熊 敏，廖永慶，張 敏，苗朝棋，蔡冬波，陳守文

(1.湖北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 省部共建生物催化與酶工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062；2. 武夷學(xué)院 生態(tài)與資源工程學(xué)院 綠色化工技術(shù)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 武夷山 354300)

角蛋白是廣泛存在于動物皮膚及其衍生物(如毛發(fā)、鱗甲和羽毛等)中的蛋白質(zhì)，在自然界中的豐度僅次于甲殼素和纖維素，排在第三位。角蛋白是纖維狀蛋白質(zhì)，其化學(xué)鍵(二硫鍵、氫鍵和疏水相互作用)的取向和相互作用使角蛋白具有特殊的結(jié)構(gòu)，能抵抗多種常用蛋白酶如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的降解[1]。

角蛋白廢棄物具有轉(zhuǎn)化為增值產(chǎn)品或生物能源的巨大潛力，目前角蛋白廢棄物的利用往往涉及污染較大的物理和/或化學(xué)前處理過程，隨著“生物催化”這種綠色技術(shù)的出現(xiàn)，用可降解角蛋白的角蛋白酶代替高能耗、重污染的物理和/或化學(xué)過程越來越受到重視。角蛋白酶的應(yīng)用領(lǐng)域不只局限于角蛋白廢物的去除和轉(zhuǎn)化，還在工業(yè)、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用[2]。本文綜述了角蛋白酶的來源、分類和性質(zhì)，蛋白改造，高效表達(dá)育種，發(fā)酵工藝優(yōu)化以及角蛋白酶的應(yīng)用。

1 角蛋白酶來源、分類及性質(zhì)

細(xì)菌中的芽孢桿菌屬Bacillus是最主要的產(chǎn)角蛋白酶的微生物，其中Bacilluslicheniformis是第一個(gè)商品化的耐熱角蛋白酶VersazymeTM的來源[3]；放線菌中的鏈霉菌屬Streptomyces也有多個(gè)種可以產(chǎn)角蛋白酶；此外，還有Clostridium、Chryseobacterium、Fervidobacterium、Thermoanaerobacter、Kocuria、Stenotrophomonas、Kytococcus、Lysobacter、Vibrio、Brevibacillus、Pseudomonas、Serratia、Microbacterium、Aeromonas、Burkholderia、Rhodococcus、Geobacillus、Amycolatopsis、Meiothermus和Paenibacillus等[4]。

而產(chǎn)角蛋白酶的真菌有Aspergillus、Doratomyces、Myrothecium、Paecilomyces、Scopulariopsis、Trichoderma、Trichophyton、Fusarium、Acremonium、Onygena、Cladosporium、Microsporum、Lichtheimia、Chrysosporium和Aphanoascus[5]。

角蛋白酶大多為單體酶，但也有寡聚酶。根據(jù)酶催化中心的特點(diǎn)可以將角蛋白酶分為絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶及絲氨酸-金屬蛋白酶[6]。按照MEROPS肽酶數(shù)據(jù)庫對蛋白酶的分類，目前已知的角蛋白酶歸屬于14個(gè)蛋白酶家族：S1、S8、S9、S10、S16、M3、M4、M14、M16、M28、M32、M36、M38和M55。其中，歸為內(nèi)切酶的有S1、S8、S16、M4、M16和M36，歸為外切酶的有S9、S10、M14、M28、M38和M55，還有2個(gè)家族M3和M32只水解寡肽中的肽鍵[6]。

不同來源的角蛋白酶分子量差別較大，如來自Streptomycesalbidoflavus的角蛋白酶分子量為1.8×104，來自Kocuriarosea的角蛋白酶的分子量則高達(dá)2.4×105，但是角蛋白酶的分子量主要集中在(2.0～5.0)×104范圍內(nèi)，且多為絲氨酸蛋白酶[5,7]。角蛋白酶的最適pH通常為7.5～9.0，最適溫度為40～60 ℃[6]，從一些極端環(huán)境微生物中分離的角蛋白酶具有更高的最適pH和更高的最適溫度，如Nocardiopsissp. TOA-1的最適pH超過12.5[8]，F(xiàn)ervidobacteriumislandicumAW-1的最適溫度達(dá)到100 ℃[7]，這類能耐高溫和強(qiáng)堿的角蛋白酶在大規(guī)模降解角蛋白時(shí)更具應(yīng)用價(jià)值。表1列舉了部分角蛋白酶的理化性質(zhì)。

表1 部分角蛋白酶的理化性質(zhì)

一些二價(jià)金屬離子，如Ca2+、Mg2+和Mn2+等對角蛋白酶有激活作用，而一些過渡金屬離子和重金屬離子(如Hg2+、Ni2+、Cd2+和Cu2+)則抑制角蛋白酶的活性[15,18]；有機(jī)溶劑和表面活性劑/去污劑對角蛋白酶的活性影響是多樣的，但還原劑的添加對角蛋白酶的活性有促進(jìn)作用[9,12]。

2 角蛋白酶分子改造

從野生型微生物中分離的角蛋白酶的催化活性通常不高，而且難以耐受工業(yè)過程中的高溫、高鹽、極端pH、去污劑、有機(jī)溶劑或氧化劑等加工條件[19]。為了擴(kuò)大角蛋白酶的應(yīng)用范圍，有必要對酶進(jìn)行針對性的改造。用于酶改造的蛋白質(zhì)工程技術(shù)有非理性設(shè)計(jì)(如定向進(jìn)化)和理性設(shè)計(jì)(如定點(diǎn)突變、結(jié)構(gòu)域截短、結(jié)構(gòu)域融合等)[20-21]。

2.1 提高酶催化效率

酶分子改造的目的之一是提高酶的催化效率，可通過調(diào)整酶活性中心的結(jié)構(gòu)、靜電作用或增大疏水相互作用，提高酶對底物的親和力、結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性等來實(shí)現(xiàn)。常用的方法有C端截短、同源蛋白結(jié)構(gòu)域替換以及氨基酸殘基突變等。蛋白酶的C端結(jié)構(gòu)域富含疏水氨基酸，與酶的熱穩(wěn)定性、蛋白折疊和底物特異性相關(guān)，通過截短C端結(jié)構(gòu)，有利于酶的穩(wěn)定、活性中心空間折疊及增強(qiáng)底物特異性，從而提高酶的催化效率。Yan等[22]通過截短C端的PPC結(jié)構(gòu)域使蛋白酶的kcat/Km值由346 mmol/(L·s)提高到2 978～3 927 mmol/(L·s) 。Ribitsch等[23]通過截短角蛋白酶HP70的C端結(jié)構(gòu)域，使突變體對特定底物SUC-AAPF-pNA的催化活性提高了4倍。Fang等[24-25]通過截短角蛋白酶羧基端序列，使酶的催化活性提高1.7倍[24]，通過互換同源角蛋白酶的功能域使酶的催化活性提高2倍、60 ℃的半衰期延長至244.6 min[25]，通過對前導(dǎo)肽的定點(diǎn)突變(S180G/Y215S)，角蛋白酶的比酶活提高1 300 U/mg，達(dá)到4 725 U/mg[26]。

2.2 改變底物特異性

通過理性設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變可改變底物結(jié)合部位的大小、結(jié)構(gòu)或靜電親和力，進(jìn)而改變酶對底物的特異性。來自Stenotrophomonasmaltophilia角蛋白酶KerSMD的PPC結(jié)構(gòu)域具有結(jié)合、水解膠原蛋白的活性，F(xiàn)ang等[24]將該結(jié)構(gòu)域刪除后，使該酶只能水解角蛋白不能水解膠原蛋白，從而應(yīng)用于皮革加工領(lǐng)域。

2.3 增強(qiáng)對化學(xué)試劑(表面活性劑)的耐受性

相對于一般的蛋白酶，角蛋白酶對表面活性劑和有機(jī)溶劑有更好的耐受性，越來越多地被用于洗衣劑中。為了進(jìn)一步增強(qiáng)角蛋白酶在洗衣劑中的穩(wěn)定性，F(xiàn)ang等[25]將來源于S.maltophilia的角蛋白酶的C端截短，極大地增強(qiáng)了角蛋白酶對表面活性劑的耐受性并提高了酶活，在40 g/L SDS溶液中，酶活提高了40%。

2.4 提高耐鹽性和熱穩(wěn)定性

對高濃度鹽的耐受性是工業(yè)用酶的重要特性，酶的耐鹽性與一級結(jié)構(gòu)中酸性氨基酸殘基的大量存在有關(guān)。通過提高酶表面酸性氨基酸殘基含量可以改善酶在高鹽溶液中的穩(wěn)定性，同時(shí)也能提高酶的熱穩(wěn)定性以及對堿性環(huán)境的耐受性[27]。Fang等[24]在截短KerSMD的C-端結(jié)構(gòu)域后，酶的耐鹽性和熱穩(wěn)定性都得到提升，在150 g/L的NaCl溶液中，酶活較野生型提高40%，60 ℃時(shí)酶活是野生型的1.7倍。Rajput等[28]通過互換B.licheniformis和B.pumilus角蛋白酶的前導(dǎo)肽，得到熱穩(wěn)定性提高、半衰期延長的角蛋白酶，KerBL在60 ℃以上是不穩(wěn)定的，當(dāng)KerBL的前導(dǎo)肽序列被KerBP的前導(dǎo)肽序列替換后，酶能耐80 ℃的高溫，且半衰期達(dá)到45 min。

3 角蛋白酶高效表達(dá)菌株選育及發(fā)酵工藝

誘變和表達(dá)原件改造是獲得角蛋白酶高效表達(dá)菌株常用的育種方法。Cai等[29]采用化學(xué)誘變法篩選到產(chǎn)角蛋白酶的Bacillussubtilis突變株，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件后，角蛋白酶活提高到124.8 U/mL，比原菌株提高了83%。Zhang[30]將紫外輻照和亞硝酸鈉誘變2種方式聯(lián)合使用處理野生型B.subtilis，獲得角蛋白酶活性提高75%的突變體。Radha等[31]將角蛋白酶基因啟動子替換為木糖誘導(dǎo)型啟動子，B.licheniformisMKU3的角蛋白酶活力提高到1 277 U/mL。Rao等[32]構(gòu)建了用于蛋白表達(dá)的包括雙啟動子PykzA-P43及優(yōu)化啟動子Pdual3在內(nèi)的一系列啟動子。Xiao等[33]優(yōu)化蛋白表達(dá)元件5′-UTR的二級結(jié)構(gòu)，建立了一系列蛋白高效表達(dá)的5′-UTR序列。筆者所在課題組用上述表達(dá)元件在B.licheniformis中表達(dá)角蛋白酶，搖瓶中酶活提高了4倍，超過4 000 U/mL(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。

角蛋白酶高效表達(dá)菌株的選育結(jié)合發(fā)酵工藝優(yōu)化可以進(jìn)一步提高酶的產(chǎn)量。碳源、氮源及生長底物對角蛋白酶的生產(chǎn)有很大影響。由于分解代謝物阻遏效應(yīng)，葡萄糖、乳糖、麥芽糖等單糖和二糖以及易于同化的有機(jī)氮源(蛋白胨、氨基酸等)會抑制角蛋白酶的生產(chǎn)[16,34]。多糖(如淀粉)則對角蛋白酶的生產(chǎn)有促進(jìn)作用[35]，向培養(yǎng)基中添加大豆粉做氮源能提高角蛋白酶的產(chǎn)量[36]。不同的生長底物亦明顯影響角蛋白酶產(chǎn)量。B.amyloliquefaciensMA20 和B.subtilisMA21以羊毛為生長底物發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶時(shí)表現(xiàn)出顯著的酶活性，兩者酶活分別達(dá)到922和814 U/mL[37]。如以雞毛為底物時(shí)，角蛋白酶的產(chǎn)量分別是B.licheniformis1 295 U/mL[38]、B.amyloliquefaciens610 U/mL[10]、B.cereus350 U/mL[39]、B.pumilus373 U/mL[12]以及B.subtilis319 U/mL[40]。B.subtilis以動物角粉為生長底物時(shí)，酶活達(dá)15 972 U/mL[41]；S.maltophilia以羊毛為生長底物時(shí)的酶活是1 728 U/mL[42]。Aspergillusoryzae以雞毛為生長底物時(shí)，角蛋白酶活達(dá)到2 313 U/mL[43]。冒鑫哲等[44]通過優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，B.subtilis搖瓶發(fā)酵24 h時(shí)角蛋白酶活性較優(yōu)化前提高了4.26倍，且優(yōu)化后的原料成本降低了96%。李光磊等[45]采用混合流加策略，優(yōu)化畢赤酵母產(chǎn)角蛋白酶的發(fā)酵過程，使角蛋白酶產(chǎn)量達(dá)到2 048 U/mL。筆者所在課題組在前述菌株選育的基礎(chǔ)上優(yōu)化發(fā)酵條件后，搖瓶中角蛋白酶活較優(yōu)化前提高2倍(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。

4 角蛋白酶應(yīng)用

角蛋白酶是重要的生物催化劑。角蛋白酶可以添加到洗滌劑中，降解蛋白質(zhì)類污漬，增強(qiáng)去污效果；可以分解獸皮表面的毛發(fā)，用于皮革工業(yè)；可降解朊病毒的蛋白質(zhì)外殼，用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[46]。角蛋白廢棄物經(jīng)角蛋白酶降解后的水解產(chǎn)物可以用于化妝品行業(yè)[47]，用作動物飼料、微生物培養(yǎng)基、有機(jī)肥料和土壤修復(fù)劑[48]，還可以從中分離活性肽和氨基酸[49](圖1)。

圖1 角蛋白酶的應(yīng)用Fig.1 Applications of keratinase

4.1 農(nóng)業(yè)應(yīng)用

4.1.1 飼料原料

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生大量的角蛋白廢棄物，是良好的飼料蛋白來源。羽毛粉用作牲畜飼料添加劑有幾十年歷史了，傳統(tǒng)的高壓蒸煮法或化學(xué)降解法制造羽毛粉能耗大，角蛋白利用率不高[29]。羽毛經(jīng)角蛋白酶水解，轉(zhuǎn)化成氨基酸、肽、可溶性蛋白質(zhì)等，既可提高角蛋白利用率，又避免了傳統(tǒng)方法對環(huán)境的破壞[50]。單春喬等[51]以角蛋白酶水解羽毛粉制備可被動物消化吸收的肽類，在pH8.5條件下處理羽毛粉8 h，產(chǎn)物中70%以上為低聚肽。Adetunji等[48]以B.licheniformisLMUB05角蛋白酶降解羽毛得到的水解產(chǎn)物可以替代商用飼料并用于家禽的飼養(yǎng)。此外，角蛋白酶還可以直接添加到飼料中，幫助動物消化飼料蛋白，提高飼料的吸收利用率和營養(yǎng)價(jià)值[52]。

4.1.2 有機(jī)肥料和土壤修復(fù)劑

隨著全球人口不斷增長，人類對農(nóng)產(chǎn)品和糧食的需求持續(xù)增加，土地被過度開發(fā)，大量使用化肥農(nóng)藥導(dǎo)致肥力喪失、產(chǎn)出下降，成為農(nóng)業(yè)面臨的嚴(yán)重問題。如何讓土地恢復(fù)肥力、休養(yǎng)生息、實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，是農(nóng)業(yè)面臨的重大課題。通過生物轉(zhuǎn)化將角蛋白轉(zhuǎn)變成緩釋有機(jī)氮肥，可逐步提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，恢復(fù)肥力[53]。角蛋白經(jīng)酶解制得有機(jī)肥可以促進(jìn)植物生長、提高土壤保水性及土壤微生物活性[25,53]。角蛋白生物降解產(chǎn)物還能促進(jìn)種子萌發(fā)[54]，為植物合成吲哚乙酸提供色氨酸前體并促進(jìn)植物生長[55]。羽毛經(jīng)Chryseobacteriumspp.發(fā)酵后可用作香蕉種植的氮肥[56]；經(jīng)Aspergillusniger發(fā)酵后用于種植豇豆，能促進(jìn)植物長高、增重、增單株葉數(shù)、增單株豆莢數(shù)、增產(chǎn)及提高抗病性[57]。

4.2 環(huán)保應(yīng)用

4.2.1 皮革加工

傳統(tǒng)皮革加工中的灰堿脫毛過程是污染最嚴(yán)重的環(huán)節(jié)，利用沒有膠原蛋白水解活性的角蛋白酶代替灰堿用于獸皮脫毛，不僅條件溫和、脫毛效果好、不傷皮質(zhì)而且環(huán)境友好，是極有價(jià)值的皮革工業(yè)用酶[58]。角蛋白酶SCK6處理綿羊皮、山羊皮等，表現(xiàn)出優(yōu)良的脫毛活性[59]。賈文睿等[59]用角蛋白酶32 ℃處理兔皮4 h，可以有效除去兔皮上的兔毛，并且兔皮和兔毛損傷小，均可回收利用。

4.2.2 綠色能源

能源短缺是全球面臨的共同問題，人們積極尋求環(huán)保新能源。將廢棄物生物轉(zhuǎn)化為能源是解決能源問題的重要途徑之一。羽毛經(jīng)微生物降解后的副產(chǎn)物可以當(dāng)燃料，如B.lichenifomis和Thermococcuslitoralis可發(fā)酵羽毛制備生物H2。產(chǎn)角蛋白酶的B.lichenifomis先水解羽毛成可溶性物質(zhì)，T.litoralis進(jìn)一步將可溶性物質(zhì)轉(zhuǎn)變成生物氫副產(chǎn)物[60]。羽毛在厭氧條件下經(jīng)B.megaterium發(fā)酵后還可以生產(chǎn)甲烷[61]。由此可見，通過生物轉(zhuǎn)化角蛋白廢棄物制備能源是高效環(huán)保的方式。

4.2.3 廢水處理及重金屬回收

清洗草木灰的廢水中有大量低密度懸浮物，難以清除。羽毛經(jīng)角蛋白酶水解后可以制備絮凝劑用于此類懸浮物的沉降處理[62]。X光片的塑料基底上覆蓋了一層被金屬銀飽和的凝膠層，在放射自顯影后，X光片被廢棄成為環(huán)境污染物。傳統(tǒng)的回收金屬銀的方法昂貴且破壞環(huán)境，而角蛋白酶僅降解凝膠層，直接釋放金屬銀并保持了塑料基底的完整性，是一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的回收重金屬銀的方法[63]。

4.3 其他

紡織行業(yè)中羊毛和化纖混紡織物的舊物利用，必須將兩種成分分開成單一成分才有回收利用的價(jià)值。通過角蛋白酶去除混紡織物中的羊毛成分，使織物成單一化纖成分回收，減少資源浪費(fèi)[64]。在化妝品行業(yè)中，角蛋白酶用作脫毛產(chǎn)品的活性成分，角蛋白水解物用于皮膚保濕和痤瘡護(hù)理及頭發(fā)護(hù)理[47]。醫(yī)藥行業(yè)中用角蛋白酶處理醫(yī)療器械，消除阮病毒可能造成的污染[46]；灰指甲、牛皮癬等疾病的治療中，用角蛋白酶預(yù)處理患處有助于藥物滲透進(jìn)病灶，獲得更好的治療效果[46]。

5 展望

角蛋白酶性質(zhì)穩(wěn)定，具有特異性水解難降解角蛋白的特性，使得該酶具有極大的應(yīng)用價(jià)值，在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、皮革工業(yè)、環(huán)保產(chǎn)業(yè)、新能源領(lǐng)域、化妝品行業(yè)以及醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛。為了獲得新的性能優(yōu)良的角蛋白酶，如高活性、多功能、耐高溫、耐極端pH、耐有機(jī)溶劑、耐鹽、耐表面活性劑等特性，蛋白質(zhì)工程技術(shù)正在發(fā)揮越來越大的作用。角蛋白酶高產(chǎn)菌株的選育和發(fā)酵工藝優(yōu)化可為提高角蛋白酶單位產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本奠定基礎(chǔ)，而新型角蛋白酶功能挖掘和應(yīng)用技術(shù)開發(fā)使角蛋白酶的廣泛應(yīng)用成為可能，這將為緩解人類供需矛盾、人類與自然、人類與環(huán)境的矛盾做出貢獻(xiàn)。