夏丞垚，陳瓊珍，沈文靜，黃 彥，葉現豐，曹 慧，崔中利

(1.南京農業(yè)大學 生命科學學院 農業(yè)農村部農業(yè)環(huán)境微生物重點實驗室，江蘇 南京 210095；2.溫州大學 生命與環(huán)境科學學院，浙江 溫州 325035；3.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學研究所，江蘇 南京 210042)

隨著人口增長和人類活動不斷增加，人類在享受著化學品和天然礦質資源等帶來的經濟增長和物質保障的同時，也面臨著超過1億人接觸有毒的有機和無機污染物的風險，以及每年上億噸的化學廢棄物進入環(huán)境的潛在危害[1]。對硝基苯酚(PNP)廣泛用于醫(yī)藥、染料、農藥、除草劑和殺菌劑等生產中[2]。在好氧環(huán)境中，甲基對硫磷、對硫磷等有機磷殺蟲劑，可迅速降解為PNP[3]。這類化合物在環(huán)境中殘留時間長，會對土壤及植物產生嚴重的危害[4]。

由于PNP具有高度水溶性，已在農業(yè)土壤、地表水、地下水、雨水、空氣、活性污泥和工業(yè)廢水中檢測到，PNP的化學性質相對較為穩(wěn)定，苯環(huán)的存在發(fā)揮關鍵作用。分子結構理論表明在苯環(huán)中存在著大 π 鍵，其結構由于苯環(huán)中 π 電子的離域作用而變得更加穩(wěn)固。與此同時，苯環(huán)上的電子云密度受到苯環(huán)上的—NO2基團強烈的吸電子特性的影響而大大降低，使得親電反應在一般條件下很難進行，并且對外界氧化酶的攻擊有著一定的抵抗作用[5]。

多國環(huán)保機構先后將PNP納入“優(yōu)先控制污染物名單”中[6]。有研究表明PNP對多種非靶標生物產生毒性[7-8]，如：PNP可誘導釀酒酵母有絲分裂重組或基因轉換[9]；在人類和動物中，它會引起高鐵血紅蛋白血癥[10]，在這種情況下，血液中存在的過量高鐵血紅蛋白可能會干擾血液攜帶氧氣的能力；此外，PNP被證明可以誘導3種微藻菌株的抗氧化水平發(fā)生變化[4]。

1 PNP微生物降解資源

與傳統(tǒng)的化學物理法或者土壤淋洗等修復方法相比，生物修復因其對污染物完全礦化，不造成二次污染，被認為是水土環(huán)境中PNP污染修復的理想方法[11]。其中利用微生物的污染物降解功能實現對污染物的分解是重要的手段，在環(huán)境綠色安全保護方面發(fā)揮著重要的作用。目前，許多能降解PNP的菌株被研究報道[12]。

由于芳香環(huán)上引入了硝基，PNP的生物降解非常困難。然而，微生物種類眾多，代謝類型多樣，分布廣泛，研究人員從不同環(huán)境中分離篩選了大量PNP降解微生物。雖然這些微生物表現出降解這類化合物的能力，但在高濃度條件下，PNP會對許多降解菌產生毒害作用并抑制其生長，Sphingobacteriumsp.被證實對高濃度PNP(5 mmol/L)有良好的降解效果[13], 目前高濃度PNP降解菌鮮有報道，為了開發(fā)高效的微生物生物修復系統(tǒng)，有必要分離和篩選新的潛在微生物。

PNP降解菌株的研究主要集中在好氧細菌上，相關菌株的分離以及代謝通路都在不斷被闡明。對于厭氧微生物的研究還未深入開展，主要原因是厭氧微生物的分離和純培養(yǎng)需要嚴格的厭氧條件，操作復雜，難以控制。

2 PNP的微生物代謝途徑和相關基因的研究現狀

2.1 厭氧降解

降解PNP等芳香族化合物的厭氧菌少有研究報道，主要是由于其分離培養(yǎng)有著一定的困難，硝基芳香族化合物的厭氧降解大多以未經鑒定的混合菌群為基礎，接種的微生物多為污水處理廠或厭氧污水處理系統(tǒng)的消化污泥。Oren等[14]首次報道了HaloanaerobiumpraevaknsDSM 2228和SporohalobactermarismortuiATCC 35420對PNP的厭氧降解作用，在H.praevaknsDSM 2228降解PNP的過程中，在硝基還原酶作用下，PNP首先被還原為對氨基苯酚(PAP)，但未發(fā)現進一步降解。隨后的研究也發(fā)現有多種微生物厭氧降解菌株得到分離，如Methanobacteriumformicium[15]、Methanogenic bacteria[16]等。由此可見，厭氧降解在生物處理中具有一定的應用前景。

在厭氧狀態(tài)下，PNP首先被還原為對氨基苯酚，在有氧或無氧條件下，不管是純培養(yǎng)還是混合培養(yǎng)都能繼續(xù)降解[14, 17-18]。然而，也有研究提出不同觀點，認為對氨基苯酚不能在厭氧反應器里進一步轉化[19]。

Chen等[20]利用厭氧半固定床生物膜反應器(An-SFB-BR)處理高濃度PNP廢水，當PNP進水從0提高到540 mg/L時，PNP的平均去除率為98%；經An-SFB-BR降解后，PNP的初級中間體對氨基苯酚(PAP)的轉化率可達80%；16S rRNA測序結果表明，隨著PNP濃度的逐漸增加，Methanobacterium豐度有所上升，這保證了PNP的去除效果。該研究為高濃度PNP廢水的生物處理提供了一種經濟的途徑。

2.2 好氧降解

一些能夠降解PNP的好氧微生物已被發(fā)現存在于環(huán)境生態(tài)位中。降解PNP的細菌代謝途徑主要分為兩類。一類是在革蘭氏陰性菌如Burkholderiaspp、Moraxellaspp和Pseudomonasspp中的對苯二酚途徑[21-23]。Simpson等[24]證實，Pseudomonasspp能將PNP轉化為對苯二酚，并釋放出亞硝基；對其中相關酶進行分離純化發(fā)現，通過黃素蛋白單加氧酶催化釋放出亞硝酸根是假單胞菌降解PNP的第一步，使PNP向對苯二酚轉化[25]。另一類是在革蘭氏陽性菌如Arthrobacterspp、Bacillusspp和Rhodococcusspp中的1,2,4-苯三酚途徑[26-30]，PNP通過4-硝基兒茶酚和1,2,4-苯三酚途徑降解。

微生物種類和代謝多樣性決定了PNP代謝途徑和基因資源的多樣性。目前的研究結果豐富了對微生物降解PNP通路的認知，微生物的代謝途徑和編碼基因在不同種屬中有著很大的差別，現將對目前已經研究較為深入的菌屬做如下分述。

2.2.1 假單胞菌屬

Bang[31]對Pseudomonassp. ENV2030降解PNP進行深入研究后發(fā)現，Pseudomonassp. ENV2030降解PNP是通過對苯二酚途徑進行的。代謝PNP的具體途徑如圖1所示。在4-硝基酚單加氧酶作用下，每氧化1分子PNP生成對苯二酚時，它同時消耗2分子NADPH，因此推測PNP第一步先氧化為對苯二醌，然后將對苯二醌在對苯二醌還原酶的作用下還原為對苯二酚，但并未在此研究中檢測到對苯二醌。

圖1 Pseudomonas屬的菌株中PNP的代謝途徑[31]Fig.1 Proposed pathway for degradation of PNP by Pseudomonas[31]

張俊杰等[32-33]在Pseudomonassp. WBC-3中克隆得到PNP降解相關基因簇，菌株WBC-3利用PNP作為其碳、氮和能量的唯一來源，通過對苯二酚途徑進行代謝，參與PNP分解代謝的基因位于3個不同的操縱子上：pnpA(編碼PNP 4-單加氧酶)、pnpB(編碼對苯醌還原酶)和pnpCDEFG(編碼催化對苯二酚轉化為對苯醌的酶)。在其隨后的工作中，Zhang等[34]發(fā)現轉錄調控因子PnpR參與調控pnpR、pnpA、pnpB和pnpCDEFG等4個操縱子；后續(xù)的研究中，Wang等[35]發(fā)現另外一個靠近pnpR的基因編碼的轉錄調控因子PnpM也參與了pnpCDEFG操縱子對WBC-3菌株降解PNP過程中對苯二酚降解途徑的調節(jié)。

2.2.2 節(jié)桿菌屬

Liu等[36]研究發(fā)現，節(jié)桿菌屬Arthrobactersp.NyZ415降解PNP通過對苯二酚途徑，第一步反應是在單加氧酶的催化下將PNP降解成羥基對苯二酚。與之不同的是，Chauhan等[37]則揭示了節(jié)桿菌Arthrobactersp. RKJ100另一條降解途徑，PNP首先在未知酶的作用下被催化生成對苯醌，然后對苯醌被進一步降解為對苯二酚、γ-羥粘康酸半醛和β-酮基己二酸酯，最后β-酮基己二酸酯在三羧酸(TCA)循環(huán)中被代謝。

此外，Arthrobactersp.CN2和Arthrobactersp. JS443通過另一條途徑來降解PNP[38-39]。PNP在Arthrobactersp.CN2中的單加氧酶作用下催化生成4-硝基鄰苯二酚，再轉化為1，2，4-苯三酚和馬來酰乙酸酐，最后，馬來酰乙酸被TCA循環(huán)降解。而在Arthrobactersp. JS443降解PNP過程中，PNP首先在單加氧酶作用下羥化生成4-硝基鄰苯二酚和4-硝基間苯二酚；然后，4-硝基鄰苯二酚和4-硝基間苯二酚在單加氧酶體系催化下反應生成1，2，4-苯三酚，進一步開環(huán)形成馬來酰乙酸(maleylacetate)；最后，馬來酰乙酸經β-酮己二酸途徑代謝[38]。Perry等[29]在Arthrobactersp. JS443中克隆得到PNP代謝的基因簇，該基因簇包含4個參與特定代謝的功能基因，與之前報道所不同的是，這個基因簇編碼的酶系通過另一條代謝途徑來進行PNP的降解；在Arthrobactersp. JS443中，在NpdA2的催化作用下，PNP先生成對苯醌后生成羥基對苯醌；在體內還原酶的作用下，生成對苯二酚和偏三苯酚，在NpdB作用下間三酚開環(huán)(圖2)。因Arthrobactersp. JS443不能降解生成的對苯二酚使得其積累，這給在降解由C14標記的PNP過程中檢測到對苯二酚一個合理的解釋。

圖2 Arthrobacter sp. JS443中通過1,2,4-苯三酚途徑降解PNP[29]Fig.2 Proposed pathway for degradation of PNP via 1，2，4-benzenetriol by Arthrobacter sp. strain JS443[29]

2.2.3 紅球菌屬

目前有Rhodococcussp. PN1和RhodococcusopacusSAO101這2個Rhodococcus菌的菌株克隆到PNP降解相關基因的研究報道[26, 40]。Rhodococcussp. PN1和RhodococcusopacusSAO101與傳統(tǒng)的革蘭陽性菌PNP代謝途徑是一致的。催化PNP代謝第一步的酶是一個異質雙組分酶(對硝基苯酚單加氧酶)，由2個亞基組成。黃素單加氧酶作為大亞基，還原酶是小亞基。在FAD和NADH存在下，對硝基苯酚單加氧酶首先催化PNP生成4-硝基兒茶酚，再經過脫硝基作用生成偏三苯酚。通過對體外表達的不同亞基活性的測定，目前認為苯環(huán)羥化和加氧脫硝基是大亞基的功能，而FAD的還原則是小亞基的主要功能，它提供還原力幫助大亞基發(fā)揮活性。Rhodococcussp. PN1中將對硝基苯酚羥化生成4-硝基兒茶酚的羥化酶在序列上與苯酚羥化酶和4-苯基乙酸3-羥化酶高度相似。RhodococcusopacusSAO101 PNP單加氧酶的NpcB組分與GeobacillusthermoglucosidasiusA7的還原酶PheA2同源性不高，只有32%，表明編碼該酶的可能是一個新的基因。綜上分析，研究者將異二組分酶PNP單加氧酶劃分到黃素單加氧酶(TC-FDM)家族。

2.2.4 紅細菌屬

Rhodobactercapsulatus需要在較低的氧氣濃度下完成PNP的降解，并非傳統(tǒng)的光營養(yǎng)細菌通過還原途徑進行厭氧降解[41]，Roldan等[42]通過對光合細菌RhodobactercapsulatusE1F1的研究發(fā)現在該途徑中，苯環(huán)開環(huán)之前硝基并未脫去，PNP在NADH依賴的單加氧酶作用下轉化為4-硝基兒茶酚，然后通過鄰位開環(huán)直接生成4-硝基酮己二酸，再經過脫硝基進入到相應代謝循環(huán)(圖3)，該途徑不同于Moraxella[43]和Pseudomonas[44]中的途徑，因為在這些途徑中，硝基在苯環(huán)打開之前脫去。

圖3 Rhodobacter capsulatus中新的PNP代謝途徑[41]Fig.3 Proposed pathway for the degradation of PNP by Rhodobacter capsulatus[41]

2.3 混合代謝途徑

在假單胞菌和伯克霍爾德屬PNP降解菌中存在著對苯二酚和1,2,4-苯三酚的混合降解途徑(圖4)。Pseudomonassp. WBC-3和P.putidaDLL-E4中缺少將PNP轉化為4-NC的關鍵酶，但它們編碼的PNP 4-單加氧酶具有將4-NC轉化為1,2,4-苯三酚的能力，并通過1,2,4-苯三酚開環(huán)酶的作用進一步降解[45-46]。Burkholderia屬不同菌株PNP代謝途徑存在差異，B.cepaciaRKJ200降解PNP和4-NC的基因位于相同的降解性質粒上，PNP的降解是通過對苯二酚途徑，4-NC則首先轉化為1,2,4-苯三酚，再還原為對苯二酚進行降解[47]，而在Burkholderiasp. SJ98中，PNP通過類似于革蘭陽性菌的代謝途徑進行降解[48]。

圖4 假單胞菌和伯克霍爾德屬中降解對硝基苯酚和4-硝基兒茶酚的混合途徑[45,47]Fig.4 Mixed PNP and 4-NC degradation pathway in Pseudomonas and Burkholderia[45,47]

3 對硝基苯酚降解相關基因簇及其調控模式

由于受基因組大小的限制，原核生物中參與同一個生物學過程的相關基因往往以基因簇的方式組織在一起。雖然來源于不同的微生物，但微生物參與PNP降解的關鍵酶編碼基因均以基因簇方式存在。PNP代謝可以分為上游代謝途徑和下游代謝途徑，上游代謝途徑負責PNP脫硝基轉化為對苯二酚或1,2,4-苯三酚，下游代謝途徑負責對苯二酚或1,2,4-苯三酚的開環(huán)，最終產生β-酮己二酸進入TCA途徑，被完全代謝。而革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌中對PNP代謝途徑編碼基因的組織方式存在明顯不同。在革蘭氏陽性菌Rhodococcussp.和Arthrobactersp.中，PNP在雙組分4-對硝基苯酚單加氧酶NpcBA(NpsA1A2)[26, 28, 40]或NpdA1A2[29,37]的作用下轉化為1,2,4-苯三酚，進而實現苯環(huán)的開環(huán)。在基因組中雙組分單加氧酶往往與開環(huán)酶在一起形成基因簇(Arthrobactersp. JS44)或操縱元(Rhodococcus菌屬)結構，但與開環(huán)后產物轉化有關的下游途徑則可能位于基因組的不同位置(圖5)。

圖5 不同菌株中對硝基苯酚降解基因簇組織方式[26,29,40,45-46,48]Fig.5 Organization of the degradation gene clusters in different strains[26,29,40,45-46,48]

革蘭氏陰性PNP降解菌中，PNP代謝基因簇的組織結構非常類似。上游途徑對硝基苯酚4-單加氧酶(PnpA)和醌還原酶(PnpB)與下游途徑對苯二酚開環(huán)相關酶組織在一起形成1個基因簇，共同編碼PNP代謝途徑。Burkhoderia菌屬中PNP代謝基因簇的組織方式與Pseudomonas菌屬稍有不同，PnpA、PnpB和對苯二酚開環(huán)途徑組成1個共轉錄的操縱元(圖5)。P.putidaDLL-E4是一株能夠高效降解PNP及其中間代謝產物對苯二酚(HQ)的菌株，DLL-E4基因組中含有2套PNP降解基因簇pnp和pnp1：第1套基因簇pnp包含基因pnpA、pnpB、pnpR、pnpC1、pnpC2、pnpD、pnpE、pnpC、pnpX1和pnpX2，第2套基因簇pnp1包含基因pnpAb、pnpC1b、pnpC2b、pnpDb、pnpEb、pnpCb、pnpX1b和pnpX2b。通過反轉錄PCR確定了PNP降解基因簇的組織形式。雖然pnp1操縱元與Pseudomonassp. WBC-3 PNP代謝操作元具有很高的同源性，但在菌株DLL-E4中，該操縱元失去了降解對苯二酚的能力[45]。

目前，有關PNP降解代謝的調控報道不多，Pseudomonassp. WBC-3中LysR家族的調控蛋白PnpR調控了PNP代謝的上下游代謝途徑，在PnpA和PnpC的啟動子區(qū)均可檢測到PnpR的保守性結合序列GTT-N11-AAC[34]，是1種比較特殊的LysR家族調控體系。P.putidaDLL-E4中存在著與PnpR同源性較高的調控蛋白PnpR[45]，但關于其具體調控機制尚不明確。R.opacusSAO101中ORF1編碼1個可能的LysR家族調控蛋白[26]，該蛋白的調控功能及機制均未見報道。

4 微生物菌群設計與調控在PNP修復中的作用

降解性微生物進入環(huán)境受到其他微生物類群的影響，保持一定的群體數量是其高效降解的關鍵。因此，通過調控土壤環(huán)境中參與PNP降解的相關微生物群落結構，增強其降解效率和穩(wěn)定性是PNP生物修復的可選途徑。PNP高效降解菌Burkholderiasp. SJ98在進入人工污染土壤中能夠顯著改變細菌的群落結構，進而影響PNP的降解效率[23]。此外，外源添加營養(yǎng)物質(如葡萄糖)能夠顯著提高PNP的降解效率[49]。已有研究表明，多菌株協(xié)同作用與單一降解菌相比降解效率更好，穩(wěn)定性更強[50]。因此，利用PNP降解相關菌株之間的協(xié)同代謝和互養(yǎng)關系，構建高效的PNP降解菌群將為開放環(huán)境中PNP的消除提供了更加高效的手段。然而，由于菌株之間復雜的相互作用關系，降解菌群的穩(wěn)定性和構建方法等因素使得目前微生物菌群強化修復距離實際應用還存在一定的距離。

5 微生物與植物聯(lián)合修復在PNP修復中的應用

雖然目前豐富的PNP降解性微生物種質資源為PNP生物修復提供了良好的基礎，然而，由于自然環(huán)境中環(huán)境因子(溫度、氧氣、鹽度等)和污染物理化性質的多變性以及微生物適應性等方面的影響[51]，PNP降解性微生物進入環(huán)境中群體數量和生物活性受到限制。植物在綠色農業(yè)可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[52]，植物能夠為根際微生物降解污染物提供良好的生態(tài)位保護和可利用碳源，而根際微生物在減少污染物對植物的脅迫等方面為植物提供保護。假單胞菌 PN1能在PNP含量為90～155 mg/kg中的土壤中存活，具有高效的PNP去除效率，同時還能在干旱和鹽堿脅迫條件下促進玉米的生長[53]。Romero等[54]通過對污染區(qū)定殖植物的根際微生物組裝機制進行研究，在此基礎上構建了人工菌群，顯著增強了土壤原位修復的能力?；诰不プ鞯奈廴疚镄迯腕w系在河岸緩沖區(qū)的徑流控制、垃圾填埋場、人工濕地等方面也顯示出較好的潛力[55]，然而其在水體和土壤環(huán)境中的微生物與植物介導的PNP修復還未引起足夠的重視。

6 結論與展望

目前，國內外研究者在PNP降解菌資源挖掘、PNP生物降解機制、菌群調控等方面已經做了大量的工作。美國明尼蘇達大學建立了生物催化-生物降解數據庫(UM-BBD)，涉及上千種污染物降解有關的微生物、酶和代謝途徑等多方面內容，并以此為基礎開發(fā)了相關的PNP降解菌劑。然而開放環(huán)境中的PNP降解以及實際應用依然存在諸多問題，主要歸因于污染物降解菌在環(huán)境中適應性弱、定殖能力差、無法形成足夠的群體等以實現污染物的消除，導致外源污染物降解菌在實際環(huán)境中的應用受限。在以菌劑形式開展土壤或者水體環(huán)境修復過程中，以PNP為代表的污染物在降解過程中形成的中間產物和最終產物，它們在環(huán)境中的遷移行為以及對微生物群落和植物的影響需要進一步研究。此外，污染物的轉化涉及降毒再造的過程，在豐富的降解酶資源基礎上，利用降解酶的催化選擇性實現對污染物轉化或者結構修飾，消除其毒性，增加其農業(yè)應用價值，為環(huán)境中PNP等污染物的生物修復提供更多的路徑。