毛水紅，張家鵬，張勇超，徐功志，呂 璐，任新華，孫鈺椋，趙東輪，劉彥禮，郭志坤

(1.河南省醫(yī)用組織再生重點實驗室，新鄉(xiāng)醫(yī)學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院傷口治療科，河南 新鄉(xiāng) 453002；3.河南省茵特賽爾生物技術(shù)有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453000)

近年來，由于全球營養(yǎng)和生活方式的變化，糖尿病的患病率顯著增加，預(yù)計至2045年，糖尿病患者人數(shù)將增加到6.29億[1]。糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer，DFU)作為糖尿病的主要并發(fā)癥，其發(fā)病率也顯著攀升，國際DFU工作組將其定義為糖尿病患者腳踝以下的全層傷口，其與糖尿病患者神經(jīng)病變和外周動脈疾病有關(guān)[2]。DFU除了對患者造成嚴重的生理折磨，包括疼痛、感染、截肢和行動不便外，還會對患者造成嚴重的經(jīng)濟和心理負擔。已有研究報道，超過2%的糖尿病患者每年都會引發(fā)新的足部潰瘍，僅在美國，每年就有約91億美元用于DFU的治療；另外，在世界范圍內(nèi)發(fā)生糖尿病并發(fā)癥患者中，每30 s就會發(fā)生一次截肢，其中84%為DFU患者[3-4]。目前DFU臨床治療指南中常見的治療方式包括清創(chuàng)、感染管理、血管重建和減壓等[5]。然而，缺血、感染、神經(jīng)病變和代謝紊亂所引發(fā)的傷口愈合緩慢，對患者和臨床醫(yī)生均帶來嚴峻的挑戰(zhàn)[6]。同時，即使采用上述綜合治療方案治療12～20周，DFU的治愈率仍低于30%，且愈后復(fù)發(fā)率顯著增加[7-9]。因此，近年來針對常規(guī)DFU治療方法的局限性，間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植在DFU臨床治療中逐漸成為研究熱點。MSCs作為一種多能祖細胞，其常見的來源有骨髓、脂肪、臍帶和子宮內(nèi)膜等組織，具有自我更新、免疫調(diào)節(jié)、低免疫原性等特性，且MSCs體內(nèi)移植安全性和對疾病治療的有效性已獲得多方驗證[10-12]。在促進創(chuàng)面愈合中，MSCs一方面通過旁分泌作用調(diào)節(jié)相關(guān)免疫細胞從而降低炎癥反應(yīng)、促進細胞外基質(zhì)重塑、血管生成和神經(jīng)再生等[13-15]，為創(chuàng)面修復(fù)提供有利微環(huán)境；另一方面MSCs在體內(nèi)可通過轉(zhuǎn)分化成為傷口修復(fù)相關(guān)的細胞，如肌成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞、周細胞和內(nèi)皮細胞等[16]，直接參與創(chuàng)面修復(fù)。迄今，盡管MSCs在促進傷口愈合的治療中展示出了良好的治療效果，但將MSCs臨床前研究轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用尚處于初步階段，其潛在的修復(fù)機制和長期隨訪結(jié)果仍有待進一步研究。因此，本研究將著重探討臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)局部注射對重度DFU患者創(chuàng)面愈合的改善作用及其對肝腎功能的影響，并對UCMSCs促進DFU創(chuàng)面愈合的潛在治療機制進行分析，以期為促進UCMSCs臨床治療DFU提供技術(shù)支持和借鑒。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2019年6月于新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院傷口治療科接受常規(guī)治療同時進行UCMSCs創(chuàng)面周圍局部注射治療的1例患者為研究對象。患者女性，82歲。主訴：雙足皮膚潰爛1 a，感染加重1個月?，F(xiàn)病史：2018年病患雙足皮膚出現(xiàn)潰爛，行右足第一趾截趾術(shù)，術(shù)后傷口長時間不愈合，患者于私人診所治療，2019年5月患者左足創(chuàng)面較前明顯擴大并出現(xiàn)感染。1 a來患者神志清醒，精神差，飲食睡眠差。既往史：糖尿病40 a，高血壓40 a，無腦血管疾病，無肺部疾病，無腎臟疾病，無傳染病史，無遺傳病史，無食物過敏史，無藥物過敏史，預(yù)防接種隨社會進行，系統(tǒng)回顧無其他系統(tǒng)急、慢性疾病。個人史：長期居住于新鄉(xiāng)；無特殊生活習慣，無吸煙史，無飲酒嗜好，無藥物嗜好，無工業(yè)毒物、粉塵、放射性物質(zhì)接觸史，無冶游史?；颊咄耆?、自愿并簽署知情同意書，本臨床試驗通過新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有試驗操作均符合新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院倫理委員會要求。本研究中所使用的UCMSCs均為河南茵特賽爾生物技術(shù)有限公司無償提供。

1.2 治療方法患者治療措施包括：(1)全身治療：積極控制血糖，將患者空腹血糖維持在6 mmol·L-1左右；營養(yǎng)支持，將患者血紅蛋白維持在 100 g·L-1以上、白蛋白維持在35 g·L-1以上。(2)局部治療：創(chuàng)面局部每2～3 d換藥1次，常規(guī)消毒清創(chuàng)后應(yīng)用重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠包扎固定。(3)UCMSCs局部注射治療：UCMSCs移植時間節(jié)點及劑量示意圖見圖1。UCMSCs開始治療記為第0天。第0天：1.0×107個細胞重懸于4 mL 生理鹽水中，于創(chuàng)面周圍(距傷口處1 cm范圍內(nèi))，使用4 mm的美容針頭均勻注射8個點位，每個點位注射0.5 mL細胞懸液；第3天和第6天：1.0×107個細胞重懸于6 mL生理鹽水中，距創(chuàng)面 3 cm 處圍繞全足，1 mL針頭緩慢注射12個點位，每個點位注射 0.5 mL細胞懸液；第9天和第12天：1.5×107個細胞重懸于6 mL生理鹽水中，距創(chuàng)面5 cm處圍繞全足，1 mL針頭緩慢注射12個點位，每個點位注射0.5 mL細胞懸液；第15天和第18天：2.0×107個細胞重懸于8 mL生理鹽水中，圍繞腳踝處，1 mL針頭注射16個點位，每個點位注射0.5 mL 細胞懸液。(4)移植后治療：UCMSCs移植結(jié)束后，每隔2 d左右來醫(yī)院進行常規(guī)換藥和創(chuàng)面處理。

圖1 UCMSCs移植時間節(jié)點及劑量示意圖Fig.1 Diagram of time point and dose used for UCMSCs transplantation

1.3 血常規(guī)、肝腎功能檢測及隨訪分別于第1、10、25天使用XT-4000i全自動五分類血細胞分析儀(日本Sysmex公司)進行血常規(guī)檢測，使用貝克曼庫爾特AU5800全自動生化分析儀(美國Beckman Coulter公司)進行肝腎功能常規(guī)指標檢測，上述所有檢查項目均由新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院完成。分別于第32、40、46、54、62、70天進行隨訪，包括創(chuàng)面膿性分泌物去除、常規(guī)換藥、消毒及拍照。

2 結(jié)果

2.1 UCMSCs移植治療后患者創(chuàng)面愈合情況患者創(chuàng)面愈合情況見圖2。第0天：創(chuàng)面大小約為寬度為2 cm，長度為8 cm，第1跖骨處向內(nèi)連接，中間約有0.5 cm距離，正常組織暴露約有1/5，第3～5跖骨處全部被壞死組織覆蓋，創(chuàng)面周圍結(jié)痂較硬且厚，無法進行剝離。第3天：創(chuàng)面脂肪壞死組織較多，第1跖骨處有向內(nèi)愈合跡象，但中間有約 0.5 cm的距離，正常組織暴露約有1/5，第3～5跖骨處創(chuàng)面均被壞死組織覆蓋，創(chuàng)面周圍結(jié)痂較硬且厚，無法進行剝離。第6天：患者自訴疼痛較之前減輕，創(chuàng)面1/2處開始向內(nèi)生長，正常組織暴露約有1/3，第1跖骨處基本愈合，清理后邊的脂肪壞死組織時出現(xiàn)較重的異味，側(cè)邊顏色變淡，注射部位距離創(chuàng)面 3 cm處有約2 mL出血。第12天：第1跖骨處已愈合，第2跖骨處開始向內(nèi)生長，中間縫隙約有0.5 cm，創(chuàng)面周圍出現(xiàn)結(jié)痂痕跡，較之前明顯減弱，未結(jié)痂處開始有向內(nèi)生長的痕跡，創(chuàng)面后部膿胎較重，異味減輕。第21天：第1跖骨處徹底愈合，第2跖骨處基本愈合，結(jié)痂痕跡較之前減弱，未結(jié)痂處逐漸向內(nèi)生長，創(chuàng)面處膿性分泌物和異味進一步減輕。第27天：創(chuàng)面周圍結(jié)痂基本消失，未結(jié)痂處逐漸向內(nèi)生長明顯，創(chuàng)面后部膿性分泌物和異味均較第21天時進一步改善。

A:UCMSCs移植前3 d患者足部創(chuàng)面情況；B:UCMSCs移植當天患者足部創(chuàng)面情況；C～L:UCMSCs移植第6、12、21、27、32、40、46、54、62、70天患者足部創(chuàng)面情況。

隨訪發(fā)現(xiàn)：自第32天患者第1跖骨處結(jié)痂開始消失，創(chuàng)面逐漸縮小，膿性分泌物由第1跖骨處至第5跖骨處逐漸減少，第62天時已無明顯膿性分泌物，第70天時僅第一跖骨處有直徑2 cm左右創(chuàng)面尚未愈合。

2.2 UCMSCs移植后患者血常規(guī)變化結(jié)果見表1。患者C-反應(yīng)蛋白隨UCMSCs移植治療明顯降低，其他指標無明顯變化。

表1 UCMSCs移植后患者血常規(guī)變化Tab.1 The changes of routine blood test of the patient after UCMSCs transplantation

2.3 UCMSCs移植后患者肝腎功能變化結(jié)果見表2和表3?；颊咧饕文I功能指標隨UCMSCs移植治療無明顯變化。

表2 UCMSCs移植后患者肝功能變化Tab.2 Changes of liver function indexes of patient after UCMSCs transplantation

表3 UCMSCs移植后患者腎功能變化Tab.3 Changes of kidney function indexes of patient after UCMSCs transplantation

3 討論

糖尿病及其并發(fā)癥對下肢影響嚴重，尤其是足部區(qū)域，常表現(xiàn)為足潰瘍，糖尿病是由高血糖引起的非傳染性慢性疾病，預(yù)計到2035年全球患病率將達到5.92億人[1-2]。DFU影響全球約6.3%的糖尿病患者，50%的患者潰瘍易發(fā)生感染，存在下肢截肢風險，69%的糖尿病截肢患者的存活時間不超過5 a。DFU主要是由長期高糖高滲環(huán)境所引起的周圍神經(jīng)病變，過度的氧化應(yīng)激引發(fā)大血管病變以及微血管病變，從而導(dǎo)致保護性知覺喪失，潰瘍形成，疼痛感減弱或喪失，創(chuàng)傷愈合困難，甚至會導(dǎo)致足部變形及截肢[3-5]。因此，臨床上治療DFU應(yīng)從緩解糖尿病癥狀及促進傷口愈合2個方面進行治療。

目前，盡管新的治療方法層出不窮，但DFU反復(fù)感染和潰爛尚未得到有效改善[3]。傷口愈合基本分為3個時期：炎癥期、增生期和愈合期。MSCs可通過抑制炎癥反應(yīng)、增加血管密度、轉(zhuǎn)分化為創(chuàng)面愈合所需細胞以及減少瘢痕形成等途徑協(xié)同促進DFU創(chuàng)面愈合。(1)抑制炎癥：持續(xù)的炎癥反應(yīng)是慢性不愈合傷口的主要特征。慢性炎癥會增加蛋白酶活性，降解膠原蛋白，破壞創(chuàng)面床，抑制增殖和組織重塑，從而阻止創(chuàng)面修復(fù)。已有研究證明，MSCs可通過免疫調(diào)節(jié)作用，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[17]。體外研究發(fā)現(xiàn)，MSCs可通過分泌抗炎因子白細胞介素(interleukin，IL)-10，降低T細胞對抗原提呈細胞的反應(yīng)性；IL-10抗體可顯著抑制MSCs的免疫抑制作用[18]。此外，MSCs除自身分泌抑炎因子外，其還可調(diào)控周圍細胞中相關(guān)信號通路抑制炎癥反應(yīng)，如與骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)共同培養(yǎng)的樹突狀細胞可減少腫瘤壞死因子-α的分泌，增加IL-10的表達；與BM-MSCs共培養(yǎng)的T細胞中IFN-γ和IL-4表達量顯著降低；MSCs還可誘導(dǎo)巨噬細胞向抑制炎癥表型分化[19]。(2)血管重建：缺血通常是傷口愈合受阻的主要原因之一，而干細胞移植可促進缺血環(huán)境下的血管形成，促進創(chuàng)面愈合。臨床研究表明，糖尿病患者局部注射BM-MSCs后可顯著促進傷口愈合，增加創(chuàng)面毛細血管密度[20]；LI等[21]使用UCMSCs在下肢缺血模型的治療中發(fā)現(xiàn)，將UCMSCs注射到股動脈結(jié)扎的小鼠體內(nèi)，可通過增加新生血管數(shù)量來改善缺血肢體的血流供應(yīng)；在輻射小鼠模型中，MSCs移植后可顯著改善皮膚血流灌注量和血管密度[22]。(3)分化潛能：內(nèi)源性干細胞的增殖是皮膚傷口愈合的關(guān)鍵步驟。盡管外源補充的MSCs在體外具有分化為角質(zhì)形成細胞和上皮細胞的轉(zhuǎn)分化能力，但大量研究發(fā)現(xiàn)干細胞移植后在體內(nèi)分化水平極低，通常不足輸入細胞的1%，但仍可觀察到MSCs移植后的改善效果[23-25]。DAS等[26]研究表明，MSCs處理組小鼠創(chuàng)面的血管密度較對照組增加了2倍，但僅2.6%的創(chuàng)面血管表達MSCs標志物，該結(jié)果提示血管密度增加的主要機制不依賴于MSCs的轉(zhuǎn)分化，而在于激活內(nèi)源干細胞的增殖。(4)減少瘢痕形成：盡管纖維化和瘢痕形成是生理性傷口愈合的正常過程，但過度或早期的纖維化會阻礙傷口的有效愈合，如發(fā)生在大面積燒傷、創(chuàng)傷或重要外科手術(shù)中瘢痕疙瘩或增生性瘢痕等[27]。此外，較大的慢性傷口在愈合后也會造成瘢痕的形成，而手術(shù)移除該類瘢痕的同時會引發(fā)額外的炎癥反應(yīng)，造成創(chuàng)傷愈合受阻，導(dǎo)致慢性傷口的形成[28]。MSCs移植已經(jīng)被證明是一種有效的非手術(shù)干預(yù)瘢痕形成的治療方法，其移植后可以降低Ⅰ型和Ⅲ型膠原的比例；而局部應(yīng)用高表達TGF-β的BM-MSCs可顯著降低模型動物瘢痕的深度和密度[29]。本研究對DFU患者在常規(guī)治療的同時給予UCMSCs局部多次注射，治療結(jié)果顯示，治療第3天時，患足第1跖骨處有向內(nèi)愈合跡象，但未連接，正常組織暴露仍約有1/5；治療第12天，第1跖骨處已愈合，第2跖骨處開始向內(nèi)生長，中間縫隙約有0.5 cm，創(chuàng)面周圍出現(xiàn)結(jié)痂痕跡，未結(jié)痂處開始有向內(nèi)生長的痕跡，創(chuàng)面后部膿胎較重，異味減輕；治療第21天，第1跖骨處徹底愈合，第2跖骨處基本愈合，結(jié)痂痕跡較之前減弱，未結(jié)痂處逐漸向內(nèi)生長，創(chuàng)面處膿性分泌物和異味進一步減輕；治療第27天，創(chuàng)面周圍結(jié)痂基本消失，未結(jié)痂處逐漸向內(nèi)生長明顯，創(chuàng)面后部膿性分泌物和異味均較治療第21天時進一步改善?；颊哐Ｒ?guī)C-反應(yīng)蛋白水平隨UCMSCs多次移植呈明顯下降趨勢，其他指標無明顯變化；患者肝腎功能隨治療時間也無明顯變化。隨訪發(fā)現(xiàn)，自第32天開始第1跖骨處結(jié)痂開始消失，創(chuàng)面逐漸縮小，膿性分泌物由第1跖骨處至第五跖骨處逐漸減少，第62天時已無明顯膿性分泌物，第70天時僅第1跖骨處有直徑2 cm左右創(chuàng)面尚未愈合。這一結(jié)果證實，多次局部注射UCMSCs可有效控制和降低創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，顯著促進糖尿病患者重度DFU創(chuàng)面愈合，且對患者肝腎功能無明顯影響。

綜上所述，MSCs可通過抑制炎癥、促進肉芽形成以及協(xié)助愈后組織重塑防止瘢痕形成等作用來促糖尿病患者重度DFU創(chuàng)面修復(fù)。但目前臨床研究對于使用何種MSCs效果最佳尚未達成共識，也尚未確定最佳的MSCs移植方式。本研究通過臨床實踐證明，多次局部注射UCMSCs后可顯著促進糖尿病患者重度DFU創(chuàng)面愈合，有效控制和降低創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，且對患者肝腎功能無明顯影響。這將為UCMSCs在臨床應(yīng)用中治療重度DFU的有效性和安全性提供支持和借鑒。