王佳慧，汪 磊，彭 岳，原鮮玲，趙鐵建，鄭 洋

(廣西中醫(yī)藥大學 1.賽恩斯新醫(yī)藥學院醫(yī)學系，2.基礎醫(yī)學院 生理教研室，廣西 南寧 530222)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是肝臟對于各種慢性刺激的損傷修復反應，主要以肝星狀細胞 (hepatic stellate cells，HSC)受到外界刺激被活化從而產生大量細胞外基質(extracellular matrix，ECM)沉積為主要特點，HF是慢性肝病進程中的關鍵階段，進一步發(fā)展會導致肝硬化，甚至肝癌，有研究表明恰當有效的治療措施可以逆轉HF[1-3]。

微小RNAs(microRNA，miRNA)屬于非編碼小核糖核酸中的一類，主要通過與mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)的結合調控mRNA的表達，從而調控蛋白質的合成，導致其可以參與細胞增殖和分化、細胞死亡、代謝和信號轉導等生物過程的調節(jié)[4-5]。在HF方面，目前研究認為miRNA主要通過影響HSC的增殖及活化、ECM的產生及降解、信號轉導等多個方面參與HF發(fā)生、發(fā)展過程。如miR-150和miR-194的過表達可抑制LX2細胞增殖、下調CollagenI和α-SMA表達[6]；miR-125b在多種肝病中表達失調，在非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)小鼠模型中，miR-125b通過調控RhoA通路，從而導致HF的發(fā)生[7]。miR-125b與HF關系密切，但其具體的調控機制尚不明確，故本次研究使用細胞轉染方法，希冀闡明miR-125b對HSC表型的影響，為HF的防治以及藥物的研發(fā)提供新的標靶。

1 材料

1.1 儀器低速離心機(廣州吉迪儀器有限公司，JIDI-20D)、水平搖床(上海達姆實業(yè)有限公司，T200)、酶標儀(北京普朗新技術有限公司，mullSKANMK3)、倒置顯微鏡(OLYMPUS，IX51)、流式細胞儀(BECKMAN，CytoFLEX)、RT-PCR儀(ABI，QuantStudio 6)。

1.2 細胞株大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)Procell 貨號:CL-2317。

1.3 試劑MTT(BIOSHARP，0793)、 CollagenⅠ(220KD)(Abcam，ab260043)、CollagenⅢ(138KD)(abcam，ab34710)、β-actin(42KD)(Servicebio, GB12001)細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物，KGA1026)、 Lip2000(賽墨飛，12566014)、miR-125b相關片段(上海吉瑪制藥技術有限公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)將HSC-T6進行復蘇后接種于無菌培養(yǎng)瓶中，加入含10% FBS和1%高糖DMEM培養(yǎng)液，將其置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選用生長旺盛的對數期細胞進行實驗。

2.2 細胞轉染取對數生長期的HSC-T6進行轉染，將其分為空白組、過表達組(mimics)、過表達對照組(mimics NC)、抑制組(inhibitor)、抑制對照組(inhibitor NC)，除空白組外，各組按如下操作進行轉染：將各組用無血清培養(yǎng)基配成miRNA-DMEM 終濃度為20 nmol·L-1，為了增加轉染的成功率加入Lipofec-tamineTM2000試劑，將其配制為濃度5 mL·L-1，而后加入相應的孔中每孔1 mL。轉染結束后將轉染液替換成完全培養(yǎng)基用于后續(xù)實驗。

2.3 MTT檢測各組細胞增殖取對數生長期的HSC-T6細胞，胰酶消化后，用培養(yǎng)基調整細胞密度到7×107個·L-1，接入96孔板，對細胞進行轉染，方法見上述，每組3個復孔，于37 ℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)3個時間段，每孔加入10 μL MTT，37 ℃培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)基，酶標儀測定吸光值。

2.4 細胞流式檢測各組細胞凋亡取對數期的HSC-T6細胞，胰酶消化后，用培養(yǎng)基調整細胞密度到7×107個·L-1，接入96孔板，對細胞轉染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用PBS將細胞洗2次，1 500 r·min-1，3 min；按照凋亡試劑盒操作說明進行，然后檢測。

2.5 RT-PCR檢測miR-125b、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表達將各組細胞按“2.2”處理后，在細胞中加入1 mL TRIzol試劑，提取總的RNA。棄上清，加入無RNase的75%乙醇1 mL，離心5 min。棄上清，干燥RNA沉淀5-10 min，將沉淀溶于20 μL DEPC水中。用逆轉錄試劑盒得到cDNA，用RT-PCR檢測相應分子的表達，miR-125b、U6、CollagenⅠ、CollagenⅢ和β-actin上下游引物及長度見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences

2.6 免疫印跡檢測CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表達將各組細胞按轉染操作處理后，提取細胞總蛋白，使用BCA法測定各組細胞蛋白濃度，然后進行SDS-PAGE電泳、轉膜，用TBST液室溫搖床封閉2 h，然后加入Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、β-actin 抗體4 ℃過夜，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，通過ECL顯色系統(tǒng)顯色，用BandScan分析膠片灰度值。

3 結果

3.1 轉染后miR-125b的含量被提高或者下降當細胞轉染結束后，用RT-PCR檢測轉染各組miR-125b的表達量，結果如Fig 1所示。轉染miR-125b mimics及inhibitor后，過表達組miR-125b的表達明顯高于mimics NC組和空白對照組(P<0.05)，而inhibitor組則沒有檢測到miR-125b表達，說明該組沒有miR-125b表達，進一步表明inhibitor具有很好的抑制作用，結果表明轉染操作順利完成，將miR-125b模擬物或抑制物導入細胞后，成功的調控了細胞miR-125b的表達，構建了成功的細胞模型。

Fig 1 Expression of miR-125b in each group

3.2 miR-125b可以調控HSC的增殖當細胞轉染結束后測定3個時間段的細胞增殖率(24、48、72 h)，以此判斷miR-125b對HSC細胞增殖的作用，結果表明miR-125b mimics 組與miR-125b mimics NC組相比，3個時間段均對細胞的增殖有抑制作用，但是只有72 h的抑制作用，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);miR-125b inhibitor組與inhibitor NC組相比，3個時間段均對細胞的增殖有促進作用，但只在72 h差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，實驗結果表明miR-125b可以調控HSC增殖，詳細情況見Fig 2。

Fig 2 HSC proliferation after miR-125b transfection n=3)

3.3 miR-125b可以調控HSC細胞的凋亡當各組細胞轉染結束后，按照凋亡試劑盒上的操作方法檢測各組HSC細胞的凋亡情況。轉染48 h后，各組的凋亡率情況分別為，mimics組：( 8.23 ± 0.56 )%,mimics NC組：( 6.15± 0.26)%,inhibitor組：(2.54 ± 0.51)%,inhibitor NC組：(5.23± 0.56)% 。轉染48 h后，mimics組凋亡率提高，具有促進HSC凋亡的作用;inhibitor 組凋亡率下降，具有抑制HSC凋亡的作用，并且差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，實驗結果表明miR-125b可以調控HSC凋亡，見Fig 3。

Fig 3 Effect of miR-125b on HSC apoptosis n=3)

3.4 miR-125b可以抑制Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mRNA的表達當細胞轉染結束48 h后，miR-125b mimics 組具有抑制Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mRNA表達的作用；miR-125b inhibitor組具有促進Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mRNA表達的作用，與陰性對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見Fig 4。實驗結果表明，miR-125b抑制了膠原的生成，減少了細胞外基質的沉積的作用，具有確切的抗肝纖維化的作用。

Fig 4 Effect of miR-125b on Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ mRNA expression n=3)

3.5 miR-125b可以抑制Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ 蛋白的表達當細胞轉染結束48 h后，過表達組具有抑制Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ 表達的作用；抑制組具有促進Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表達的作用，與陰性對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見Fig 5。實驗結果表明miR-125b表達量的增加，具有抗膠原生成的作用。

Fig 5 Effect of miR-125b on expression of Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ n=3)

4 討論

HF被認為是由于各種慢性肝損傷而產生的一種傷口愈合性病理應答過程，以ECM的積累為特征[8]。HSC的激活被認為是HF的重要關鍵步驟[9-10]。目前關于HF的防治工作已經取得了長足的發(fā)展，其主要的工作關注點是HSC的增殖和凋亡[11-12]。miRNA是一類內源性表達的18-25個核苷酸長的非編碼調節(jié)RNA分子。研究發(fā)現miRNA在細胞的多種生理過程中具有重要的調控作用。此外，研究還發(fā)現miRNA可與編碼蛋白質的信使RNA(mRNA)的3'-非翻譯區(qū)(UTR)堿基配對，從而調控mRNA的表達[13]。miRNA作為基因表達的調節(jié)分子，可以調控HSC的生理功能來參與HF的發(fā)生發(fā)展過程[14-15]。

本實驗采用轉染的方式來探究miR-125b對HSC表型的影響。因為轉染miRNA存在單雙鏈的問題，所以需要選擇其相應的陰性序列進行比較對照。研究結果顯示，當在HSC細胞中miR-125b的表達量增加時，HSC合成的 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達會下降，并且HSC細胞的增殖會受到抑制以及凋亡率會增加，差異具有統(tǒng)計學意義；而當HSC細胞中miR-125b的表達量下降時，HSC合成的 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達會增加，并且HSC細胞的增殖會受到促進以及凋亡率會被抑制，差異具有統(tǒng)計學意義。ECM的過度沉積是HF主要的病理特征，而Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ是ECM的主要組成部分，而miR-125b可以減少Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表達；抑制HSC增殖促進其凋亡是防治HF的有效策略，而miR-125b可以抑制HSC增殖促進HSC凋亡，綜合以上表明miR-125b具有確切的抗肝纖維化的作用。有研究發(fā)現，miR-125b可以靶向作用于Hedgehog信號通路上重要的轉錄因子Gli3減少其表達，從而抑制HSC的激活。miR-125b還可以通過作用于RhoA通路，調控HSC遷移以及影響其收縮，抑制HSC的激活過程。本次研究表明，miR-125b通過抑制HSC增殖，促進其凋亡，減少細胞外基質Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的產生，呈現抗肝纖維化的作用，但是具體的分子機制引起我們課題組進一步深入思考，例如miR-125b通過什么途徑調控HSC，miR-125b是否通過調控肝內炎癥反應抑或是調控肝內血管新生反應參與HSC生理過程，miR-125b呈現的抗肝纖維化的作用是否存在多靶點的調控作用。課題組進一步希望通過二代測序進一步探究miR-125b上游信號分子lncRNA和cricRNA的差異表達，以及通過蛋白組學尋找肝纖維化中顯著表達差異的蛋白質，從而闡明miR-125b分子調控肝纖維化的完整信號網絡。綜上，miR-125b可以成為防治肝纖維化研究工作新的靶位點。