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、CYP2C19 LOF等位基因、吸煙比例、飲酒比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表1 年齡≤60歲的不同預(yù)后患者基線資料比較Table 1 Comparison of baseline data of patients aged ≤ 60 years with good and poor outcome

表2 年齡＞60歲的不同預(yù)后患者基線資料比較Table 2 Comparison of baseline data of patients aged ＞60 years with good and poor outcome

2.2 不同年齡段不同CYP2C19 基因型患者基線資料的比較 年齡≤60歲和＞60歲患者中，不同CYP2C19基因型患者年齡、NIHSS評(píng)分、血糖水平、LDL水平、HDL水平、TC水平、TG水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、糖尿病比例、高血壓比例、吸煙比例、飲酒比例、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3～4。

表3 年齡≤60歲的不同CYP2C19 LOF等位基因攜帶患者基線資料比較Table 3 Comparison of baseline data of CYP2C19 LOF allele carriers and non-carriers aged ≤ 60 years

表4 年齡＞60歲的不同CYP2C19 LOF等位基因攜帶患者基線資料比較Table 4 Comparison of baseline data of CYP2C19 LOF allele carriers and non-carriers aged ＞ 60 years

2.3 CYP2C19 LOF等位基因攜帶與年齡間的交互效應(yīng)Breslow-Day檢驗(yàn)：CYP2C19 LOF等位基因攜帶和臨床預(yù)后的相關(guān)性與年齡間存在交互效應(yīng)（χ2=6.352，P=0.012），Tarone's檢驗(yàn)：CYP2C19 LOF等位基因攜帶和臨床預(yù)后的相關(guān)性與年齡間存在交互效應(yīng)（χ2=6.351，P=0.012）。使用二元Logistic回歸法分析交互效應(yīng)大小，以是否出現(xiàn)預(yù)后不良（賦值：無=0，有=1）為因變量，以CYP2C19 LOF等位基因攜帶情況（賦值：非攜帶=0，攜帶=1）、年齡（賦值：＞60歲=0，≤60歲=1）為自變量，以CYP2C19 LOF等位基因×年齡分層為交互項(xiàng)，分析顯示，交互效應(yīng)的大小比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P=0.013，OR=3.63，95%CI（1.31，10.07）〕， 見表5。此外，不同年齡層患者CYP2C19 LOF等位基因與卒中后3個(gè)月卒中復(fù)發(fā)/死亡相關(guān)性差異并無異質(zhì)性，見表6。而在所有研究患者中，CYP2C19 LOF等位基因攜帶患者3個(gè)月卒中復(fù)發(fā)/死亡比例為9.7%，與非攜帶患者的比例3.9%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.151，P=0.023）。

表5 不同年齡層的同質(zhì)性檢驗(yàn)和CYP2C19 LOF等位基因攜帶與年齡的交互效應(yīng)分析Table 5 Test of homogeneity of the interaction effect between CYP2C19 LOF allele carriage and age in different age groups

表6 不同年齡層CYP2C19 LOF基因攜帶與卒中復(fù)發(fā)/死亡的相關(guān)性分析〔n（%）〕Table 6 Correlation analysis of CYP2C19 LOF gene carriage and stroke recurrence/death in different agegroups

2.4 不同年齡段患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析分別以是否出現(xiàn)預(yù)后不良（賦值：無=0，有=1）、是否出現(xiàn)復(fù)發(fā)/死亡（賦值：無=0，有=1）為因變量，以CYP2C19 LOF等位基因攜帶情況（賦值：無=0，有=1）、高血壓史（賦值：無=0，有=1）、糖尿病史（賦值：無=0，有=1）、吸煙（賦值：無=0，有=1）、飲酒（賦值：無=0，有=1）、性別（賦值：女=0，男=1）、NIHSS評(píng)分（賦值：實(shí)測(cè)值）、血糖（賦值：實(shí)測(cè)值）、TC（賦值：實(shí)測(cè)值）、TG（賦值：實(shí)測(cè)值）、LDL（賦值：實(shí)測(cè)值）、HDL（賦值：實(shí)測(cè)值）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（賦值：實(shí)測(cè)值）為自變量，進(jìn)行多因素 Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，年齡≤60歲的患者中，CYP2C19 LOF等位基因、高血壓史、糖尿病史、吸煙、LDL水平可能是臨床預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（P＜0.05），見表7；年齡＞60歲的患者中，高血壓史、糖尿病史、飲酒、男性、血糖水平、HDL水平可能是臨床預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（P＜0.05），見表8。多因素Logistic回歸模型分析顯示，以是否出現(xiàn)3個(gè)月卒中復(fù)發(fā)/死亡為自變量（賦值：無=0，有=1），在控制CYP2C19 LOF等位基因、高血壓史、糖尿病史、吸煙、飲酒、性別、NIHSS 評(píng)分、血糖水平、TC水平、TG水平、LDL水平、HDL水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（賦值情況同2.4）上述臨床混雜因素后，尚不能肯定CYP2C19 LOF是該類研究患者卒中后3個(gè)月卒中復(fù)發(fā)/死亡的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（P＞0.05），見表9。

表7 年齡≤60歲患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析Table 7 Multivariate Logistic regression analysis of factors possibly associated with the outcome in patients ≤ 60 years old

表8 年齡＞60歲患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析Table 8 Multivariate Logistic regression analysis of factors possibly associated with the outcome in patients aged ＞60 years

表9 患者卒中后3個(gè)月卒中復(fù)發(fā)/死亡多因素Logistic回歸分析Table 9 Multivariate Logistic regression analysis of factors possibly associated with stroke recurrence or death in patients three months after stroke

3 討論

氯吡格雷是一種噻吩并吡啶類前體藥物，作為一種經(jīng)典的抗血小板聚集藥物，廣泛應(yīng)用在心腦血管疾病的治療，且證實(shí)了其有效性和安全性。然而，在臨床上有部分患者接受氯吡格雷治療后仍發(fā)生缺血性卒中事件，考慮這些患者存在氯吡格雷抵抗（clopidogrelresistance，CR）。引起CR的原因眾多，其中藥物基因多態(tài)性被認(rèn)為是CR最重要的內(nèi)在因素［12］。CR的發(fā)生機(jī)制與氯吡格雷的代謝過程有關(guān)，氯吡格雷口服后約15%經(jīng)兩步代謝轉(zhuǎn)化，由CYP2C19催化為具有抗血小板聚集效果的活性成分。既往國(guó)內(nèi)外研究表明，*1型、*2型、*3型為氯吡格雷代謝相關(guān)CYP2C19酶的等位基因，其中，CYP2C19*2與*3變異型為功能變異型等位基因，該變異可降低CYP2C19酶活性，使其經(jīng)肝臟代謝后的活性產(chǎn)物不足，從而出現(xiàn)CR［12-13］。在我國(guó)人群中，CYP2C19*2型、*3型的比例較國(guó)外人群高［14-15］。因此，CYP2C19基因多態(tài)性對(duì)我國(guó)急性缺血性腦卒中患者使用氯吡格雷治療的效果可能存在較大影響。然而，目前研究表明，CYP2C19基因多態(tài)性與不同臨床結(jié)局的相關(guān)性仍存在爭(zhēng)議［3-4］，同時(shí)，其在不同年齡人群或者不同腦卒中亞類中的作用尚不清楚。因此，本研究探討在不同年齡層接受氯吡格雷治療的大動(dòng)脈粥樣硬化型小卒中患者中CYP2C19基因多態(tài)性與臨床預(yù)后的相關(guān)性。

卒中的臨床結(jié)局首先與不同的評(píng)估手段相關(guān)。mRS被認(rèn)為更適合評(píng)估患者的長(zhǎng)期臨床預(yù)后［16］，尤其在首次發(fā)生卒中或小卒中患者的長(zhǎng)期隨訪中，其具有較高的臨床預(yù)測(cè)價(jià)值［17］。而且，該量表在不同測(cè)評(píng)者間的可靠性一致性較高，同時(shí)具有較高的臨床評(píng)測(cè)敏感性，對(duì)得出陽性結(jié)果的樣本量要求也較小［18］。因此，本研究使用mRS作為臨床預(yù)后的評(píng)價(jià)工具。國(guó)內(nèi)外研究表明，除了CYP2C19基因多態(tài)性，臨床因素、細(xì)胞因素對(duì)缺血性腦卒中患者的臨床結(jié)局也有重要影響［19］。臨床因素包括患者并發(fā)癥的多少和嚴(yán)重程度，例如糖尿病、高血壓、高脂血癥、血糖、NIHSS評(píng)分等。因此，本研究納入臨床常見的缺血性腦卒中危險(xiǎn)因素來控制臨床的混雜因素，結(jié)果顯示，NIHSS評(píng)分、血糖水平、LDL水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、糖尿病比例、高血壓比例、CYP2C19基因多態(tài)性比例、吸煙比例在年齡≤60歲不同臨床預(yù)后的患者中存在差異，在＞60歲患者中，則在血糖水平、HDL水平、LDL水平、TG水平、糖尿病比例、高血壓比例、性別的比例上存在差異。提示這些指標(biāo)可能是影響臨床結(jié)局的重要因素，與既往研究結(jié)論一致［20-21］。細(xì)胞因素方面主要包括血小板更新速度、肝臟代謝酶水平等。本研究結(jié)果同時(shí)顯示，隨著年齡分層的改變，CYP2C19基因多態(tài)性和長(zhǎng)期功能預(yù)后的相關(guān)性在年齡層間存在異質(zhì)性，提示在接受氯吡格雷治療的大動(dòng)脈粥樣硬化型小卒中患者中，年輕患者的長(zhǎng)期功能預(yù)后與CYP2C19功能變異型等位基因的相關(guān)性可能較年老患者更強(qiáng)。目前直接探索其相關(guān)機(jī)制的國(guó)內(nèi)外研究尚無報(bào)道，推測(cè)其原因可能為肝臟代謝酶水平的高低在其中發(fā)揮了重要作用。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人體中CYP的酶活性在年老組中均大幅下降［5-6］，因而CYP2C19基因多態(tài)性對(duì)CYP2C19酶活性的影響在年輕患者中可能更明顯。本研究結(jié)果還顯示，在年齡≤60歲的患者中，CYP2C19 LOF等位基因、高血壓史、糖尿病史、吸煙、LDL水平均可能是長(zhǎng)期功能預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。而在年齡＞60歲的患者中，高血壓史、糖尿病史、飲酒、男性、血糖水平、HDL水平可能是長(zhǎng)期功能預(yù)后的預(yù)測(cè)因子。該結(jié)論與既往研究結(jié)果一致［22-23］，表明臨床的長(zhǎng)期功能預(yù)后是多種因素協(xié)同作用的結(jié)果，在不同年齡層中的影響因素也不盡相同。推測(cè)其原因可能為年齡對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的形成存在一定的影響。顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的時(shí)間較顱外動(dòng)脈更晚［24-25］，且顱內(nèi)動(dòng)脈對(duì)高膽固醇血癥誘發(fā)脂紋形成的耐受性更好，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂等血栓誘導(dǎo)事件發(fā)生率更低［24，26］。因此，氯吡格雷的抗血小板治療可能在年輕的大動(dòng)脈粥樣硬化型小卒中患者中更有效。最后，本研究結(jié)果顯示，雖然在所有研究患者中，不同基因攜帶患者3個(gè)月卒中復(fù)發(fā)/死亡比例有差異，然而尚不能肯定CYP2C19 LOF等位基因是該類研究患者卒中后3個(gè)月卒中復(fù)發(fā)/死亡的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。原因可能與研究人群樣本過少，缺乏對(duì)研究人群服藥依從性、影響氯吡格雷療效的其他藥物使用情況等記錄有關(guān)。例如，質(zhì)子泵抑制劑（PPIs）及鈣離子拮抗劑（CCBs）可能會(huì)因共同競(jìng)爭(zhēng)CYP2C19的同一結(jié)合位點(diǎn)而發(fā)生與氯吡格雷藥物間的相互作用［27-28］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CYP2C19 LOF等位基因是接受氯吡格雷治療的大動(dòng)脈粥樣硬化型小卒中患者長(zhǎng)期功能預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，該因素的影響可能與年齡呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)，不同年齡層該類患者長(zhǎng)期功能預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素也不盡相同，對(duì)該類型患者提供的二級(jí)預(yù)防策略可能需要綜合年齡方面考慮。本研究存在以下局限性：研究的樣本量較少、選擇偏倚及單中心住院患者。此外，血漿中的氯吡格雷活性代謝物濃度并未檢測(cè)，在基線資料和后期的隨訪中，影響氯吡格雷藥物活性的藥物、其他基因攜帶信息未做記錄和測(cè)試。最后，一些非基因相關(guān)因素如飲食習(xí)慣、環(huán)境因素等也未做相應(yīng)的記錄和校正。因此，未來還需擴(kuò)大樣本量，并通過多中心研究來進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)論，為臨床提供更有力的數(shù)據(jù)支持。

作者貢獻(xiàn)：秦義人進(jìn)行論文構(gòu)思撰寫、設(shè)計(jì)和實(shí)施研究、數(shù)據(jù)采集、統(tǒng)計(jì)分析、經(jīng)費(fèi)支持；王達(dá)鵬采集分析數(shù)據(jù)、指導(dǎo)論文修改；趙紅如、方琪進(jìn)行研究指導(dǎo)、論文指導(dǎo)、額外績(jī)效支出。

本文無利益沖突。