段 聿，陳 吉，崔 宏，高美麗，趙翠娟，牛昊書，王 舉

(1.內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017)

胃癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均較高[1]。雖然人們的飲食結(jié)構(gòu)在不斷調(diào)整，但胃癌的發(fā)病率仍呈升高趨勢，給人們的生命健康造成嚴(yán)重威脅[2-3]。有研究表明，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)可在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄及翻譯等多個層面實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的調(diào)控，從而在多種惡性腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[4]。研究證實(shí)，lncRNA尿路上皮癌胚抗原1(urothelial carcinoma antigen 1，UCA1)在膽囊癌、膀胱癌等腫瘤中存在差異表達(dá)，且與患者預(yù)后密切相關(guān)，常作為癌癥診斷和預(yù)后評估的標(biāo)志物，可能為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[5-6]。目前關(guān)于lncRNA UCA1參與胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的具體機(jī)制仍不明確，需進(jìn)一步探討。本研究采用RNA干擾技術(shù)抑制胃癌細(xì)胞BGC-823中高表達(dá)的lncRNA UCA1基因，并觀察lncRNA UCA1低表達(dá)對胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器胃癌細(xì)胞株BGC-823購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自上海羽朵生物科技有限公司，lipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量分析試劑盒購自廣州邁博生物科技有限公司，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒購自德國QIAGEN公司，一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；DMI3000B型倒置熒光顯微鏡購自德國Leica公司，Step One Puls Real Time PCR儀購自美國ABI公司，800TS酶標(biāo)儀購自美國Biotek公司，silncRNA UCA1(5′-ACGUGUACGGAACUGACGU-3′)、control-si序列(5′-CGUAUGGCUAGUGCUGAGC-3′)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)胃癌BGC-823細(xì)胞接種至含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期的BGC-823細(xì)胞，胰蛋白酶消化、重懸，以每孔3×104個接種至24孔板，并分為對照組、空載組和沉默組，每組5個復(fù)孔。繼續(xù)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。將5 μL silncRNA UCA1(100 pmol)與 245 μL無血清不含雙抗培養(yǎng)基混勻(A液)，將5 μL lipofectamineTM2000與 245 μL不含血清不含雙抗培養(yǎng)基混勻(B液)，A、B液均靜置5 min后混勻，靜置20 min；沉默組：將A、B混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)板，常溫孵育30 min，37 ℃繼續(xù)同條件培養(yǎng)48 h，于光鏡下和倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率?？蛰d組：用control-si代替silncRNA UCA1同法轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞；對照組細(xì)胞不做處理。

1.2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)法檢測細(xì)胞增殖能力收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BGC-823細(xì)胞及對照組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×107L-1，接種于96孔板，每孔100 μL，每組5個復(fù)孔，培養(yǎng)至24、48、72 h時，分別加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)4 h后棄去上層培養(yǎng)液，使用酶標(biāo)儀于波長 450 nm處測定吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。吸光度值越大，代表細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BGC-823細(xì)胞及對照組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×107L-1，接種至6孔板，每孔2.5 mL，每組5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞再次融合為單層細(xì)胞時，用50 μL無菌吸頭于培養(yǎng)板中間劃一直線，用細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕吹洗直線邊緣，保證邊緣整齊，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算各組細(xì)胞遷移率。遷移率=(0 h劃痕寬度-培養(yǎng)24 h后劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力采用杯狀結(jié)構(gòu)的Transwell小室法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BGC-823細(xì)胞及對照組細(xì)胞的侵襲能力。杯底濾膜由RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋的人工基質(zhì)均勻涂布，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱放置30 min后干燥，在小室的下室加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h的BGC-823細(xì)胞上清液，上室加入BGC-823單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后棄上清，鑷子小心夾取濾膜，放入體積分?jǐn)?shù)3.7%甲醇中固定，然后結(jié)晶紫染色，隨機(jī)取5個視野，拍照并計(jì)數(shù)侵襲至濾膜背后的細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。

1.2.6 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)法檢測BGC-823細(xì)胞中l(wèi)ncRNA UCA1、微RNA(microRNA,miR)-143-3p、FGF1基因表達(dá)各組細(xì)胞貼壁生長至約為6孔培養(yǎng)板底面積的95%時，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞中總RNA，瓊脂糖凝膠電泳法鑒定RNA樣本完整性，反轉(zhuǎn)錄法獲得互補(bǔ)鏈cDNA；根據(jù)SYBR PremixEX Taq試劑盒說明書進(jìn)行RT-qPCR。引物序列：UCA1正向引物序列為5′-AGTCATGCTGTGACTGATGCG-3′，反向引物序列為5′-AAGTGCTGCCTGTGACCTGCG-3′；FGF1正向引物序列為5′-CGATGCTGTAGTGCTGATGTC-3′，反向引物序列為5′-GGTGATGTCCCGTGATGTCGT-3′；甘油醛-3-磷酸脫氨酶(glyceraldehyde-3-phosphote dehydrogenase,GAPDH)正向引物序列為5′-GTAGCTGTGCCAAGTGCCATG-3′，反向引物序列為5′-CCTGATGCTGGTAGTGATCGT-3′；miRNA-143-3p正向引物序列為5′-TAGTGCGTAGCTGATGCCTGC-3′，反向引物序列為5′-CTGATGCTGGTAGTCGAACTG-3′；U6正向引物序列為5′-ATGCTGATGCTGATGGCTGGA-3′，反向引物序列為5′-CCTAGAATGTGCGTGGATGAT-3′。反應(yīng)體系：Taq酶11.0 μL，10.0 μmol·L-1上下游引物各1.0 μL，cDNA 2.0 μL，雙蒸水(double distilled water，ddH2O) 10.0 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性5 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，重復(fù)40個循環(huán)。以GAPDH和U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率調(diào)節(jié)激發(fā)光于綠光，暗視野下可見轉(zhuǎn)入silncRNA UCA1或空載siRNA的BGC-823細(xì)胞發(fā)綠色熒光，未轉(zhuǎn)入則無熒光(圖1)，轉(zhuǎn)染效率約為80%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

A：沉默組光鏡下圖片；B：沉默組倒置熒光顯微鏡下圖片；C：空載組光鏡下圖片；D：空載組倒置熒光顯微鏡下圖片。

2.2 3組細(xì)胞增殖能力比較結(jié)果見表1。培養(yǎng)24、48、72 h時，沉默組細(xì)胞的增殖能力顯著低于對照組和空載組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對照組與空載組各時間點(diǎn)細(xì)胞增殖能力比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組細(xì)胞的增殖能力均隨時間的延長而升高，各時間點(diǎn)之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 3組細(xì)胞增殖能力比較Tab.1 Comparison of proliferation ability of cells among the three groups

2.3 3組細(xì)胞遷移能力比較結(jié)果見圖2。對照組、空載組及沉默組細(xì)胞遷移率分別為(71.44±6.19)%、(70.87±6.12)%、(42.31±5.18)%。沉默組細(xì)胞遷移率顯著低于對照組和空載組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對照組與空載組細(xì)胞遷移率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：對照組；B：空載組；C：沉默組。

2.4 3組細(xì)胞侵襲能力比較結(jié)果見圖3。對照組、空載組和沉默組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(126.33±10.00)、(127.33±11.33)、(61.00±5.33)個。沉默組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組和空載組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對照組與空載組穿膜細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：對照組；B：空載組；C：沉默組。

2.5 3組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA UCA1、miR-143-3p、FGF1基因相對表達(dá)量比較結(jié)果見表2。沉默組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA UCA1、FGF1基因相對表達(dá)量低于對照組和空載組，miR-143-3p基因相對表達(dá)量高于對照組和空載組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對照組與空載組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA UCA1、miR-143-3p、FGF1基因相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 3組細(xì)胞lncRNA UCA1、miR-143-3p、FGF1基因相對表達(dá)量比較Tab.2 Comparison of relative expressions of lncRNA UCA1,miR-143-3p and FGF1 genes of cells among the three groups

3 討論

近年來，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)，胃癌的發(fā)病原因除幽門螺桿菌感染、酗酒等因素外，還包括基因突變、基因驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄組異常等[7-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌發(fā)生、發(fā)展的不同階段，約140多種基因表達(dá)紊亂或基因表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生變異[9]。lncRNA是一種不具有編碼蛋白質(zhì)功能的長度約200個核苷酸的RNA分子，lncRNA可通過多種途徑參與調(diào)控惡性腫瘤的增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)活動，如修飾組蛋白、重塑染色體、調(diào)控miRNA等，但具體調(diào)控機(jī)制仍不明確[10]。因此，探討lncRNA對胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的調(diào)控作用對臨床上胃癌的治療有重要價值。

UCA1屬于競爭性內(nèi)源RNA，在膀胱癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中呈異常高表達(dá)，可通過吸附miRNA間接調(diào)控靶基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，提高癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力[11-12]。ZHAO等[13]研究表明，lncRNA UCA1在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)量明顯高于正常腦組織，且與腫瘤分級密切相關(guān)；體外實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，lncRNA UCA1可通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1轉(zhuǎn)錄促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。蔡華榮等[14]研究表明，下調(diào)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中l(wèi)ncRNA UCA1的表達(dá)可有效抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，沉默胃癌細(xì)胞BGC-823中l(wèi)ncRNA UCA1表達(dá)后，其各時間點(diǎn)的增殖能力、細(xì)胞遷移率和穿膜細(xì)胞數(shù)均低于對照組和空載組，與ZHAO等[13]和蔡華榮等[14]研究結(jié)果一致，證實(shí)抑制lncRNA UCA1可顯著抑制胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖、遷移和侵襲能力。

研究表明，lncRNA擁有多種調(diào)控模式，某些lncRNA分子轉(zhuǎn)錄后可通過調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮信號傳遞作用，如lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，lncRNA可通過吸附miRNA調(diào)控下游靶基因，進(jìn)而影響癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等活動[15-16]。LUO等[17]研究表明，lncRNA UCA1可能通過調(diào)節(jié)miR-143及其下游高遷移率族蛋白B1調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，沉默組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA UCA1、FGF1基因相對表達(dá)量低于對照組和空載組，miR-143-3p基因相對表達(dá)量高于對照組和空載組，提示lncRNA UCA1/miR-143-3p/FGF1軸可能是調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的重要機(jī)制，進(jìn)一步證實(shí)lncRNA UCA1可能通過lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。

綜上所述，lncRNA UCA1低表達(dá)可顯著抑制胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖、遷移和侵襲能力，可能通過調(diào)控lncRNA UCA1/miR-143-3p/FGF1軸發(fā)揮作用。在未來的研究中，需進(jìn)一步探討是否存在其他miRNA及下游mRNA參與調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。