鄧櫻 唐潤(rùn)偉 衛(wèi)菊 樂楓 劉云龍 錢耀明

摘要 目的：探討“黃芪-莪術(shù)”藥對(duì)通過PTEN與p-AKT對(duì)人乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231）增殖的作用機(jī)制。方法：將MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行“黃芪-莪術(shù)”藥對(duì)（藥對(duì)組）、順鉑（順鉑組）、“黃芪-莪術(shù)”藥對(duì)聯(lián)合順鉑（藥對(duì)+順鉑組）治療，并設(shè)置空白對(duì)照組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，RT-qPCR檢測(cè)PTEN與p-AKT的mRNA表達(dá)水平，Western Blotting檢測(cè)p-AKT蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，藥對(duì)組PTEN mRNA表達(dá)水平上升，OD值與p-AKT蛋白表達(dá)水平下降（P<0.05），p-AKT mRNA蛋白表達(dá)水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;順鉑組OD值與PTEN mRNA表達(dá)水平下降（P<0.05），p-AKT mRNA與蛋白表達(dá)水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;而藥對(duì)+順鉑組在藥對(duì)治療的基礎(chǔ)上能進(jìn)一步抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，促進(jìn)PTEN mRNA的表達(dá)，抑制p-AKT mRNA與蛋白表達(dá)水平。結(jié)論：“黃芪-莪術(shù)”藥對(duì)抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖的機(jī)制可能通過上調(diào)PTEN基因而直接抑制AKT蛋白水平。

關(guān)鍵詞 黃芪;莪術(shù);藥對(duì);MDA-MB-231;增殖;PTEN;p-AKT;乳腺癌

Abstract Objective：To explore the effects mechanism of “Radix Astragali seu Hedysari-Rhizoma Curcumae” on the proliferation of MDA-MB-231 cells through PTEN and p-AKT.Methods：MDA-MB-231 cells were treated with “Radix Astragali seu Hedysari-Rhizoma Curcumae” drug pair（drug pair group），cisplatin（cisplatin group），“Radix Astragali seu Hedysari-Rhizoma Curcumae” drug pair combined with cisplatin（drug pair+cisplatin group），and blank control group was set.Then，MTT method was used to detect cell proliferation，RT-qPCR was used to detect PTEN and p-AKT mRNA expression levels，and Western blot was used to detect p-AKT protein expression levels.Results：Compared with the blank control group，the PTEN mRNA expression level of the drug-pair group increased，the OD value and p-AKT protein expression level decreased（P<0.05），the p-AKT mRNA protein expression level did not change significantly（P>0.05）; the OD value and PTEN mRNA expression level of the cisplatin group decreased（P<0.05），and the expression levels of p-AKT mRNA and protein did not change significantly（P>0.05）; while the drug pair+cisplatin group could further improve on the basis of drug pair treatment Inhibit MDA-MB-231 cell proliferation，promote PTEN mRNA expression，and inhibit p-AKT mRNA and protein expression levels.Conclusion：The mechanism of “Radix Astragali seu Hedysari-Rhizoma Curcumae” drug on inhibiting MDA-MB-231 cell proliferation may directly inhibit AKT protein level by up-regulating PTEN gene.

Keywords Radix Astragali seu Hedysari; Rhizoma Curcumae，Herb-partners; MDA-MB-231; Proliferation; PTEN; p-AKT; Breast cancer

中圖分類號(hào)：R273;R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.11.013

乳腺癌是僅次于肺癌的第二大常見惡性腫瘤，是導(dǎo)致癌癥死亡的第五大常見原因[1-2]。其中，三陰性乳腺癌是高轉(zhuǎn)移性異質(zhì)性乳腺癌，在乳腺癌中占10%～20%，其治療已逐漸成為乳腺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題。

化療、放療、內(nèi)分泌治療等常用于抑制腫瘤生長(zhǎng)，減少乳腺癌復(fù)發(fā)。順鉑是目前最廣泛使用、臨床療效顯著的化療藥物和抗癌劑[3]，但部分患者進(jìn)行化療后會(huì)受到不良反應(yīng)的困擾或?qū)λ幬锂a(chǎn)生一定耐藥性[4]。有研究表明，多種自然療法對(duì)癌癥有效，尋找具有生物活性的天然產(chǎn)物可能為乳腺癌治療提供另一種策略[5]。

益氣活血中藥黃芪-莪術(shù)的配伍是臨床常用抗腫瘤組合[6]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)黃芪-莪術(shù)配伍能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[7]。黃芪-莪術(shù)抗腫瘤作用很大程度上是通過抑制細(xì)胞凋亡的基因蛋白表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的活性因子增強(qiáng)而實(shí)現(xiàn)的[8]。

在多種腫瘤抑制途徑中，PTEN作為腫瘤抑制基因，主要通過PI3K/AKT通路發(fā)揮其抑癌功能[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，激活PTEN能抑制p-AKT蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]，且PTEN能通過p-AKT對(duì)乳腺癌產(chǎn)生影響[11]。

為闡明黃芪-莪術(shù)的抗乳腺癌效果，用黃芪-莪術(shù)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理，檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖及PTEN和p-AKT表達(dá)情況，為乳腺癌的治療提供可能的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 MDA-MB-231細(xì)胞（ATCC中心，美國(guó)，批號(hào)：HTB-26），將細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清（FBS）與1%青-鏈霉素，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次。

1.1.2 藥物 按照臨床最常用劑量：黃芪30 g、莪術(shù)15 g，將中藥液熬制濃縮為500 mL。將濃縮中藥液放于真空冷凍干燥機(jī)-50 ℃預(yù)凍5 h;-20 ℃低溫升華干燥14 h;30 ℃解析干燥10 h后于-20 ℃環(huán)境中密封保存。使用時(shí)，1 mL超純水溶解1 g凍干粉，混勻后高溫高壓消毒滅菌，4 ℃下保存。

1.1.3 試劑及儀器 順鉑（Hospira公司，澳大利亞，批號(hào)：H20090521）;辣根過氧化物酶（蘇州亞科科技股份有限公司，批號(hào)：L0001）、GAPDH（Jackson Immuno Research公司，美國(guó)，批號(hào)：AP0063）;qPCR引物（RiboBio公司，批號(hào)：siB07112111271-1-5，siB101025113730-1-5，siG000026330A-1-5）;p-AKT（Abcam公司，英國(guó)，批號(hào)：ab8805）;DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)，批號(hào)：11995065）;FBS（Gibco，美國(guó)，批號(hào)：10270-106）;TRIzol試劑盒（Invitrogen公司，美國(guó)，批號(hào)：15596026）;高容量cDNA RT試劑盒（Applied Biosystems公司，美國(guó)，批號(hào)：4368814）;BCA試劑盒（武漢博士德公司，批號(hào)：AR0197）;電子精密天平（Sartorius公司，德國(guó)，型號(hào)：GL8201-1SCN）;BIO-TEK Elx800酶標(biāo)儀（BIO-TEK公司，美國(guó)，型號(hào)：ELx800）;BioPhotometer D30核酸蛋白測(cè)定儀（Eppendorf公司，德國(guó)，型號(hào)：D30）;SYBR Green PCR mix（Applied Biosystems公司，美國(guó)，批號(hào)：4367659）;顯影儀（Healthcare公司，瑞典，型號(hào)：AI680）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整MDA-MB-231細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，96孔板每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞，接種2 d后細(xì)胞生長(zhǎng)基本融合。將培養(yǎng)的細(xì)胞分為藥對(duì)組、順鉑組、藥對(duì)+順鉑組以及空白對(duì)照組。

1.2.2 干預(yù)方法 藥對(duì)組加入濃度為25%的“黃芪-莪術(shù)”凍干粉、順鉑組加入30 μg/mL順鉑、藥對(duì)+順鉑組加入25%的“黃芪-莪術(shù)”凍干粉+30 μg/mL順鉑，空白對(duì)照組不添加任何藥物。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 MTT法檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞增殖 取上述各組MDA-MB-231細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（無細(xì)胞，僅含培養(yǎng)液）和陰性對(duì)照孔（含細(xì)胞和培養(yǎng)液）。于藥物作用2 d后，棄上清液，每孔加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液100 μL和MTT溶液20 μL，放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后，棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，微量振蕩15 min。應(yīng)用BIO-TEK Elx800酶標(biāo)儀，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)得每孔的光密度值。

1.2.3.2 RT-qPCR檢測(cè) 使用TRIzol試劑盒從MDA-MB-231細(xì)胞中提取總RNA，核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)量260 nm和280 nm下OD比值及RNA水平，OD260 nm/OD280 nm比值在1.8～2.0之間說明RNA純度較高。使用高容量cDNA RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在qPCR中，用SYBR Green PCR mix擴(kuò)增cDNA樣本，檢測(cè)p-AKT和PTEN的表達(dá)水平。使用GAPDH為內(nèi)參。引物序列見表1。

1.2.3.3 Western Blotting法測(cè)定蛋白表達(dá) 用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解MDA-MB-231細(xì)胞15 min，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離相同數(shù)量的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。恒流100 mA過夜，PVDF轉(zhuǎn)膜，PBST漂洗，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗p-AKT（1∶1 000稀釋）、GAPDH（1∶2 000稀釋）室溫下輕搖孵育1 h，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶500稀釋）室溫孵育1 h，PBST漂洗后浸洗3次，10 min/次。使用Odyssey雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)獲得圖片，運(yùn)用Quantity One圖像分析軟件測(cè)得條帶灰度值，將各目的條帶與內(nèi)參條帶比值后，比較各組間差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料2組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組間的數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)觀察 給藥2 d后，顯微鏡下觀察MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組細(xì)胞排列緊密，數(shù)量較多，形態(tài)正常;藥對(duì)組可見細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞膜不完整;順鉑組可見細(xì)胞數(shù)量減少，有回縮，折光增強(qiáng)，細(xì)胞膜不完整;藥對(duì)+順鉑組可見細(xì)胞胞質(zhì)回縮，有空泡，并伴有較多飄漂浮死細(xì)胞。見圖1。說明“黃芪-莪術(shù)”藥對(duì)能促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，且作用效果與順鉑相似。

2.2 MDA-MB-231細(xì)胞增殖情況 MTT法檢測(cè)藥物干預(yù)2 d后MDA-MB-231細(xì)胞增殖水平，發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組比較，藥對(duì)組、順鉑組、藥對(duì)+順鉑組OD值均下降（均P<0.01）;與藥對(duì)組比較，順鉑組、藥對(duì)+順鉑組OD值均下降（均P<0.01）;與順鉑組比較，藥對(duì)+順鉑組OD值下降（P<0.05）。說明順鉑與“黃芪-莪術(shù)”藥對(duì)都能抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，且順鉑較“黃芪-莪術(shù)”藥對(duì)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制效果更為顯著，而二者聯(lián)合使用時(shí)能更大程度上抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖。見表2。說明“黃芪-莪術(shù)”藥對(duì)能抑制MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)，其抑制程度較順鉑輕。

2.3 GAPDH、p-AKT2、PTEN溶解曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線 ?繪制MDA-MB-231細(xì)胞GAPDH、p-AKT2、PTEN溶解曲線，發(fā)現(xiàn)都為單峰，未見雜峰信號(hào)，說明GAPDH、p-AKT2、PTEN的逆轉(zhuǎn)錄PCR參數(shù)選擇適當(dāng)，產(chǎn)物特異性好;繪制擴(kuò)增曲線發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增曲線光滑，呈標(biāo)準(zhǔn)的S形且拐點(diǎn)清晰。見圖2。為后續(xù)RT-qPCR檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞p-AKT2、PTEN的mRNA水平打下基礎(chǔ)。

2.4 MDA-MB-231細(xì)胞p-AKT2、PTEN的mRNA表達(dá)水平 各組細(xì)胞藥物干預(yù)2 d后，RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各組MDA-MB-231細(xì)胞中p-AKT2表達(dá)水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與空白對(duì)照組比較，藥對(duì)組、順鉑組和藥對(duì)+順鉑組的PTEN的mRNA表達(dá)水平都上升（均P<0.05）;與藥對(duì)組比較，順鉑組PTEN表達(dá)水平下降（P<0.05），而藥對(duì)+順鉑組PTEN表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與順鉑組比較，藥對(duì)+順鉑組TEN的mRNA表達(dá)水平上升（P<0.05）。說明順鉑與“黃芪-莪術(shù)”藥對(duì)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞p-AKT2的mRNA表達(dá)水平無影響，而藥對(duì)能增加MDA-MB-231細(xì)胞PTEN的mRNA表達(dá)。見表2。

2.5 MDA-MB-231細(xì)胞p-AKT2的蛋白表達(dá)水平 ? 藥物治療2 d后，Western Blotting檢測(cè)各組MDA-MB-231細(xì)胞中p-AKT2蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組比較，藥對(duì)組和藥對(duì)+順鉑組p-AKT2蛋白表達(dá)水平都上升（均P<0.01），而順鉑組p-AKT2蛋白表達(dá)水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與藥對(duì)組比較，順鉑組p-AKT2蛋白表達(dá)水平上升（P<0.01），而藥對(duì)+順鉑組p-AKT2蛋白表達(dá)水平下降（P<0.01）;與順鉑組比較，藥對(duì)+順鉑組p-AKT2蛋白表達(dá)水平下降（P<0.01）。說明“黃芪-莪術(shù)”藥對(duì)能抑制MDA-MB-231細(xì)胞p-AKT2蛋白表達(dá)水平，而順鉑對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞p-AKT2蛋白表達(dá)水平無影響。見表3，圖3。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居女性惡性腫瘤譜榜首，并且近年來我國(guó)女性乳腺癌的發(fā)病情況日趨低齡化[12]。化療、放療、內(nèi)分泌治療等常用于清除殘留腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)，減少乳腺癌復(fù)發(fā)[13]。中醫(yī)學(xué)上，乳腺癌患者有正虛邪實(shí)的證候特點(diǎn)。正虛以氣虛病機(jī)為本，同時(shí)常常兼有邪實(shí)，其中以血瘀者為多，因此，對(duì)此類患者的中醫(yī)治療以益氣活血化瘀為主，以降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、提高治愈率。

在過去的幾十年里，研究人員探索了許多有臨床價(jià)值的草藥的生物學(xué)特性，通過長(zhǎng)期的臨床觀察及分析，發(fā)現(xiàn)黃芪含有多種生物活性化合物，包括多糖、類黃酮和皂苷等，具有利尿、引流膿腫的作用[14-15]。黃芪味甘，性微溫，入肺脾經(jīng)，具有健脾益氣之功效，既能使脾氣健運(yùn)，痰濁得消，又能行氣活血，使瘀血自消，達(dá)到預(yù)防乳腺癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的作用。在臨床上，黃芪作為扶正代表藥物，用于治療各種癌癥，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)其能增強(qiáng)厄洛替尼對(duì)三陰性乳腺癌異種移植的抗腫瘤作用[16]。在中醫(yī)臨證中還常選配莪術(shù)，其性溫，味辛、苦，歸肝脾經(jīng)，具有行氣破血，消積止痛之功，常用于癥瘕痞塊的治療。有研究證實(shí)莪術(shù)可以直接抑制腫瘤增殖相關(guān)蛋白的合成[17]，與黃芪合用，能在祛邪的同時(shí)而不傷正，對(duì)腫瘤治療產(chǎn)生積極作用。

通過探討“黃芪-莪術(shù)”藥對(duì)聯(lián)合順鉑對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖作用，發(fā)現(xiàn)順鉑或者“黃芪-莪術(shù)”藥對(duì)都能抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，而“黃芪-莪術(shù)”藥對(duì)與順鉑聯(lián)用能進(jìn)一步抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，說明“黃芪-莪術(shù)”藥對(duì)能夠抑制乳腺癌的發(fā)生。

研究表明惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素多步驟的過程，其與細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)生異常改變、細(xì)胞接受異常增殖分化信號(hào)等密切相關(guān)[18]。因此，研究與乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號(hào)通路及其作用機(jī)制，對(duì)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖至關(guān)重要[19]。PTEN是具有雙重特異磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物位于細(xì)胞質(zhì)，主要參與促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞黏附及轉(zhuǎn)移等作用，在多種腫瘤組織中均檢測(cè)到PTEN蛋白的表達(dá)缺失[15]。AKT屬于原癌基因，其C末端和N末端有2個(gè)催化位點(diǎn)[20]，能被磷酸化，其磷酸產(chǎn)物為p-AKT，可以抑制腫瘤的凋亡[9]，PTEN可能通過p-AKT發(fā)揮其抑制腫瘤作用[11]。

本研究表明，“黃芪-莪術(shù)”藥對(duì)能促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞PTEN mRNA的表達(dá)，抑制p-AKT蛋白表達(dá)，但對(duì)p-AKT的mRNA表達(dá)水平無影響。在增加了順鉑對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的干預(yù)實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)順鉑抑制PTEN mRNA的表達(dá)，并且對(duì)AKT mRNA與蛋白表達(dá)水平都無影響;而聯(lián)合“黃芪-莪術(shù)與順鉑治療發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞PTEN mRNA的表達(dá)，抑制AKT mRNA與蛋白表達(dá)。上述增殖實(shí)驗(yàn)，說明“黃芪-莪術(shù)”藥對(duì)抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖的機(jī)制可能主要是通過上調(diào)PTEN基因而直接抑制AKT蛋白水平。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)“黃芪-莪術(shù)”藥對(duì)抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖的機(jī)制與PTEN及p-AKT蛋白水平相關(guān)，其能通過上調(diào)PTEN及下調(diào)p-AKT的表達(dá)抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，揭示了“黃芪-莪術(shù)”藥對(duì)對(duì)三陰性乳腺癌的作用機(jī)制。

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（2020-08-27收稿 責(zé)任編輯：吳珊，徐穎）