周 瑤，李 晶

(1. 湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100; 2. 湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 湖州 313000)

宮頸癌是全球女性中第四大常見(jiàn)癌癥[1]，也是很多國(guó)家女性腫瘤患者死亡的第三大原因。目前宮頸癌的治療手段包括手術(shù)、放療和化療，效果有限，復(fù)發(fā)率高，各種副作用大。據(jù)報(bào)道，鞣花酸是一種多酚類(lèi)物質(zhì)[2]，是沒(méi)食子酸的二聚體衍生物，具有反式?jīng)]食子酸的單寧結(jié)構(gòu)，具有各種活性，包括抗炎、抗氧化、抗病毒和抗癌活性[3]，但鞣花酸對(duì)宮頸癌細(xì)胞的殺傷作用及其機(jī)制目前報(bào)道尚少。我們推測(cè)鞣花酸可抑制人宮頸癌細(xì)胞探討鞣花酸對(duì)宮頸癌細(xì)胞的作用及分子機(jī)制，探索新的潛在治療方法對(duì)于加強(qiáng)宮頸癌的防治具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 GRP78(#3177)、CHOP(#2895)、PERK(#5683)、pPERK(#3179)、Bcl-2(#15071)、Bax(#5023)、cleaved caspase-3(#9661)、β-actin(#3700)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；IRE1(ab37073)、p-IRE1(ab124945)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；鞣花酸(#E2250)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；BCA蛋白定量試劑盒，購(gòu)自VazymE公司。

1.1.2儀器 凝膠成像系統(tǒng)(上海嘉鵬科技有限公司)；電泳槽、電轉(zhuǎn)膜儀(伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(北京楠華科技開(kāi)發(fā)有限公司)；超凈工作臺(tái)(吳江市偉峰凈化設(shè)備有限公司)；恒溫空氣浴搖床(上海晶壇儀器制造有限公司)；細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)；CKX41倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1鞣花酸的配制 用DMSO溶解鞣花酸，使其達(dá)到100 mmol·L-1作為母液，用DMEM稀釋成工作液，渦旋混勻后使用。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)(中國(guó)上海)。細(xì)胞是在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(Invitrogen)中添加10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的濕化培養(yǎng)箱中。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 1)MTT實(shí)驗(yàn)分組：①鞣花酸濃度梯度: control組(空白對(duì)照組加入同等體積的PBS)、鞣花酸(1、5、30、100 μmol·L-1)刺激24 h組。②鞣花酸時(shí)間梯度: control組(空白對(duì)照組加入同等體積的PBS)、鞣花酸(30 μmol·L-1)刺激0、12、24、48 h組。

2)流式細(xì)胞及熒光顯微鏡檢測(cè)：control組(同等體積的PBS)、鞣花酸(1、5、30、100 μmol·L-1)刺激24 h組。

3)免疫印跡法：①鞣花酸濃度梯度: control組(同等體積的PBS)、鞣花酸(1、5、30、100 μmol·L-1)刺激24 h組。②抑制劑干擾試驗(yàn): control組(同等體積的PBS)、鞣花酸(30 μmol·L-1)刺激24 h組、鞣花酸 30 μmol·L-1+4-phenylbutyric acid(4-PBA)20 μmol·L-1組。

1.2.4MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 采用MTT法測(cè)定鞣花酸對(duì)Hela細(xì)胞生存率的影響。在96孔板中培養(yǎng)1×104個(gè)細(xì)胞，在37 ℃條件下用不同濃度的鞣花酸刺激細(xì)胞24 h；另一組實(shí)驗(yàn)中，用10 μmol·L-1鞣花酸刺激細(xì)胞0、12、24、48 h。然后，取出培養(yǎng)基，加入MTT，37 ℃下孵育4 h，加入150 μL DMSO，在570 nm處用micro-plate reader(Thermo Fisher Scientific, Inc.)讀取吸光度。

1.2.5TUNEL(TdT-mediated dUTP nick-end labeling)染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞在玻片上培養(yǎng)，暴露于橙皮素中24 h。載玻片在4%多聚甲醛溶液中固定30 min，0.2% Triton X-100處理5 min，PBS洗滌兩次，末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶熒光素標(biāo)記。隨后，細(xì)胞在室溫環(huán)境下用DAPI(4′,6-Diamidino-2-Phenylindole，Dihydrochloride)染色3 min。所有圖像均使用模型DMi8(徠卡微系統(tǒng)有限公司，德國(guó))獲取。

1.2.6免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 細(xì)胞裂解30 min后，13 000×g離心20 min。上清蛋白采用BCA試劑盒定量，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。然后使用半干轉(zhuǎn)移裝置或濕轉(zhuǎn)移裝置將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜被封閉在5%的牛奶中1 h，用抗體孵育，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的化學(xué)顯微鏡微型成像系統(tǒng)進(jìn)行可視化處理。條帶使用ImageJ軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 鞣花酸對(duì)人宮頸癌細(xì)胞生存率的影響體外培養(yǎng)人宮頸癌Hela細(xì)胞，分組處理不同濃度鞣花酸24 h。如Fig 1A所示，隨著鞣花酸濃度的增加，細(xì)胞生存率呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性下降趨勢(shì)，尤其鞣花酸濃度在30 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞生存率開(kāi)始出現(xiàn)明顯降低(P<0.05)。Fig 1B結(jié)果顯示，30 μmol·L-1的鞣花酸刺激細(xì)胞0、12、24、48 h后，細(xì)胞生存率呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性下降趨勢(shì)，尤其在24 h時(shí)，細(xì)胞生存率開(kāi)始出現(xiàn)明顯降低(P<0.05)。

Fig 1 Effect of ellagic acid on survival rate of human cervical cancer cells

2.2 鞣花酸對(duì)人宮頸癌細(xì)胞凋亡水平的影響如Fig 2所示，經(jīng)熒光顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同濃度鞣花酸刺激細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)TUNEL標(biāo)記的紅色熒光呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性增強(qiáng)趨勢(shì)，尤其鞣花酸濃度為30 μmol·L-1時(shí)細(xì)胞內(nèi)紅色熒光開(kāi)始出現(xiàn)明顯增加(P<0.05)。如Fig 3所示，經(jīng)流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同濃度鞣花酸刺激細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)紅色熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性增加趨勢(shì)，尤其鞣花酸濃度在30 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)紅色熒光開(kāi)始出現(xiàn)明顯增加(P<0.05)。

Fig 2 Effect of ellagic acid on apoptosis of human cervical cancer cells detected by fluorescence microscopy (scale bar: 50 μm)

Fig 3 Effect of ellagic acid on apoptosis of human cervical cancer cells detected by flow cytometry

2.3 鞣花酸對(duì)人宮頸癌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)-線(xiàn)粒體凋亡通路的影響如Fig 4A及4B所示，不同濃度鞣花酸刺激Hela細(xì)胞24 h時(shí)，ERS信號(hào)通路蛋白GRP78、CHOP、p-PERK及p-IRE1蛋白表達(dá)呈濃度依賴(lài)性升高趨勢(shì)(P<0.05)，鞣花酸給藥濃度為30 μmol·L-1時(shí)蛋白表達(dá)開(kāi)始明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。如Fig 5A所示，不同濃度鞣花酸刺激Hela細(xì)胞24 h時(shí)，線(xiàn)粒體抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)呈濃度依賴(lài)性降低趨勢(shì)(P<0.05)，線(xiàn)粒體促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3表達(dá)呈濃度依賴(lài)性升高趨勢(shì)(P<0.05)，鞣花酸給藥濃度為30 μmol·L-1時(shí)，蛋白表達(dá)的變化開(kāi)始，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。如Fig 5B所示，鞣花酸給藥濃度為30 μmol·L-1時(shí)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Bax、cleaved caspase-3等蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。而預(yù)處理ERS抑制劑4-PBA可以明顯抵消鞣花酸的促凋亡作用(P<0.05)。

Fig 4 Effects of ellagic acid on expression of

Fig 5 Effect of ellagic acid on expression of mitochondrial apoptosis pathway related proteins in human cervical cancer cells n=3)

3 討論

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一[4]，嚴(yán)重威脅著婦女的健康。宮頸癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，死亡率也高[5-7]。因此，如何抑制腫瘤的生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，降低死亡率，延長(zhǎng)患者的無(wú)病生存，提高生活質(zhì)量，是目前亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

在該研究中，我們采用不同濃度的鞣花酸(1、5、30、100 μmol·L-1)分別處理宮頸癌Hela細(xì)胞24及48 h，發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞的生存率有濃度及時(shí)間依賴(lài)性降低的趨勢(shì)，尤其用30 μmol·L-1鞣花酸刺激24 h時(shí)Hela細(xì)胞的生存率開(kāi)始出現(xiàn)明顯的降低。這個(gè)結(jié)果提示我們，鞣花酸可以對(duì)宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)起到明顯的抑制作用。為了進(jìn)一步觀察鞣花酸對(duì)宮頸癌細(xì)胞的促凋亡作用，我們用TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光強(qiáng)度，從結(jié)果可以看出，鞣花酸可以明顯增加細(xì)胞內(nèi)紅色熒光，呈濃度依賴(lài)性趨勢(shì)。這些結(jié)果充分地說(shuō)明了鞣花酸對(duì)宮頸癌細(xì)胞的促凋亡作用。

在腫瘤發(fā)生的過(guò)程中，細(xì)胞經(jīng)常會(huì)遇到缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺失、蛋白酶體功能障礙和蛋白質(zhì)突變等問(wèn)題。癌細(xì)胞由于不受控制的增殖和生長(zhǎng)，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的折疊和組裝能力要求很高，這可能導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白的積累，觸發(fā)ERS[9]。最近的研究通過(guò)揭示未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、炎癥、腫瘤血管生成、腫瘤侵襲性、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，增加了我們對(duì)ERS與腫瘤生物學(xué)關(guān)系的了解[10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白穩(wěn)定被強(qiáng)調(diào)為癌癥發(fā)展和侵襲性的關(guān)鍵因素之一[11]，一些UPR成分如GRP78[12]和CHOP[13]已被報(bào)道為獨(dú)立預(yù)后的生物標(biāo)志物。ERS時(shí)，從PERK、IRE1等ER跨膜蛋白GRP78解離，發(fā)生蛋白折疊，UPR通路激活[14]，上調(diào)凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白CHOP的表達(dá)，有報(bào)道也提出，CHOP上調(diào)與線(xiàn)粒體通路相關(guān)[15]。本研究結(jié)果提示，鞣花酸可以誘發(fā)人宮頸癌細(xì)胞內(nèi)ERS相關(guān)蛋白GRP78、p-PERK、p-IRE1、CHOP的表達(dá)及線(xiàn)粒體促凋亡蛋白BAX及cleaved caspase-3的表達(dá)，同時(shí)降低線(xiàn)粒體抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，而預(yù)處理ERS抑制劑可以明顯逆轉(zhuǎn)鞣花酸誘發(fā)的線(xiàn)粒體凋亡相關(guān)蛋白的改變。這些結(jié)果表明，鞣花酸可以調(diào)控人宮頸癌細(xì)胞內(nèi)ERS-線(xiàn)粒體凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，鞣花酸能通過(guò)ERS信號(hào)通路的調(diào)控，導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能紊亂，最終誘導(dǎo)線(xiàn)粒體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腫瘤細(xì)胞殺傷作用，本研究為鞣花酸的抗腫瘤應(yīng)用提供了依據(jù)和理論基礎(chǔ)。