王 瓊，曹 行，張小洪，劉玲玲，馬海玉，蔣芳芳，劉武軍*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆吐魯番職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 吐魯番 838000)

近年來，在綿羊遺傳育種中，選擇信號的檢測成為鑒定影響重要經(jīng)濟(jì)性狀潛在作用基因和決定表型變異相關(guān)功能基因的重大策略[1]。Moradi等[2]利用綿羊商業(yè)化的50K SNP芯片對伊朗兩個(gè)脂尾和瘦尾不同尾型綿羊品種，采用Fst(Fixation index，群體分化指數(shù))方法進(jìn)行了群體間選擇信號檢測，結(jié)合單倍型分析結(jié)果在脂尾綿羊5號、7號和X染色體上發(fā)現(xiàn)了與脂肪沉積相關(guān)的基因組選擇區(qū)域，而且在這些區(qū)段內(nèi)鑒定到與脂肪代謝相關(guān)基因NPR2、PPP2CA。Kijas等[3]也利用Fst方法對74個(gè)品種的綿羊全基因組進(jìn)行了選擇信號檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了控制羊毛色的基因ASIP與綿羊角型相關(guān)的基因RXFP2和與骨骼肌發(fā)育相關(guān)的基因BMP2。2015年Wang等[4]也利用綿羊商業(yè)化的50K SNP芯片對三個(gè)肉用綿羊品種[3]蒙古羊、德國美利奴羊、杜泊羊用di[4]方法對其全基因組進(jìn)行了選擇信號檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了與綿羊肉質(zhì)性狀相關(guān)的基因ALDOA、STK32B和FAM190A，與繁殖性狀相關(guān)的基因CCNB2和SLC8A3。Caiye等[5]用Fst和iHS(integrated haplotype score，綜合單倍型評分)方法對三個(gè)肉用綿羊蘇尼特羊、德國美利奴羊、杜泊羊X染色體進(jìn)行了選擇信號檢測，結(jié)果在X染色體上發(fā)現(xiàn)了與繁殖性狀相關(guān)的BMP15基因，與免疫相關(guān)的VSIG4和PCDH11X基因，與神經(jīng)系統(tǒng)和皮膚相關(guān)的基因PCDH19。

新疆由于地域廣闊、氣候生態(tài)環(huán)境多樣，在長期自然選擇、人工選育過程中形成了豐富且各具特色的綿羊種質(zhì)資源。在新疆地方綿羊品種中，策勒黑羊的繁殖性能突出，為短瘦尾；而吐魯番黑羊盛產(chǎn)優(yōu)質(zhì)羔羊肉，為短脂尾，兩個(gè)品種分別在繁殖力、脂肪沉積方面具有典型的代表性[6]。本研究以新疆地方綿羊品種策勒黑羊(羔皮型)與吐魯番黑羊(肉脂兼用粗毛型)為試驗(yàn)對象，利用兩種選擇信號分析方法Fst、Pi(nucleotide diversity，核苷酸多態(tài)性)，挖掘和篩選繁殖及脂肪代謝相關(guān)候選基因，為我國綿羊的分子選育及品種資源保護(hù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

在新疆和田地區(qū)策勒縣、吐魯番市托克遜縣，分別選取策勒黑羊、吐魯番黑羊成年母羊各15只，頸靜脈采集血樣，枸櫞酸鈉抗凝，-20℃冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 全基因組重測序

從采集的血樣中提取DNA，構(gòu)建高通量測序雙末端測序(PE，paired-end)文庫，利用Illumina公司的Hiseq3000平臺進(jìn)行全基因組重測序，測序深度10×，委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。利用PLINK軟件對重測序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控處理，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)是：(1)SNP檢出率＞90%；(2)最小等位基因頻率＞0.01；(3)服從哈迪溫伯格定律。

1.2.2 選擇信號分析

利用vcftools，計(jì)算吐魯番黑羊、策勒黑羊兩個(gè)群體之間的Fst值，選取25 kb的滑動窗口，計(jì)算每個(gè)窗口所有標(biāo)記的Fst值平均值，將其作為此窗口的Fst值；分別計(jì)算策勒黑羊、吐魯番黑羊的Pi值，同樣選取25 kb的滑動窗口，將每個(gè)窗口所有標(biāo)記的Pi值平均值作為此窗口的Pi值。

1.2.3 候選基因檢測和注釋

取前1%窗口片段中的相同SNPs(single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)位點(diǎn)作為候選位點(diǎn)，以候選位點(diǎn)為中心，上下游各延伸200 kb作為候選區(qū)域，參照NCBI數(shù)據(jù)庫綿羊參考基因組(Ovis aries v3.1)，利用PLINK軟件進(jìn)行基因注釋，將其定義為選擇信號的“候選基因”。

1.2.4 候選基因富集分析

利用DAVID v6.7(http://david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp)數(shù)據(jù)庫對候選基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析，挖掘與綿羊繁殖性狀、脂肪沉積等密切相關(guān)的功能基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 重測序結(jié)果

兩個(gè)品種30只綿羊重測序共產(chǎn)生253.93 G的原始測序數(shù)據(jù)，質(zhì)控后獲得252.43 G的處理后測序數(shù)據(jù)，含16 643 570個(gè)SNPs。測序質(zhì)量評估值為Q20≥97.03%、Q30≥93.31%，GC含量在40.51%～42.63%之間，結(jié)果表明本次測序所獲數(shù)據(jù)可靠，可用于后續(xù)分析。

2.2 選擇信號分析結(jié)果

在Fst檢測中，有128 252個(gè)SNPs位點(diǎn)高于閾值線，F(xiàn)st的top1%閾值為0.455；在Pi檢測中，有128 396個(gè)SNPs位點(diǎn)高于閾值線，Pi的top1%閾值為0.787，具體見圖1。

圖1 Fst（左）和Pi（右）在羊染色體上的分布圖

2.3 兩種方法聯(lián)合分析結(jié)果

對Fst、Pi兩種選擇信號分析獲得的top1%SNPs求交集，獲得121 758個(gè)共有SNPs，可用于后續(xù)基因注釋。

2.4 候選基因的注釋

利用PLINK軟件對兩種方法121 758個(gè)共有SNPs(top1%)進(jìn)行基因注釋，共注釋到63個(gè)候選基因，其中與綿羊繁殖及脂肪代謝相關(guān)候選基因如表1所示，注釋出的15個(gè)繁殖性狀候選基因，與性腺軸激素分泌、季節(jié)性發(fā)情、晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)育、卵泡發(fā)育和排卵、公羊繁殖等相關(guān)；注釋出的8個(gè)脂肪代謝候選基因，與肌細(xì)胞增殖分化、脂肪細(xì)胞分解等相關(guān)。

表1 選擇信號區(qū)域重要性狀候選基因

續(xù)表

2.5 功能富集分析

對Fst和Pi篩選出的所有280個(gè)候選基因進(jìn)行GO分析和KEGG pathway分析，結(jié)果見表2、表3。由表可知，候選基因涉及精細(xì)胞發(fā)育、性腺發(fā)育、子宮內(nèi)胚發(fā)育、骨骼系統(tǒng)發(fā)育、脂肪酸β氧化、視黃醇代謝、TGF-β信號通路、FoxO信號通路、PI3K-Akt信號通路、抗EGFR酪氨酸激酶抑制劑通路等。

表2 受選擇基因GO分析

表3 受選擇基因KEGGpathway分析

續(xù)表

3 討 論

表型改變是對目標(biāo)基因強(qiáng)烈定向選擇的結(jié)果，而與選擇相對應(yīng)的基因組信息，就是“選擇信號”[7]。策勒黑羊?qū)俑崞ば途d羊，全年發(fā)情和繁殖率高是其突出的品種特性，母羊兩年三產(chǎn)較多，平均產(chǎn)羔率215%，成年公羊體重59.4±3.9 kg，屬短瘦尾羊[6]。而吐魯番黑羊?qū)偃庵嬗么置途d羊，季節(jié)性發(fā)情，產(chǎn)羔率僅100.6%，但羊肉品質(zhì)好，氨基酸和蛋白質(zhì)含量豐富，成年公羊體重61.7±10.5 kg，屬短脂尾羊[7]。可以看出，在表型上，2個(gè)品種的繁殖性狀及脂肪沉積性狀存在較大差異。因此，本研究利用選擇信號分析方法在2個(gè)綿羊品種中挖掘繁殖及脂肪代謝相關(guān)候選基因的方案是可行、科學(xué)的。

在本研究篩選的繁殖性狀相關(guān)功能基因中，BCL2L11被證明參與小鼠胚胎干細(xì)胞凋亡過程，是miR-302a的靶基因[8]；DDRGK1主要表達(dá)于小鼠和山羊的子宮內(nèi)膜腔上皮和腺上皮細(xì)胞，并在子宮內(nèi)膜炎癥反應(yīng)中表達(dá)上調(diào)[9]；AMH是檢測人多囊卵巢綜合征伴不孕癥的重要血清指標(biāo)之一[10]；UBE2B基因敲除小鼠的精原細(xì)胞減數(shù)分裂受抑制，精子活力下降，畸形精子數(shù)目增多，表現(xiàn)為雄性不育[11]。在篩選的脂肪代謝相關(guān)功能基因中，轉(zhuǎn)錄因子IRX3的突變導(dǎo)致人類和小鼠的骨骼模式缺陷，影響骨髓脂肪細(xì)胞的增殖[12]；HOXC10參與綿羊成脂、成骨分化的調(diào)控，影響肌內(nèi)脂的生成[13]；PNPLA7受胰島素及不飽和脂肪酸調(diào)控，參與小鼠脂肪細(xì)胞分化過程[14]等。以上研究一方面證實(shí)了本試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，另一方面也挖掘出了一些只在小鼠、人中被證實(shí)，但在山羊、綿羊中極少見報(bào)道的功能基因，應(yīng)重視此類基因可能對綿羊繁殖及產(chǎn)肉性能的調(diào)控作用，進(jìn)一步探究和驗(yàn)證。

在本研究候選基因參與的信號通路中，視黃醇信號通路中，視黃醇及其衍生物對于動物卵巢類固醇激素的合成是必不可少的[15]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中的視黃醇可以抑制卵泡刺激素的表達(dá)并促進(jìn)促黃體生成素的表達(dá)[16]，從而影響其繁殖性能。cAMP信號通路中，環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A(cAMP-PKA)調(diào)控增加細(xì)胞內(nèi)cAMP含量進(jìn)而導(dǎo)致PKA被激活，導(dǎo)致精子中相關(guān)蛋白磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)精子獲能、超活化、趨化性和頂體反應(yīng)等多種生理過程[17]，從而使家畜的繁殖力收到影響。TGF-β信號通路已被許多研究證實(shí)，其家族成員參與卵巢功能的調(diào)節(jié)和卵巢卵泡的發(fā)育，如BMP15、FecB、GDF9等。PI3K/Akt信號通路被認(rèn)為是最重要的細(xì)胞內(nèi)通路之一，它在癌癥、細(xì)胞增殖、胚胎干細(xì)胞和胚胎發(fā)生等生命過程中起著重要作用。近年來，越來越多的報(bào)道證實(shí)了PI3K/Akt和一些下游效應(yīng)分子組成的信號通路在卵泡形成、生長、排卵和黃體化過程中發(fā)生變化，提示PI3K/Akt信號通路對卵巢卵泡發(fā)育有重要作用[18]。也有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路可以調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂事件，影響卵母細(xì)胞成熟能力，表明PI3K/Akt信號通路參與調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟[19]，從而影響家畜的繁殖能力。

4 結(jié)論

本研究利用策勒黑羊和吐魯番黑羊全基因組重測序數(shù)據(jù)，應(yīng)用Fst和Pi方法進(jìn)行綿羊基因組選擇信號檢測，經(jīng)基因注釋和功能富集，最終篩選出23個(gè)與綿羊繁殖性狀、脂肪代謝相關(guān)的候選基因，為綿羊重要經(jīng)濟(jì)性狀的分子調(diào)控機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)和參考。