賀思佳，黃倩，程進(jìn)

（上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院腫瘤中心，上海200080）

肝癌（liver cancer）是消化系統(tǒng)常見腫瘤，也是全球第六大常見癌癥，被認(rèn)為是導(dǎo)致癌癥死亡的第二大原因[1]。在我國(guó)，肝癌的發(fā)病率位于癌癥的第5位，而其病死率在癌癥病死率中高居第2 位[1-2]。目前，針對(duì)肝癌的分子靶向、化療、放療、免疫治療等綜合治療逐漸成為主要的治療手段，在一定程度上能夠改善肝癌患者預(yù)后[3-4]，然而，腫瘤復(fù)發(fā)仍是肝癌治療失敗的主要原因[5]，因此，從分子水平研究肝癌復(fù)發(fā)的發(fā)病機(jī)制尤為重要。

腫瘤再增殖（tumor repopulation）是指在放、化療等細(xì)胞毒性治療過(guò)程中，大量腫瘤細(xì)胞發(fā)生死亡，而少量殘存腫瘤細(xì)胞加速生長(zhǎng)，形成新的腫瘤的過(guò)程[6-7]。腫瘤再增殖被認(rèn)為是導(dǎo)致治療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)的重要原因。有研究[25]認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞參與腫瘤再增殖。也有文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道認(rèn)為血管新生、巨噬細(xì)胞參與腫瘤再增殖過(guò)程。本課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn)放療后誘導(dǎo)產(chǎn)生的凋亡細(xì)胞能夠通過(guò)激活caspase-3，進(jìn)一步活化下游不依賴鈣離子的磷 脂 酶 A2（Ca2+-independent phospholipase A2，iPLA2），在iPLA2的作用下，花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2），以一種旁分泌的方式促進(jìn)周圍殘存腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。這項(xiàng)研究首次提出放療誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞能夠刺激殘存腫瘤細(xì)胞再增殖，闡明了caspase-3-iPLA2-PGE2信號(hào)通路在其中的重要作用。此外，本課題[12]還發(fā)現(xiàn)蛋白激酶C-δ（protein kinase C-δ，PKCδ）作為caspase-3 的底物，通過(guò)旁分泌VEGF-A 促進(jìn)周圍殘存腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。由此可見，腫瘤再增殖是多重機(jī)制調(diào)控的結(jié)果，不斷更新研究結(jié)果將幫助更好地認(rèn)識(shí)腫瘤再增殖這一過(guò)程。高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種DNA 結(jié)合蛋白，其表達(dá)水平僅次于組蛋白，研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在多種腫瘤細(xì)胞及組織中過(guò)度表達(dá)，并參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)、腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移等過(guò)程[13-16]。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建肝癌細(xì)胞再增殖體外模型以及數(shù)據(jù)庫(kù)分析，探討HMGB1 與肝癌再增殖之間的相關(guān)性與臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

胎牛血清購(gòu)自Gibco 公司，0.25%胰蛋白酶、Lipofectamine 2000 購(gòu)自Thermo Fisher 公司，RPMI-1640 和DMEM 高糖培養(yǎng)基購(gòu)自GE Healthcare 公司，嘌呤霉素購(gòu)自上海生工，熒光素酶底物（Dluciferin potassium）購(gòu)自Promega 公司，質(zhì)粒DNA 抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega 公司，甘草酸（Glycyrrhizin，Gly）購(gòu)自于Santa Cruz Biotechnology 公司，本實(shí)驗(yàn)中所采用的質(zhì)粒：plex-GFP-luc2、psPAX2、pMD2.G均由本課題組實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)本研究采用的Huh7 和Li7 人源肝癌細(xì)胞株均購(gòu)自上海中科院，Huh7 選用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，Li7 選用RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基均添加10% 胎牛血清、100 μg/mL 和100 U/mL 鏈霉素和青霉素。所有細(xì)胞均置于37 ℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 構(gòu)建熒光素酶標(biāo)記的報(bào)告細(xì)胞利用293T 工具細(xì)胞和Lipo2000 轉(zhuǎn)染試劑盒按照說(shuō)明書進(jìn)行慢病毒包裝[17]。將5×105個(gè)Huh7 和Li7 細(xì)胞分別鋪于3.5 cm 培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，以1∶1 將1 mL 包裝好的慢病毒液和1 mL 10%完全培養(yǎng)基充分混合后加入培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，24 h 后更換新鮮的10%完全培養(yǎng)基。若熒光顯微鏡下GFP 陽(yáng)性的細(xì)胞超過(guò)30%則將細(xì)胞全部消化接種至10 cm 培養(yǎng)皿中，待生長(zhǎng)匯合度達(dá)到70%左右，更換含有嘌呤霉素（2 μg/mL）的10%完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，篩選2～4 周，獲得穩(wěn)定表達(dá)Fluc-GFP 的Huh7 和Li7 作為報(bào)告細(xì)胞，分別命名為Huh7-Fluc 和Li7-Fluc 細(xì)胞。

1.2.3 利用小動(dòng)物活體成像儀進(jìn)行腫瘤細(xì)胞生物成像往鋪有細(xì)胞的24 孔板或者96 孔板中加入熒光素酶底物（終濃度0.15 mg/mL），然后置入小動(dòng)物成像儀中進(jìn)行生物成像，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.4 驗(yàn)證細(xì)胞數(shù)量與熒光素酶活性之間的線性關(guān)系為了證明報(bào)告細(xì)胞的數(shù)量與其所表達(dá)的熒光素酶活性呈線性關(guān)系，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Huh7-Fluc和Li7-Fluc 細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，以250、500、750、1 000、1 200、1 500、1 750 和2 000 個(gè)鋪于96 孔板中，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL 10%完全培養(yǎng)基。24 h 后待細(xì)胞貼壁后將24 孔板置于小動(dòng)物活體成像儀中成像，并將所測(cè)得各組的光信號(hào)強(qiáng)度與報(bào)告細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，為構(gòu)建體外肝癌細(xì)胞再增殖模型提供基礎(chǔ)。

1.2.5 構(gòu)建肝癌細(xì)胞再增殖模型取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞Huh7 消化后計(jì)數(shù)，按照1×105個(gè)/孔鋪于24 孔板中，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。24 h 后待細(xì)胞貼壁后，將24孔板置于Onor線性加速器（上海市第一人民醫(yī)院放射治療科，劑量率為3.6 Gy/min）中進(jìn)行或不進(jìn)行單次10 Gy 劑量X 射線照射處理，以此作為飼養(yǎng)細(xì)胞。次日，將Huh7-Fluc 細(xì)胞按照1 000 個(gè)/孔分別鋪入飼養(yǎng)細(xì)胞所在的24 孔板中，另在空白孔中按照1 000 個(gè)/孔單純接種報(bào)告細(xì)胞作為陰性對(duì)照。24 孔板以2%完全培養(yǎng)基每孔1 mL繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。培養(yǎng)6 d 后，進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)發(fā)光成像。Li7 肝癌細(xì)胞再增殖模型構(gòu)建方法同Huh7。

1.2.6 使用HMGB1 抑制劑處理肝癌細(xì)胞再增殖模型肝癌細(xì)胞再增殖模型構(gòu)建同前，對(duì)飼養(yǎng)細(xì)胞和報(bào)告細(xì)胞共培養(yǎng)組、報(bào)告細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組均設(shè)立HMGB1 抑制劑Gly 處理組和對(duì)照組，均在每隔2 d更換2%完全培養(yǎng)基時(shí)加入。加藥處理4 次后進(jìn)行細(xì)胞生物成像。

1.2.7 TIMER2.0、GEPIA2 數(shù)據(jù)庫(kù)分析TIMER2.0 是一個(gè)免費(fèi)的交互式Web 服務(wù)數(shù)據(jù)庫(kù)，其中Exploration 模塊中的Gene_DE 可用于分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)HMGB1 在肝癌與癌旁組織之間的表達(dá)差異[18]。登錄此數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)址（http://timer.cistrome.org），選擇Exploration 中的Gene_DE，在Gene Expression 中輸入HMGB1 即可獲得HMGB1 在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)差異。GEPIA2（gene expression profiling interactive analysis）即基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析，是一個(gè)基于TCGA 與GTEx 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)建立的可視化癌癥大數(shù)據(jù)分析平臺(tái)。利用此平臺(tái)對(duì)HMGB1 表達(dá)水平與肝癌患者生存預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析[19]。篩選條件設(shè)置為：⑴gene：HMGB1；⑵methods：overall survival；⑶ group cutoff:quartile；⑷ hazards ratio（HR）：yes；⑸95% confidence interval：yes；⑹axis units:months；⑺datasets selection（cancer name）：LIHC。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。相關(guān)性分析采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析，兩組間均數(shù)比較采用Student'st檢驗(yàn)，多組間差異的比較采用單因素方差分析，采用Kaplan-Meier 分析方法繪制生存曲線，Log-rank 檢驗(yàn)來(lái)分析HMGB1 的表達(dá)與肝癌預(yù)后的相關(guān)性，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的肝癌細(xì)胞的數(shù)量與光信號(hào)強(qiáng)度呈線性相關(guān)

通過(guò)將所測(cè)得的各組化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度與報(bào)告細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的Huh7-Fluc 和Li7-Fluc 細(xì)胞數(shù)量與光信號(hào)強(qiáng)度之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，R2分別為0.989 9和0.990 1（圖1）。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)成像檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度來(lái)反映報(bào)告細(xì)胞的增殖情況，為構(gòu)建體外肝癌腫瘤再增殖模型提供基礎(chǔ)。

圖1 報(bào)告細(xì)胞的數(shù)量與熒光素酶活性的線性關(guān)系A(chǔ)：Huh7-Fluc報(bào)告細(xì)胞的數(shù)量與熒光素酶活性呈線性關(guān)系；B：Li7-Fluc報(bào)告細(xì)胞的數(shù)量與熒光素酶活性呈線性關(guān)系Figure1 Linear relation between luciferase activity and reporter cell numbersA:Linear relation between luciferase activity of Huh7-Fluc and reporter cell numbers;B:Linear relation between luciferase activity of Li7-Fluc and reporter cell numbers

2.2 X射線照射處理后的肝癌細(xì)胞能夠促進(jìn)未照射的肝癌細(xì)胞發(fā)生腫瘤再增殖

將單次10 Gy 劑量X 射線處理或不處理的腫瘤細(xì)胞Huh7 和Li7 作為飼養(yǎng)細(xì)胞分別與相應(yīng)的報(bào)告細(xì)胞Huh7-Fluc 和Li7-Fluc 進(jìn)行共培養(yǎng)，6 d 后通過(guò)小動(dòng)物成像儀進(jìn)行成像，結(jié)果顯示相對(duì)于單純報(bào)告細(xì)胞組和未經(jīng)X 射線處理飼養(yǎng)細(xì)胞組，X 射線處理后的飼養(yǎng)細(xì)胞對(duì)報(bào)告細(xì)胞的促生長(zhǎng)作用更明顯（均P<0.01）。表明X 射線照射后的肝癌細(xì)胞能夠促進(jìn)活肝癌細(xì)胞增殖，在一定程度上以體外模型的方式再現(xiàn)了臨床上放療過(guò)程中發(fā)生的腫瘤再增殖現(xiàn)象（圖2）。

圖2 各組報(bào)告細(xì)胞增殖檢測(cè)Figure 2 Determination of growth of reporter cells in each group

2.3 抑制HMGB1可減弱X射線誘導(dǎo)的腫瘤再增殖

為了研究HMGB1 在X 射線誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞再增殖中的作用，在模型中加入HMGB1 抑制劑Gly，6 d 后通過(guò)小動(dòng)物成像儀進(jìn)行成像，結(jié)果顯示加入HMGB1 抑制劑后X 射線處理后的飼養(yǎng)細(xì)胞對(duì)報(bào)告細(xì)胞的生長(zhǎng)刺激作用明顯減弱，但相同HMGB1 抑制劑濃度處理過(guò)的報(bào)告細(xì)胞并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)抑制，表明此濃度的HMGB1 抑制劑對(duì)于細(xì)胞本身無(wú)明顯毒性作用，而對(duì)肝癌細(xì)胞再增殖模型卻有明顯的抑制作用，抑制劑濃度越高其對(duì)模型的抑制作用更明顯（P<0.01），HMGB1 參與了X 射線誘導(dǎo)的肝癌再增殖的過(guò)程（圖3）。

圖3 HMGB1抑制劑Gly對(duì)報(bào)告細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Effects of HMGB1 inhibitor Gly on reporter cells

2.4 TIMER2.0與GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)分析

利用TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)集對(duì)HMGB1 基因在泛癌中的表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果顯示HMGB1 在不同癌種中的表達(dá)水平不同，其中，在肝癌組織（LIHC）中其表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（P<0.01）（圖4A）。

利用GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)集進(jìn)行在線生存分析。結(jié)果顯示在肝癌中，HMGB1 基因高表達(dá)組（n=91）總生存期（overall survival，OS）較HMGB1 低表達(dá)組（n=91）更短（HR=1.8，P=0.022），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明HMGB1 的表達(dá)與肝癌的總生存期呈負(fù)相關(guān)（圖4B）。而HMGB1 的表達(dá)與肝癌的無(wú)病生存期（disease free survival，RFS）無(wú)明顯相關(guān)性（HR=1.5，P=0.059）（圖4C）。

圖4 HMGB1在肝癌組織中的表達(dá)水平以及與肝癌預(yù)后的相關(guān)性A：HMGB1在多種腫瘤中的表達(dá)情況；B-C：HMGB1的表達(dá)水平與肝癌預(yù)后關(guān)系Figure 4 The expression level of HMGB1 in liver cancer and the relationship between HMGB1 and prognosis of liver cancer patientsA:The expression level of HMGB1 in variety of cancers and adjacent normal tissue;B-C:The relationship be‐tween HMGB1 and prognosis of liver cancer patients

3 討論

肝癌作為常見的消化道惡性腫瘤，早期缺乏特異性癥狀，確診時(shí)往往處于晚期。盡管，隨著目前綜合治療方式的更新和相應(yīng)的臨床試驗(yàn)的進(jìn)展，晚期肝癌患者的生存預(yù)后已獲得了一定的改善，但是肝癌復(fù)發(fā)仍是導(dǎo)致患者疾病進(jìn)展的重要原因[20-22]。

腫瘤再增殖作為腫瘤復(fù)發(fā)的重要機(jī)制之一，目前人們對(duì)導(dǎo)致其發(fā)生的相關(guān)分子機(jī)制尚不完全了解[6]。本課題組長(zhǎng)期從事腫瘤再增殖現(xiàn)象的機(jī)制研究，為了研究其中的調(diào)控機(jī)制，本研究構(gòu)建了腫瘤再增殖模型，并成功在體外模擬了腫瘤再增殖這一過(guò)程，為后續(xù)研究提供了良好的模型基礎(chǔ)[17]。在本研究中，首先構(gòu)建了表達(dá)Fluc-GFP 的報(bào)告細(xì)胞，并成功利用肝癌細(xì)胞構(gòu)建了腫瘤再增殖模型，明確了X 射線能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞再增殖的發(fā)生，也進(jìn)一步證實(shí)腫瘤再增殖這一現(xiàn)象的普遍性。

HMGB1 作為一種核蛋白，在細(xì)胞中表達(dá)豐度極高，僅次于組蛋白，在進(jìn)化過(guò)程中高度保守且功能強(qiáng)大[23]。HMGB1 在分子結(jié)構(gòu)上主要由2 個(gè)DNA 結(jié)合區(qū)域（HMG A box 和HMG B box）和1 個(gè)C端酸性尾端組成，已被證實(shí)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用[14,24]。已有研究[14]表明，HMGB1 的功能與其在細(xì)胞中的定位及翻譯后修飾有關(guān)。在細(xì)胞核中，HMGB1 參與DNA 復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄及維持基因組穩(wěn)定等[25-26]，在胞漿中，HMGB1 被認(rèn)為是一種自噬的正向調(diào)控蛋白，能夠與自噬蛋白Beclin-1 集合，誘導(dǎo)自噬發(fā)生[27]。而HMGB1 在細(xì)胞中的定位并不是一成不變，研究[23,28-30]表明，在生理或者病理狀態(tài)下，HMGB1 能夠通過(guò)主動(dòng)或者被動(dòng)的方式釋放至細(xì)胞外，參與炎癥、免疫、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞死亡等生理病理過(guò)程。此外，在腫瘤中，HMGB1 對(duì)于腫瘤的作用主要由自身的氧化還原狀態(tài)決定。研究[14]表明，還原型的HMGB1 主要對(duì)腫瘤生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，而氧化型HMGB1 可以誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生凋亡。另外，外源性HMGB1 能夠通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞的方式進(jìn)入線粒體，誘導(dǎo)線粒體發(fā)生腫脹而引起細(xì)胞死亡。本課題前期研究[31-32]發(fā)現(xiàn)，放、化療等細(xì)胞毒性治療能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞釋放HMGB1。在本研究中，通過(guò)在肝癌細(xì)胞再增殖模型中加入HMGB1 抑制劑Gly，觀察抑制HMGB1 的表達(dá)和釋放對(duì)肝癌細(xì)胞再增殖的影響。從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，加入Gly 的肝癌細(xì)胞再增殖模型被顯著抑制，表明HMGB1 參與了X 射線誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞腫瘤再增殖，HMGB1 有可能作為提高肝癌患者治療效果和減少肝癌復(fù)發(fā)的潛在治療靶點(diǎn)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，腫瘤相關(guān)生物數(shù)據(jù)庫(kù)使得高效分析基因測(cè)序數(shù)據(jù)成為可能，利用數(shù)據(jù)庫(kù)的模塊進(jìn)行在線分析，是一種研究基因與腫瘤相關(guān)性的有效且便捷的方式。在本研究中，利用TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，發(fā)現(xiàn)HMGB1 在絕大多數(shù)惡性腫瘤中呈高表達(dá)，其中在肝癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。此外，本研究還利用GEPIA2 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)HMGB1 表達(dá)水平與肝癌患者預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示HMGB1 表達(dá)水平與肝癌患者的無(wú)病生存期無(wú)顯著相關(guān)性，但是HMGB1 高表達(dá)的肝癌患者總生存期短，表明HMGB1 可能作為判斷肝癌患者總生存期預(yù)后的潛在標(biāo)記物。

綜上所述，HMGB1 在肝癌組織中呈高表達(dá)，與肝癌患者總生存期預(yù)后負(fù)相關(guān)，同時(shí)，HMGB1參與了X 射線誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞再增殖過(guò)程，通過(guò)HMGB1 抑制劑Gly 能夠顯著抑制這一過(guò)程。雖然，HMGB1 調(diào)控肝癌細(xì)胞再增殖的具體分子機(jī)制尚未明確，HMGB1 抑制劑能否用于臨床上預(yù)防放療后肝癌復(fù)發(fā)，還需要進(jìn)一步的深入研究，但本研究為理解和預(yù)防肝癌復(fù)發(fā)提供了新的思路。