付世華 ,周 驥 ,葉曉芳 ,楊丹丹 ,楊絲絮 (.蘭州大學公共衛(wèi)生學院,職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生研究所,甘肅 蘭州 730000；.上海市氣象局上海市氣象與健康重點實驗室,上海 00030)

哮喘是由多種細胞(如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等)和細胞組分參與的以氣道慢性炎癥為特征的異質性疾病[1-2].PM2.5已被科學證實與哮喘急性加重以及反復發(fā)作密切相關[3-4].近年來免疫學研究認為,Th17輔助細胞(Th17)及調節(jié)性 T細胞(Treg)與PM2.5發(fā)揮毒效應有著密切聯(lián)系[5],在哮喘發(fā)病機制中發(fā)揮著關鍵作用[6-7].Th17細胞主要受轉錄因子維甲酸相關孤核受體 γt(RORγt)的調節(jié),能夠高表達分泌白介素 17(IL-17),造成炎癥細胞浸潤及組織損傷[8-10].而由叉頭轉錄因子 p3(Foxp3)介導分化的Treg細胞是和Th17細胞具有相反作用的另一類T細胞亞群,它在控制免疫炎癥方面起著重要的作用,兩者的失衡極化狀態(tài)被認為是引發(fā)炎癥性疾病如哮喘的重要原因[11-12].有實驗證實高濃度的顆粒物暴露可誘導RORγt的產(chǎn)生,下調Foxp3的表達,通過影響RORγt /Foxp3通路途徑來使Th17/Treg細胞極化,介導 PM2.5的機體損傷過程[13-15].

除PM2.5的影響外,低溫刺激作為引起哮喘急性發(fā)作的常見危險因素也得到了廣泛的研究[16-18].越來越多證據(jù)表明低溫刺激和細顆粒物聯(lián)合暴露對呼吸系統(tǒng)的影響存在一定聯(lián)系.流行病學研究發(fā)現(xiàn),秋冬季節(jié)的溫度驟降對顆粒物致哮喘急診就診率增加有顯著影響,且與疾病嚴重程度呈正相關[19].國內外研究也指出,PM2.5和環(huán)境溫度與哮喘發(fā)病率有明顯關聯(lián),認為低溫和PM2.5可能產(chǎn)生協(xié)同作用引起不利的呼吸系統(tǒng)健康影響[20-21].此外,一項實驗研究也表明,持續(xù)的低溫刺激可以促進PM2.5引起的炎癥反應,顯著增加肺內多種炎癥因子的濃度[22].由此可見,低溫刺激可能會增強PM2.5對炎癥性疾病的毒性作用,但目前關于低溫刺激和PM2.5對哮喘氣道炎癥影響僅限于流行病學研究.本文利用低溫刺激與PM2.5對哮喘小鼠進行聯(lián)合暴露實驗,觀察聯(lián)合暴露對哮喘小鼠氣道炎癥的加重情況,驗證低溫刺激和細顆粒物之間存在的交互作用,并初步探索 Th17/Treg 信號通路與交互作用致哮喘加劇的潛在聯(lián)系,以期為哮喘治療早期預測應答提供新思路.

1 材料和方法

1.1 動物模型建立

8周齡雄性無特定病原體的BALB/c小鼠35只,體重 20～25g,由上海杰思捷實驗動物有限公司提供(合格證號: 2010002609112),適應性飼養(yǎng)1周后建立小鼠哮喘模型.詳細建模方法見前期研究[20].模型成功標準具體如下: 末次激發(fā) 24h后(第 28d),以小鼠出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、腹肌痙攣等陽性反應作為一般觀察標準; 隨機抽取3只小鼠麻醉處死,摘取左肺于4%多聚甲醛溶液中固定用于病理染色,以光鏡下觀察到彌漫性細小支氣管和血管周圍炎癥細胞浸潤或支氣管上皮杯狀細胞增生、平滑肌增厚等病理改變作為組織病理學標準[23].

1.2 實驗分組及暴露

哮喘模型建立成功后,將32只哮喘小鼠隨機分為 4組(每組 8只),分別是對照組、低溫組、PM2.5組和聯(lián)合暴露組.將小鼠飼養(yǎng)于氣象環(huán)境模擬箱中,使用“上海市氣象環(huán)境動物暴露系統(tǒng)”(專利號201510453600.8)[24]對哮喘小鼠進行PM2.5暴露染毒實驗.具體暴露條件如下: 對照組和 PM2.5組的環(huán)境溫度為21～23℃,低溫組和聯(lián)合暴露組的環(huán)境溫度為2～4℃,PM2.5組和聯(lián)合暴露組中有 PM2.5染毒步驟,基于本文前期研究選擇暴露濃度為 400μg/m3[22].在此濃度下,PM2.5會對哮喘小鼠產(chǎn)生不利影響.暴露共持續(xù)4周,平均每天8h.所有實驗方案均經(jīng)上海市氣象局動物實驗倫理委員會批準.

1.3 標本制備

支氣管肺泡灌洗液(BALF)收集于末次暴露48h后,麻醉處死小鼠.仰臥位固定,無菌條件下分離氣管,結扎左主支氣管后,剪開右主支氣管插入氣管導管并固定,PBS緩沖液灌洗3次,1mL/次,收集的BALF于4℃,1500g離心10min,PBS重懸細胞沉淀并涂片,進行細胞分類計數(shù).

1.4 組織病理學檢查

取左肺組織用 4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋,4μm 切片,二甲苯脫蠟,梯度酒精水化,蒸餾水沖洗10min,蘇木素-伊紅(HE)染色后,酒精脫水、透明、封片.光鏡下觀察炎癥細胞浸潤及肺組織結構的改變.

1.5 炎性因子及氧化損傷指標

按照試劑盒(Minneapolis,USA)說明書,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測BALF中白介素(IL)4、IL-6和 IL-13濃度.嚴格按照相應的試劑盒(Sigma,USA)說明書操作,測定BALF中氧化損傷指標:過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平.

1.6 實時定量PCR檢測

Trizol法提取細胞總 RNA,使用逆轉錄試劑盒合成c RNA,進行實時定量PCR檢測.具體基因引物序列交由上海鈺森生物公司設計合成.PCR反應體系為 20μL,反應條件為:95℃預變性 30s,95℃變性5s,60℃退火 34s,72℃延伸 30s,共 40個周期.以β-actin 為內參,采用 2-△△Ct法計算相對水平.每個樣本有3個重復對照.

1.7 Th17/Treg細胞流式細胞術檢測

取小塊肺組織(約0.5cm2),用PBS沖洗離心以去除紅細胞,采用研磨法制備單細胞懸液并稀釋,流式細胞儀(BD Accuri C6plus)測定組織中 Th17、Treg細胞計數(shù)變化.Flow Jo 10用于進一步的圖像處理和數(shù)據(jù)分析.

1.8 數(shù)據(jù)分析

用Origin lab 2019繪圖,SPSS 25.0進行統(tǒng)計分析.采用單因素方差分析不同處理組內各指標水平差異,若各組間方差齊,則采用LSD-t法進行兩兩比較,對不服從正態(tài)分布的多組間中位數(shù)比較采用 Kruskal-Wallis H檢驗,通過析因設計方差分析測定低溫刺激和PM2.5暴露的交互作用.數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示,P值小于0.05被認為差異存在統(tǒng)計學意義.

2 結果分析

2.1 肺組織病理檢查

HE染色顯示,4組小鼠均有不同程度的肺部病理改變,即彌漫性細小支氣管和血管周圍炎癥細胞浸潤,但組間差異不太明顯.相比其他3組,聯(lián)合暴露組小鼠支氣管、肺泡內及血管周圍可見較顯著炎癥細胞浸潤現(xiàn)象,見圖1.

圖1 HE染色顯示支氣管內炎癥細胞浸潤(200×)Fig.1 HE staining showed infiltration of inflammatory cells in bronchus(200×)

2.2 細胞分類計數(shù)

圖2表明,聯(lián)合暴露組中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞計數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05),并且與低溫組相比,聯(lián)合暴露組小鼠的嗜酸性粒細胞數(shù)量顯著較高(P<0.05),但低溫刺激和 PM2.5暴露對其影響的交互作用不顯著.

圖2 分類炎癥細胞水平Fig.2 Classified inflammatory cell levels

2.3 炎癥因子

圖3顯示,聯(lián)合暴露組中IL-4、IL-6、IL-13、IL-17和TGF-β均顯著高于對照組(P<0.05),同時也顯著高于低溫組和 PM2.5組(P<0.05).其中低溫組和PM2.5組中IL-6、IL-17和TGF-β的相對水平較高,均顯著高于對照組(P<0.05).方差分析結果顯示,低溫和PM2.5之間的交互作用對IL-4、IL-13及IL-17的相對水平有影響(P<0.05),提示在低溫刺激下,PM2.5對哮喘小鼠炎癥因子的影響更大,可能會引起更為明顯的炎癥反應.

圖3 炎癥因子的相對水平Fig.3 Relative levels of inflammatory factors

2.4 氧化應激指標

如圖4所示,低溫組和PM2.5組CAT顯著低于對照組(P<0.05),而GSH、SOD和MDA與對照組間差異不顯著.在聯(lián)合暴露組中上述 4個指標均與對照組有顯著性差異,CAT、GSH和SOD明顯低于對照組,MDA 明顯高于對照組(P<0.05),提示聯(lián)合暴露組小鼠氧化損傷較對照組明顯.并且,相比 PM2.5組,聯(lián)合暴露組中CAT、SOD明顯較低(P<0.05),MDA明顯較高(P<0.05).方差分析結果顯示,低溫和 PM2.5之間的交互作用對MDA的相對水平有影響(P<0.05),表明低溫刺激和 PM2.5的共同暴露可能會引起更嚴重的組織氧化損傷.

圖4 CAT、GSH、SOD和MDA相對水平Fig.4 Relative levels of CAT, GSH, SOD and MDA

2.5 Th17、Treg細胞比例及其轉錄因子

RORγt和Foxp3是Th17和Treg細胞的重要轉錄因子,可代表性反映Th17細胞與Treg細胞的平衡狀況.圖5～圖6顯示,聯(lián)合暴露組哮喘小鼠肺組織內Th17細胞比例最高,Treg細胞比例最低,并且轉錄因子 RORγt mRNA表達量顯著高于相應單純暴露的低溫組和 PM2.5組(P<0.05).方差分析結果顯示,低溫和PM2.5之間的交互作用對RORγt的mRNA相對水平有影響(P<0.05).在 Foxp3的結果中,PM2.5組和聯(lián)合暴露組明顯低于對照組(P<0.05),盡管方差分析顯示無統(tǒng)計學意義.上述結果提示較低溫度刺激可能會增加PM2.5暴露對RORγt表達量的影響,并通過推動PM2.5暴露引起的Th17細胞比例增加對哮喘產(chǎn)生影響.

圖5 RORγt、Foxp3的mRNA相對水平Fig.5 Relative mRNA levels of RORγt and Foxp3

圖6 Th17細胞和Treg細胞的比例情況Fig.6 Proportion of Th17 cells and Treg cells

3 討論

低溫刺激和大氣顆粒物 PM2.5都是哮喘的危險因素[3,16].本文通過對哮喘模型小鼠進行低溫刺激和PM2.5聯(lián)合暴露實驗,結果顯示低溫聯(lián)合 PM2.5暴露可以上調炎癥細胞因子和氧化損傷水平,兩者在加劇肺部炎癥及氧化損傷方面具有交互作用.大量流行病學研究表明,低溫時 PM2.5的歸因危險度增加,且 PM2.5與氣溫對呼吸系統(tǒng)死亡率的影響有交互作用[25-28].研究認為這種作用可能與低溫刺激和 PM2.5聯(lián)合暴露促進呼吸系統(tǒng)炎癥因子等指標的增加有關[29-31].與上述的研究結論類似,本研究結果顯示低溫聯(lián)合PM2.5暴露可促進肺部炎癥反應和氧化損傷,加重哮喘模型小鼠氣道炎癥及肺組織病變,提示低溫刺激對PM2.5介導的炎癥反應有重要貢獻.

Th17細胞和Treg細胞是一對功能上相互抑制的免疫細胞群,與機體炎癥反應的發(fā)生密切相關[6].在免疫細胞分化過程中,Treg細胞可經(jīng)由TGF-β誘導產(chǎn)生,然而當IL-6和TGF-β共同存在時,Treg細胞分化路徑因受到抑制而分化成為Th17細胞[32].有研究發(fā)現(xiàn),在大氣顆粒物引起機體毒性損傷的過程中,肺組織內 Th17細胞表型有明顯增加,存在 Th17/Treg細胞失衡情況[33],并且Th17細胞極化使IL-17大量分泌,又進一步加劇了 PM2.5導致的炎癥反應.這與本研究的結果一致,即聯(lián)合暴露對 IL-17、RORγt和Foxp3的mRNA表達量影響顯著,且低溫和PM2.5對RORγt改變存在交互效應,這表明低溫刺激在 PM2.5誘導推動 Th17/Treg比例失調的過程中起到了重要作用.結合之前IL-6和TGF-β在聯(lián)合暴露組中高表達的實驗結果,推測持續(xù)的低溫刺激可以高效地促進激活 RORγt /Foxp3途徑,推動 PM2.5介導的Th17/Treg細胞失衡,在此過程中機體分泌的炎癥細胞因子IL-6與內源性TGF-β共同發(fā)揮作用,在一定程度上抑制了 Treg細胞的增殖分化,更加劇了肺部 Th17/Treg免疫失衡狀態(tài),從而形成以 Th17細胞極化為主導的促炎趨勢,進而加劇了哮喘氣道炎癥.然而目前低溫聯(lián)合 PM2.5調控 Th17細胞分化通路的具體機制尚不明確,仍有待進一步挖掘.

4 結論

4.1 低溫聯(lián)合PM2.5暴露后,可顯著影響小鼠BALF中炎癥因子和氧化應激指標的相對水平,在一定程度上加重了哮喘小鼠的肺部炎癥和氧化損傷.

4.2 聯(lián)合暴露激活了RORγt /Foxp3調控通路,進而上調Th17細胞比例,增加IL-17分泌,從而加重哮喘小鼠的氣道炎癥.